CN102281900A - 灭活的全病毒疫苗的稳定赋形剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种疫苗组合物，它含有：a)灭活全病毒，以及b)稳定赋形剂，它含有：I缓冲液,ii必需和非必需氨基酸的混合物，iii二糖，iv多元醇,v螯合剂,vi脲或脲衍生物，以及vii非离子表面活性剂。

Description

灭活的全病毒疫苗的稳定赋形剂
本发明涉及一种疫苗组合物，它含有这种灭活全病毒和使该疫苗组合物稳定的赋形剂，该赋形剂组合物含有缓冲液、必需和非必需的氨基酸混合物、二糖、多元醇、螯合剂、脲或脲衍生物和非离子型表面活性剂。本发明还涉及这种疫苗组合物的制备方法以及如此赋形剂组合物。
在病毒疫苗的范围内，通常将病毒疫苗分成3种类型：活病毒疫苗、灭活全病毒疫苗和亚单位病毒疫苗。这3种类型疫苗通过它们是固有的和它们为其保存而规定使用的赋形剂组合物的一些特征进行区分。一般而言，含有受限量病毒抗原的这些亚单位疫苗比灭活的全病毒疫苗更容易保存，因为即使它们被杀死也都试图保持其结构完整性，或比这些活病毒疫苗更容易保存，因为它们也试图保持其病毒感染能力。对于每类病毒疫苗已制备出合适赋形剂。对于这些减毒病毒的病毒疫苗，根据待保存减毒病毒制备物已制备出不同的稳定赋形剂。JP 57007423描述了一种用于使麻疹病毒的减毒株稳定的以在磷酸盐缓冲液中的二糖和多元醇为基的赋形剂。EP 065905描述了含有在磷酸盐缓冲液中的一种或多种选自十一氨基酸、乳糖和山梨糖醇的氨基酸的用于使登革热病毒减毒株稳定的赋形剂。最后，EP 0869814描述一种疫苗组合物，它含有一种水痘病毒减毒株和稳定剂，该稳定剂含有山梨糖醇、甘露醇、蔗糖、葡聚糖、氨基酸的混合物、脲和EDTA。
在灭活病毒疫苗的领域内，即时给药的疫苗组合物往往含有动物来源蛋白，例如牛或人的白蛋白、明胶或酪蛋白。这些蛋白已知用于改善这些疫苗，尤其含有难以保存病毒的疫苗的保存(稳定作用)。含有灭活狂犬病病毒的疫苗组合物便是这种情况。Frazatti-Gallina及其同事在《Vaccine》(2004)，第23卷，第511-517页中强调蛋白质在稳定抗狂犬病疫苗中的重要作用，因为该赋形剂含有白蛋白。
然而，在这些疫苗中存在蛋白，除了如果蛋白来源没有严格加以控制而可能存在传播疾病潜在危险外，还可存在一种努力避免的潜在过敏风险，尤其当这些疫苗含有血清蛋白，例如白蛋白或白蛋白衍生物时。
因此，需要寻找一种其组成不含有蛋白的稳定赋形剂以使这些灭活全病毒的病毒疫苗稳定，特别地以使含有难以保存的灭活全病毒(例如狂犬病病毒)的疫苗稳定。
还需要寻找一种也适合于使低剂量灭活病毒疫苗稳定的稳定赋形剂，即在有效剂量疫苗中它含有少量的总蛋白。对于含有非常少的残留蛋白杂质的非常纯的疫苗而言，这种要求是更重要的。这些残留蛋白杂质，即使它们有潜在的过敏性风险，但在一定程度上可有助于使低剂量灭活病毒疫苗稳定。它们可阻止能使疫苗效力降低的病毒聚集、结构退化或吸附现象发生。
为此，本发明的目的是一种疫苗组合物，它含有：
a) 灭活全病毒制备物，以及
b) 稳定赋形剂，它含有：
i 缓冲液，
ii 必需和非必需氨基酸的混合物，
iii 二糖，
iv 多元醇，
v 螯合剂，
vi 脲或脲衍生物，以及
vii 非离子型表面活性剂。
优选地，该灭活全病毒是狂犬病病毒。
根据本发明的一个方面，该疫苗组合物也没有任何血清蛋白。
根据另一个方面，该疫苗组合物还没有任何动物来源的外源蛋白，优选地没有任何动物来源的外源产品。
根据另一个方面，这些病毒蛋白是在该疫苗组合物中存在总蛋白的至少70%。
根据另一个方面，在该疫苗组合物中的总蛋白浓度≤100µg/ml，优选地≤80µg/ml。
在一个特别方面中，在一个有效剂量的疫苗组合物中含有的总蛋白量≤100µg。
在另一个特别方面中，在一个有效剂量的疫苗组合物中含有的总蛋白的量是1-50µg。
在本发明的另一个方面中，该稳定赋形剂没有任何蛋白，或任何蛋白和任何肽，或优选地没有任何蛋白、任何肽和任何寡肽。
根据另一个方面，在该疫苗组合物中含有的必需和非必需氨基酸的混合物至少含有精氨酸或精氨酸盐和谷氨酸或谷氨酸盐。
根据一个特别方面，在一个有效剂量的疫苗组合物中含有的必需和非必需氨基酸的量是0.5-2.5mg。
根据另一个方面，在赋形剂中含有的二糖是麦芽糖。
根据另一个方面，在该疫苗组合物中含有的多元醇是山梨糖醇。
根据一个特别方面，在一个有效剂量的疫苗组合物中含有的二糖和多元醇的量是10-50mg。
在另一个方面中，在该疫苗组合物中含有的鳌合剂是EDTA或EDTA盐。
根据一个特别方面，在一个有效剂量的疫苗组合物中含有的鳌合剂的量是0.01-0.1mg。
根据另一个特别方面，在一个有效剂量的疫苗组合物中含有的脲或脲衍生物的量是0.3-1.5mg。
在另一个方面中，在该疫苗组合物中含有的非离子型表面活性剂是泊洛沙姆(poloxamère)。
优选地，该泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
根据一个特别方面，在一个有效剂量的疫苗组合物中含有的非离子型表面活性剂量是0.001-0.5mg。
根据另一个方面，该疫苗组合物的pH是7.0-10.0，优选地7.0-9.0。
在另一个方面中，在该疫苗组合物中含有的缓冲液是磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或它们的混合物。
在一个特别方面中，该缓冲液是其摩尔浓度为10-100mM的磷酸盐缓冲液。
本发明还涉及一种疫苗组合物制备方法，该组合物含有纯化并灭活的全病毒制备物，其中：
a) 通过收获被该病毒感染的细胞培养物的上清液制备全病毒制备物，
b) 对该全病毒制备物进行纯化并灭活，或者对该全病毒制备物进行纯化并灭活，以及
c) 将该纯化并灭活的全病毒制备物稀释在稳定赋形剂中，该稳定赋形剂组成含有：
i 缓冲液，
ii 必需和非必需氨基酸的混合物，
iii 二糖，
iv 多元醇，
v 螯合剂，
vi 脲或脲衍生物，以及
vii 非离子型表面活性剂。
根据一种优选方式，在不加入动物来源的外源产品时实施本发明的方法。
在本发明方法的一种优选实施方式中，这种病毒是狂犬病病毒。
在另一个方面中，本发明的方法包括，在纯化并灭活的全病毒制备物稀释后，将如此得到的疫苗组合物分配在包装装置中的步骤，以及任选地该疫苗组合物的冻干步骤。
本发明还涉及一种疫苗组合物，它含有根据本发明方法一个优选实施方式得到的冻干剂型纯化并灭活的全病毒制备物。
本发明还涉及一种用于灭活的全病毒疫苗的稳定赋形剂，其组成含有：
i 缓冲液，
ii 必需和非必需氨基酸的混合物，
iii 二糖，
iv 多元醇，
v 螯合剂，
vi 脲或脲衍生物，以及
vii 非离子型表面活性剂。
优选地，该稳定赋形剂组合物也没有任何蛋白，或任何蛋白和任何肽，或优选地没有任何蛋白、任何肽和任何寡肽。
特别优选地，该稳定赋形剂的组合物也没有任何动物来源产品。
本发明的详细描述
本发明疫苗组合物含有该灭活全病毒(或灭活全病毒制备物)和稳定赋形剂，其赋形剂组成含有缓冲液、必需和非必需氨基酸的混合物、二糖、多元醇、螯合剂、脲或脲衍生物和非离子型表面活性剂。该赋形剂组合物有利地代替在其组成中含有蛋白的现有技术的赋形剂。特别有益地，它使难以保存的这些疫苗组合物稳定，非常特别地，使含有该狂犬病病毒作为灭活全病毒的这些疫苗组合物稳定，而它不必添加蛋白。
本发明的疫苗组合物在液体剂型、冷冻液体剂型或冻干剂型下都是稳定的，这提供了非常大的应用灵活性。
本发明的稳定赋形剂保持该疫苗组合物为冷冻、液体或冻干剂型的时间内的生物活性。一般而言，冷冻疫苗组合物保存温度≤-35℃；液体剂型组合物保存温度为+2℃-+8℃，而冻干剂型组合物保存温度为约+5℃。有利地，在不利条件下保存的疫苗组合物，如在+37℃保存的液体剂型疫苗组合物，或让这些疫苗组合物受到一系列解冻和再冷冻时，还保持在疫苗组合物中的病毒生物活性和物理完整性。
通过测定随着时间推移的该病毒组成免疫原的量(其对于诱发抗病毒的保护免疫性是重要的)和/或通过检测其在官方认可的动物模型中试样测试中的效力来评价在该疫苗组合物中的病毒生物活性。在含有灭活狂犬病病毒的疫苗组合物的情况下，通过测定随着时间推移的(或在连续解冻过程中)病毒滴度(其是以呈未变性形态糖蛋白G浓度的测定结果为基础进行估算)和/或通过采用NIH正式测试检测该疫苗组合物的效力来评价该疫苗组合物的稳定性。为了估算糖蛋白G含量，可以采用夹心类型的ELISA法，该方法识别至少一个，优选地两个糖蛋白G的构象表位，如实施例1所描述的那样。在实施识别糖蛋白G的两个构象表位的ELISA法时，通常使用中和该狂犬病病毒的抗体作为包被抗体，该狂犬病病毒识别位于糖蛋白G抗原位点II的构象表位(《Journal of Clinical investigation》(1989)，第84卷，第971-975页)，使用识别位于蛋白G抗原位点III的构象表位的中和抗体作为揭示抗体(《Biologicals》(2003)，第31卷，第9-16页)。这些结果用国际单位表示，因为人们通常采用对照NIBSC国际参照进行校正的标准作为参照。还可能采用被认为是对ELISA法有利替代的BIAcore技术，该技术基于应用用于定量病毒滴度的表面等离子体共振。
本发明的稳定赋形剂还通过保持病毒粒子的物理完整性而起作用。它特别阻止病毒粒子随着时间推移而生成聚集体和/或其结构降解。这可以使用检测这些聚集体的仪器(例如zetasizer Nano ZS(Malvern instrument))加以控制，并且可以建立在该疫苗组合物中病毒粒子尺寸的分布曲线。
这种病毒或病毒制备物呈全病毒粒子形式，其一般采用福尔马林、甲醛或β丙酸内酯化学处理进行灭活。也可以采用如在WO 2005/093049中描述的其它灭活方法。主要所使用的灭活全病毒制备物含有包膜病毒，因为它们往往更难以保存，并且需要使用特定赋形剂组合物以保证其保存。特别地涉及日本脑炎灭活全病毒制备物。特别优选地，这些灭活全病毒制备物含有该狂犬病病毒。
这些病毒制备物来自一般呈被该病毒感染的细胞培养物的上清液的提取物形式的收获物。可以使用含有动物来源血清的传统培养基以生产细胞原液，并感染这些细胞。有利地，用于细胞培养与感染的这些培养基不含有血清蛋白，也没有动物来源产品。在这些培养基中任选存在的蛋白一般是浓度非常低的低分子量蛋白(≤10KD)或更确定地说肽，这因此降低过敏风险。例如以商品名VP SFM(InVitrogen)、Opti ProTM serum-free(InVitrogen)、Episerf (InVitrogen)、Ex-cell® MDCK(Sigma-Aldrich)、Ex-CellTM Vero(SAFC biosciences)、MP-BHK® serum free(MP Biomedicals)、SFC-10 BHK express serum free(Promo cell)、SFC-20 BHK express protein free(Promo cell)、HyQ PF Vero(Hyclone Réf. SH30352.02)、Hyclone SFM4 Megavir销售的培养基，MDSS2培养基(Axcell biotechnology)、改性DMEM Iscove培养基(Hyclone)、Ham(Ham-F10，Ham-F12)营养培养基、leibovitz L-15培养基(Hyclone)便是这种情况。例如，这些狂犬病病毒收获物是由已生产的Vero细胞原液得到的，然后使用病毒感染培养基进行感染，这些培养基优选地没有任何血清蛋白、任何动物来源蛋白，甚至没有任何动物来源产品，例如VP SFM培养基。
有利地，在本发明的疫苗组合物中含有的灭活的全病毒制备物是非常纯的。通常地，先纯化后灭活，或者相反地先灭活然后纯化来自一些收获物的病毒。在不使用血清蛋白、不使用动物来源的外源蛋白，甚至不使用动物来源的外源产品情况下，实施该病毒的任何生产与纯化步骤时，有利地本发明疫苗组合物没有任何血清蛋白，以便最大程度地降低过敏性风险，也没有任何动物来源的外源蛋白，甚至没有任何动物来源产品，以便最大程度地降低疾病传播风险。关于“动物来源的蛋白或产品”，应该理解是其生产方法包括至少一个其中使用来自动物或人的材料的步骤的蛋白或产品。关于“外源蛋白或产品”，应该理解是在病毒生产和/或纯化方法的一个步骤中引入的蛋白或产品。例如，在该培养基组合物中任选地含有的蛋白或产品，在病毒生产和/或纯化步骤时使用的酶(如胰蛋白酶或benzonase)都是外源蛋白或产品。在其生产方法包括至少一个使用来自动物或人的材料的步骤时，这些外源蛋白或产品是动物来源的。当这些外源蛋白或产品采用其它方法(例如使用植物材料，采用化学合成或采用基因重组)使用一些酵母、细菌或植物进行制备时，这些外源蛋白或产品不是动物来源的。来自细胞(由这些细胞生产出这些病毒以得到本发明疫苗组合物)的蛋白或产品相反地是内源性蛋白或产品，因为它们与这些病毒同时产生(或被盐析出)。
在本发明的范围内，可以有利地实施具有特别好性能的纯化方法，这些方法引起得到非常纯的病毒制备物。作为实例列举病毒纯化方法，它包括阴离子交换色谱法，接着阳离子交换色谱法，再以WO 97/06243描述的通过金属螯合亲合的色谱法结束。为了纯化与灭活由感染细胞培养物的上清液得到的狂犬病病毒，一种选择方法是使用于2009年4月14日在法国提出的号为0952310专利申请描述的方法，它包括在含有在其上已接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯基体的担体上的阳离子交换色谱法步骤、用benzonase处理的步骤、蔗糖梯度超离心步骤和使用β-丙酸内酯的灭活步骤。所得到灭活全狂犬病病毒制备物是特别纯的，但更难以保存(稳定)，因为它的残留蛋白杂质非常少。在该疫苗制备物中病毒量少，这种困难就更大。
借助该赋形剂组合物，本发明疫苗组合物依然是稳定的，甚至在总蛋白浓度≤100µg/ml，≤80µg/ml，≤50µg/ml，甚至≤20µg/ml的情况下也如此。一般而言，病毒蛋白占在本发明疫苗组合物中存在的总蛋白的至少70%，优选地总蛋白的至少80%，特别优选地总蛋白的至少90%。在一个有效的疫苗剂量中，其通常具有≤100µg或≤50µg，甚至≤20µg的总蛋白量。作为指出，残留的DNA量为每有效疫苗剂量<100pg，优选地<50pg。关于“有效疫苗剂量(或有效剂量的疫苗组合物)”，应该理解是在为了在第一次疫苗接种或加强疫苗接种范围内推荐的免疫方法和免疫方案给药后诱发人或动物保护性免疫所必需的剂量中含有的灭活病毒的量。在抗狂犬病病毒的疫苗接种的情况下，借助OMS认可的正式测试方法，NIH测试方法(在OMS的狂犬病专著(WHO Technical Series Report 941-2007年1月)中描述的)测定了抗狂犬病疫苗的效力。灭活的抗狂犬病疫苗剂量在根据这种测试其含有至少2.5UI时是有效的。根据通常推荐的这些接种或血清-接种方案，通过人肌内给药这个剂量诱发抗狂犬病的保护性免疫发展。
这些“总蛋白”相应于在该疫苗组合物中存在的所有的蛋白。它们是用这些病毒蛋白、纯化时未被除去的残留蛋白，如细胞蛋白、细胞培养和病毒感染培养基的蛋白以及在该纯化方法中任选地加入的蛋白(例如在像上述狂犬病病毒的纯化方法的情况下的benzonase)表示的。一般而言，采用Bradford方法对总蛋白进行量化。为了量化病毒蛋白在这些总蛋白中的比例，在变性与还原的条件下对该疫苗组合物试样进行在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳，接着用考马斯蓝的揭示和电泳谱光密度分析。在含有灭活全狂犬病病毒的疫苗组合物的情况下，用包膜糖蛋白G、核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M和依赖RNA的RNA聚合酶L表示的病毒蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳上是很容易鉴定的。在本发明疫苗组合物的有效剂量中含有的总蛋白量一般是1µg-50µg，优选地2µg-20µg。特别优选地总蛋白的至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，甚至至少90%是病毒蛋白。本发明的赋形剂是特别有利的，因为它能使难以保存的疫苗组合物稳定，例如含有灭活全狂犬病病毒的疫苗组合物，并且在所述组合物中发现在有效疫苗剂中：
-占总蛋白至少70%的病毒蛋白量，和/或
-100µg以下的总蛋白，往往总蛋白的量是1µg-50µg，优选地2µg-20µg。
本发明的赋形剂组合物优选地没有任何蛋白、任何肽，甚至任何寡肽，并且一般而言不含有动物来源产品以最大程度地降低可与其应用相关的生物和/或过敏安全问题。
在本发明的范围内，术语“该稳定赋形剂没有任何蛋白”应该理解是一种其组成没有任何生物大分子的稳定赋形剂，该生物大分子含有通过肽键将彼此连接起来的50个以上氨基酸的链。术语“该稳定赋形剂没有任何蛋白和任何肽”应该理解是其组成没有任何生物大分子的稳定赋形剂，该生物大分子含有通过肽键将彼此连接起来的20个以上氨基酸的链。术语“该稳定赋形剂没有任何蛋白、任何肽和任何寡肽”应该理解是其组成没有任何生物分子的稳定赋形剂，该生物分子含有通过一个或多个肽键将彼此连接起来的氨基酸。例如含有通过唯一肽键将彼此连接起来的两个氨基酸的二肽不被包括在没有任何蛋白、任何肽和任何寡肽的稳定赋形剂组合物之外，但可以构成没有任何蛋白和任何肽的稳定赋形剂组合物的一部分。
构成该赋形剂组合物一部分的氨基酸混合物含有至少一种在全部所必需的氨基酸中的必需氨基酸(全部所必需的氨基酸用胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸表示)和至少一种在全部非必需氨基酸的非必需氨基酸(全部非必需氨基酸用天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸表示)。这些具有酸官能的氨基酸可以呈酸或盐形式。对于这些基础氨基酸也同样如此。
优选地，本发明赋形剂至少含有精氨酸或精氨酸盐，例如精氨酸和谷氨酸的盐酸盐，或谷氨酸盐，例如谷氨酸钠。最后，该氨基酸混合物优选地含有1-12种必需氨基酸，其中至少有精氨酸或其盐，1-8种非必需氨基酸，其中至少有谷氨酸或其盐。在该疫苗组合物中氨基酸总浓度一般≤20g/l，往往是2g/l-10g/l。在有效剂量的本发明疫苗组合物中，这表示必需和非必需氨基酸总量≤5mg，优选地其量为0.5-2.5mg，特别优选地0.8-1.8mg。精氨酸(呈盐酸盐形式)的量与在赋形剂中含有的氨基酸总量之比一般高于0.5，而谷氨酸(呈谷氨酸钠形式)的量与在赋形剂中含有的氨基酸总量之比小于0.5。
本发明赋形剂还含有二糖。由动物来源原料(如乳)得到的二糖除外。作为适合于本发明目的的二糖，可以列举蔗糖、麦芽糖或海藻糖，但优选地使用单一麦芽糖或与其它二糖(如蔗糖)合用的麦芽糖。在该赋形剂组合物中还包括的多元醇是非动物来源的。主要为六醇，例如山梨糖醇和/或甘露醇。优选地使用山梨糖醇，因为甘露醇具有在本发明疫苗组合物呈冻干剂型时会结晶的缺陷。在该疫苗组合物中二糖和多元醇总浓度一般是30g/l-100g/l。优选地，本发明的赋形剂含有麦芽糖和山梨糖醇。在一个有效剂量的疫苗组合物中，这通常相应于10-50mg的量，优选地相应于20-25mg的量。麦芽糖的量一般是麦芽糖和山梨糖醇总量的至少70%。
鳌合剂也是本发明赋形剂的组分之一。其主要为EDTA(乙二胺四乙酸)或其盐(Na+、K+等)。在该疫苗组合物中EDTA或EDTA盐浓度一般是0.02-0.5g/l，优选地0.02-0.2g/l。在一个有效剂量的疫苗组合物中，这通常相应于0.01-0.1mg，优选地0.01-0.05mg，特别优选地0.01-0.04mg EDTA或EDTA盐的量。
脲或脲衍生物，例如烯丙基脲、乙酰胺、氨基甲酸甲酯或氨基甲酸丁酯也构成该赋形剂组合物的一部分。优选地，这种疫苗组合物含有浓度一般1g-10g/l，优选地浓度1g-5g/l的脲。在一个有效剂量的疫苗组合物中，这通常相应于0.3-3mg，优选地0.3-1.5mg，特别优选地0.4-1.2mg脲的量。
本发明的赋形剂还含有有助于使该疫苗组合物稳定的非离子型表面活性剂。不受理论的约束，它有助于保持该病毒的生物活性，还通过避免生成聚集体或病毒结构降解有助于保持病毒粒子的物理完整性。还可避免该病毒吸附在包装容器壁上，特别地当这些壁用玻璃或塑料制成时尤其如此。适合于本发明目的的非离子型表面活性剂是用非动物来源的原料得到的，并且在药物学方面与通过非经肠给药产品是相容的。作为特别适合于本发明目的的非离子型表面活性剂类，可以列举泊洛沙姆，它们是环氧乙烷与环氧丙烷的“嵌段共聚物”，其化学式是HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH，其中a表示环氧乙烷单元数，b表示环氧丙烷单元数。这些泊洛沙姆的分子量一般是1000-16000道尔顿。具有特别好处的泊洛沙姆的分子量是5000-15500道尔顿。这些泊洛沙姆尤其地是以商品名Pluronic®销售的，其中pluronic® F68，即泊洛沙姆188，它表示在室温下呈固态形式的泊洛沙姆，其聚氧丙烯的分子量约1750道尔顿，而其聚氧乙烯部分占该分子总重量的约80%。在这些泊洛沙姆中，特别推荐泊洛沙姆188(pluronic®F68)。任选地，可以使用脱水山梨糖醇酯，特别地以商品名Tween®销售的脱水山梨糖醇聚氧乙烯酯，如Tween® 20(脱水山梨糖醇聚氧乙烯(20)单月桂酸酯，即polysorbate 20)，或Tween®80(脱水山梨糖醇聚氧乙烯(20)单油酸酯，即polysorbate 80)。适合本发明目的的非离子型表面活性剂非常低的浓度进行使用，这样保持灭活病毒粒子的结构，其应该仍然与尺寸与活病毒的相近。非常高浓度时，这种表面活性剂能够离解或改变这些病毒粒子的结构，尤其包膜病毒的结构，这样可影响该疫苗组合物的免疫原性。当pluronic® F68用作表面活性剂时，在该疫苗组合物中的总浓度≤1g/l，一般是0.005g/l-1g/l，特别优选地0.01g/l-0.1g/l。在这个浓度范围内，泊洛沙姆188对该免疫体系不发挥辅助作用。在一个有效剂量的疫苗组合物中，这通常相应于0.001mg-0.5mg，优选地0.003-0.3mg的量。非常优选地，该疫苗组合物含有泊洛沙姆188或任选地泊洛沙姆188和polysorbate 20的混合物。
选择本发明赋形剂缓冲液使得该疫苗组合物的pH是7.0-10.0，优选地7.0-9.0，特别优选地7.3-8.3。正是在这个pH范围内，灭活病毒粒子的物理热稳定性，特别是狂犬病病毒粒子的物理热稳定性是最大的。这些对相图的研究表明，在pH为7.3-8.3时，必须将该狂犬病病毒制备物加热到至少60℃的温度才观察到其狂犬病病毒粒子聚集，而在pH<6.0时在室温下观察到严重的聚集现象。这种缓冲液通常是磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或它们的混合物。它们的浓度一般是10-100mM。优选地，该赋形剂组合物含有磷酸盐缓冲液，其摩尔浓度通常是10-100mM，或混合物形式的磷酸盐缓冲液与Tris缓冲液。
本发明特别优选的疫苗组合物含有：
灭活的全狂犬病病毒制备物，和稳定赋形剂，它含有：
磷酸盐缓冲液；
必需和非必需氨基酸的混合物，它至少含有精氨酸或精氨酸盐与谷氨酸或谷氨酸盐；
麦芽糖；
山梨糖醇；
EDTA或EDTA盐；
脲；
泊洛沙姆188；
该疫苗组合物的pH是7.3-8.3。
任选地，可以把Tween 20作为附加的非离子型表面活性剂加到这种疫苗组合物中。这种疫苗组合物有利地没有任何血清蛋白和任何动物来源的外源产品并一般含有非常纯的狂犬病病毒制备物。在该疫苗组合物中泊洛沙姆188的浓度<1g/l，非常优选地0.01g/l-0.1g/l。磷酸盐缓冲液的摩尔浓度一般是10-100mM。精氨酸和谷氨酸或它们各自的盐是该氨基酸混合物中的绝大多数组分，因为它们一般按照重量计是必需和非必需氨基酸总量的至少2/3。这种必需和非必需氨基酸的混合物的浓度通常是2-10g/l，麦芽糖和山梨糖醇的总浓度通常是50-100g/l，EDTA或EDTA盐的浓度通常是0.02-0.2g/l，脲的总浓度通常是1-5g/l。在该疫苗组合物中总蛋白浓度通常是5-50µg/ml。在有效剂量的抗狂犬病疫苗中，其通常表示必需和非必需氨基酸的量为0.5mg-2.5mg，麦芽糖和山梨糖醇的量是10-50mg，EDTA或EDTA盐量是0.01mg-0.1mg，脲的量是0.3-1.5mg，泊洛沙姆188的量是0.001-0.5mg，以及总蛋白的量是2-20µg。
本发明疫苗组合物的制备方法，除病毒制备物生产、纯化和灭活这些步骤外，还包括往该纯化并灭活的全病毒制备物中加入稳定赋形剂的步骤，以及把如此得到的组合物分配在包装装置中的步骤。一般而言，在把该疫苗组合物分配到这些包装装置中之前，将该制备物稀释在本发明的稳定赋形剂中。
本发明疫苗组合物可以以散装剂型(sous la forme de vrac)存在：在这种情况下，一旦分配，该灭活全病毒浓度比在该疫苗组合物中存在的浓度高，但该赋形剂组合物是同一组合物。这种散装剂型一般保持在<-35℃的温度下冷冻。这时通过将这种散装剂型解冻，然后将其稀释在该稳定赋形剂中以达到期望的病毒浓度，进行该疫苗组合物的分配步骤。这时得到最后散装剂型产品，它再分配到包装装置中。为了确保该疫苗组合物无菌，还可以在分配步骤之前加一个灭菌过滤步骤，例如使用0.2µm过滤膜的灭菌过滤步骤。
一般通过在实施纯化方法结束时得到的纯化并灭活病毒制备物在缓冲液中渗滤得到这种散装剂型，所述的缓冲液一般对应于该赋形剂的缓冲液。如果例如该赋形剂的缓冲液是50mM磷酸盐缓冲液，则使用50mM磷酸盐缓冲液作为渗滤缓冲液。如果期望提高病毒浓度，则渗滤步骤之前为超滤步骤。使用具有一般为5kDa-100kDa，优选地8kDa-50kDa，特别优选地约10kDa的低截留阈值的超滤膜，以便最大程度地将这种病毒保留在截留物中，并且除去对冻干方法可有负面影响的盐。然后，把含有病毒制备物的截留物与该稳定赋形剂混合，以得到散装剂型(vrac)，其组成相应于本发明的疫苗组成。还可以使用与稳定赋形剂具有同样组成的缓冲液作为渗滤缓冲液，以在一步中得到散装剂型。
含有灭活全狂犬病病毒的本发明疫苗组合物制备方法包括下述步骤：使用细胞培养和病毒感染的培养基(该培养基优选地没有任何血清蛋白和任何动物来源产品，例如像使用VP SFM培养基)，通过收获被病毒感染的Vero细胞培养物的上清液，生产全病毒制备物。特别地采用于2009年4月14日在法国申请的专利号为0952310的专利申请描述的方法纯化和灭活这种病毒，该方法包括在优选地含有基于在其上已接枝磺基异丁基基团的聚甲基丙烯酸酯的基体的担体上的阳离子交换色谱法步骤、用重组benzonase处理、蔗糖梯度超离心步骤与使用β-丙酸内酯的灭活步骤。得到的灭活全狂犬病病毒制备物是非常纯的，没有任何血清蛋白和任何动物来源的外源产品；残留DNA含量<100pg/ml，这些病毒蛋白是总蛋白的至少70%。然后根据在前段描述的模式制备散装剂型，它一般保存在<-35℃的温度下。再以期望病毒浓度把这种散装剂型稀释在本发明的赋形剂中，然后把它分配到这些包装装置中。在每个包装装置中通常加入0.1ml-1ml该疫苗组合物，以便这种组合物一旦分配便含有至少一个有效疫苗剂量。这些用于分配最后散装剂型产品的包装装置通常呈瓶(用玻璃或塑料制成的)或注射器形式，但也可以使用与接种操作相容的其它包装装置。
使用zétasizer Nano ZS仪器(Malvern Instrument)对含有这种纯化狂犬病病毒的本发明疫苗组合物进行的粒度分析(这种仪器测定基于光“准弹性”散射(动态光散射)的粒子的布朗运动)表明存在单一的100-300nm病毒粒子(其平均值约180nm)均匀群，它相应于野生狂犬病病毒的平均尺寸。在本发明疫苗组合物保存过程中未检测到聚集体，也未检测到病毒粒子尺寸分布曲线的变化。
这些液体剂型的疫苗组合物在温度2-8℃下在至少3个月期间，在23-27℃下在至少1个月期间是稳定的(参见实施例3)。它们为冷冻剂型时在≤-35℃温度下也可以保存至少12个月，优选地至少24个月。采用传统的冻干法时，也可以以冻干剂型保存这些疫苗组合物。本发明赋形剂组合物在冻干步骤期间不会造成病毒的明显损失。一种冻干方法是将该组合物冷冻到低于-40℃的温度下，然后将其产品干燥两次，第一次干燥在约-15℃温度与80微巴下进行，而第二次干燥在约+40℃温度与80微巴下进行。这些冻干疫苗剂量的残留水分含量≤3%，并且在温度2-8℃下稳定至少18个月(参见实施例3)。最后，如在本发明中描述的抗狂犬病疫苗组合物表现出与以商品名VeroraBTM销售的现有技术的疫苗组合物(其在一剂量疫苗中含有的总蛋白量是在一有效剂量的本发明疫苗组合物中可测总蛋白量(一般≤50µg)的至少100倍)同样的稳定性。另外，本发明的赋形剂组合物，有利地能够长久地保存液体或冷冻剂型的疫苗组合物，即使优选的保存剂型是冻干剂型。
这种疫苗组合物为液体剂型保存时，或如果它冷冻保存时在解冻后可直接给药于待接种疫苗的受试者。它为冻干剂型时，把这种冻干物即时溶于通常为盐溶液的稀释剂中，例如像低渗氯化钠溶液。这种稀释剂还可以含有非常低浓度的表面活性剂，它的化学结构在药物学方面与非经肠途径使用是相容的。它通常是Tween®20、Tween®80或pluronic®F68，以非常低的浓度使用它们以发挥辅助作用。在该稀释剂中的表面活性剂浓度一般而言≤0.1%(重量/重量)。
这种疫苗为冻干剂型时，通常为有两个包装的试剂盒形式，第一个(一般而言呈瓶形式)装有该冻干疫苗组合物，第二个(一般而言呈瓶或注射器形式)装有这种稀释剂。还可以使用“旁通”型注射器，其中该疫苗组合物装在该注射器的下部，而其上部装这种稀释剂。
本发明最后涉及用于灭活的全病毒疫苗，特别地用于灭活的全狂犬病病毒疫苗的稳定赋形剂，它含有：
a. 缓冲液，
b. 必需和非必需氨基酸的混合物，
c. 二糖，
d. 多元醇，
e. 螯合剂，
f. 脲或脲衍生物，以及
g. 非离子型表面活性剂。
优选地，这种赋形剂没有任何蛋白，优选地没有任何肽和任何蛋白，还更优选地没有任何蛋白、任何肽和任何寡肽。还非常优选地没有任何动物来源的产品。
通过阅读下述实施例将更好地理解本发明，这些实施例用于说明本发明而不限制其内容。
图1是在抗狂犬病疫苗组合物(其中该稳定赋形剂组合物是F04+0.001%泊洛沙姆188)的3个连续解冻与再冷冻周期过程中采用“动态光散射(DLS)”得到的病毒粒子尺寸分布曲线的重叠。●D0(冷冻前)，■D1(在第一次解冻后)；▲D2(在第二次解冻后)和+D3(在第三次解冻后)。
图2是在抗狂犬病疫苗组合物(其中该稳定赋形剂组合物是F04+0.01%泊洛沙姆188)的3个连续解冻与再冷冻周期过程中采用“动态光散射(DLS)”得到的病毒粒子尺寸曲线重叠。●D0(冷冻前)，■D1(在第一次解冻后)；▲D2(在第二次解冻后)和+D3(在第三次解冻后)。
实施例 1 ：赋形剂对含有纯化并灭活的狂犬病病毒的散装剂型疫苗组合物稳定性的影响
1.1 散装剂型的制备
通过使用无血清的病毒感染培养基，在Vero细胞上已进行狂犬病病毒生产。使这些Vero细胞系细胞适应于如在WO 01/40443申请中描述的无血清培养基的培养条件。然后，把它们转移到生物发生器中，它装有在VP SFM培养基中的cytodex 1微担体1(Invitrogen)。通过保持pH约7.2±0.2、氧饱和度25%±10%以及对这种培养基进行轻微搅拌在37℃下培养3-4天后，通过使用含有VP SFM培养基(Invitrogen)的病毒感染培养基，这些细胞已用狂犬病病毒(Pitmann-Moore株)以感染复数0.01进行感染。在第7天(R1)，第11天(R2)和第15天(R3)收获了感染细胞培养物的上清液。在每次收获后，再加入其新的病毒感染培养基。采用两次连续过滤使含有感染病毒的培养物的上清液澄清：第一次使用由8µm聚丙烯制成的预过滤器(Sartopure PP2，SARTORIUS)，该预过滤器除去在收获时吸入的某些微担体、从担体上脱落的Vero细胞和大尺寸细胞碎片，第二次使用由0.8µm和0.45µm两个过滤器组合组成的PES过滤器(Sartopore 2，SARTORIUS)，它除去这些聚集体。基于以下述方式采用ELISA法进行的糖蛋白G(gpG)的量的测定，测定了在这些澄清收获物中存在的狂犬病病毒的量：
在ELISA微孔板的孔中分配约0.12µg/100µl 1112-1 anti-gpG单克隆抗体溶液(在《Journal of Clinical investigation》，(1989)，第84卷，第971-975页中描述了这种溶液特性)，该溶液预先已稀释在«包被»缓冲液(0.2M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)中。在冷室内温育一夜后，接着用洗涤缓冲液(加入Tween20的磷酸盐缓冲液，0.05%)洗涤多次，在每个孔中分配100µl饱和缓冲液(加入1%牛白蛋白血清的磷酸盐缓冲液)。在37℃温育一小时后，接着洗涤几次，获得了每个待测试试样在稀释缓冲液(加入0.05%Tween20和1%白蛋白血清的磷酸盐缓冲液)中的一系列稀释度。平行地，在每个微孔板中获得参照试样的一系列稀释度，它对照NIBSC国际标准(例如PISRAV)进行了校准。在37℃再温育一小时后，接着洗涤几次，在每个孔中分配100µl anti-gpG小鼠的单克隆抗体溶液D1(其特性在《Biologicals》(2003)，第31卷，第9-16页得到描述)，它进行了生物素化并在稀释缓冲液中稀释至1/5000后使用。让这些板置于37℃下1小时，然后在每个孔中分配100µl预先在稀释缓冲液中稀释1/5000的与过氧化物酶偶联的链霉亲和素溶液(Southern Biotechnology Associates)之前反复洗涤几次。在37℃再温育一小时后，接着洗涤几次，在每个孔中分配100µl 0.05M pH5柠檬酸盐缓冲液，它含有揭示底物(O-苯二胺)。在避光与室温的条件下温育30分钟后，通过添加50µl/孔2N H2SO4溶液中止其揭示反应(réaction de révélation)。在两个波长(492nm和620nm)处读取微孔板的分光光度数。测定的光密度是在考虑塑料吸收时的两个读数之差。根据欧洲药典(Pharmacopée Européenne)的建议采用平行直线法计算相对活性。该试样狂犬病病毒滴度是以该狂犬病病毒的糖蛋白G浓度的测定基础的，它是相对于其参照以UI/ml表示的。
在还对澄清液的电导率和pH进行控制后，在预先用20mM Tris、150mM NaCl、pH=7.5缓冲液平衡的Fractogel® EMD SO3-色谱担体(Merck)上沉积每ml担体约50UI当量的糖蛋白G(采用ELISA测定)。这种色谱担体随后用平衡缓冲液进行洗涤，然后，将狂犬病病毒洗脱在20mM Tris、600mM NaCl、pH=7.5缓冲液中，回收独立级分的病毒峰。然后进行在PES Medium Screen 100KD膜(PALL)上的超滤步骤，接着是在20mM Tris、NaCl 150mM、pH=7.5缓冲液中的渗滤。再添加MgCl2溶液，以便在该渗滤液(diafiltrat)中的浓度是2mM。通过往该反应培养基添加15U/ml粗制收获物，并且让该反应培养基在实验室温度下保持2小时，进行用benzonase的处理。在34-60%蔗糖垫上，在+5℃下使用45型钛转子以21000rpm进行超离心2h。回收含有纯化病毒的梯度级分，合并，然后稀释在50mM磷酸盐、150mM NaCl、pH=7.5缓冲液中，以便最后的纯化病毒悬浮液体积是澄清收获物体积的约1/12.5。然后，这种纯化病毒悬浮液通过β丙酸内酯处理进行灭活，接着通过在约37℃温度下加热使β丙酸内酯灭活2小时。通过用10kDa膜(Omega medium screen PALL)超滤，接着在50mM磷酸盐、150mM NaCl、pH 7.5缓冲液中渗滤，将纯化并灭活的病毒制备物浓缩6倍。得到的狂犬病病毒制备物为浓缩散装剂型，其基于糖蛋白G浓度的测定的滴度是约80UI/ml。然后面对4个赋形剂(F01-F04)中的一个来渗析一等分散装剂型，该赋形剂组成如下。
1.2 测试的赋形剂的组成
F01：50mM磷酸盐、150mM NaCl、麦芽糖(5%，p/p)、pH=8.0缓冲液；
F02：50mM磷酸盐、麦芽糖(5%，p/p)、pH=8.0缓冲液；
F03：50mM磷酸盐、麦芽糖(5%，p/p)、泊洛沙姆188(BASF)(0.001%，p/p)、pH=8.0缓冲液；
F04：489PM、pH=8.0缓冲液，其组成如下。
Figure 234091DEST_PATH_IMAGE001
。
通过把装有111.5g必需氨基酸(Gibco，参考号074-90680N，批号14773)的瓶中的内容物溶解在5升用100ml 12N HCl酸化的水(用于可注射制备物)中制备了必需氨基酸溶液。
通过把装有40.7g非必需氨基酸(Gibco，参考号074-90680N，批号14775)的瓶中的内容物溶解在5升水(用于可注射制备物)中制备了非必需氨基酸溶液。
1.3 对 4 种散装剂型配方进行的测试
将这种散装剂型配制在4种测试赋形剂组合物中。通过定期测定糖蛋白G的滴度(以UI/ml表示)评价了该四种配方(疫苗组合物)在不同保存温度-70℃、+5℃和+37℃下随着时间推移的稳定性。得到的结果列于表I-III中，这些结果用UI/ml表示。
表I：4种散装剂型配方在+37℃的稳定性
时间(星期) 0 1 2
F01* 41.25* 30.21 17.51
F02 60.41 23.15 5.12
F03 60.29 23.16 5.2
F04 57.26 52.37 52.68
表II：4种散装剂型配方在+5℃的稳定性
时间(星期) 0 3 12 24
F01 41.25** 39.71 45.56 38.55
F02 60.41 53.29 42.27 38.92
F03 60.29 52.64 47.75 41.33
F04 57.26 62.19 61.06 61.32
表III：4种散装剂型配方在-70℃的稳定性
时间(星期) 0 3 12 24
F01 41.25 33.81 37.61 27.59
F02 60.41 53.52 53.06 53.62
F03 60.29 57.87 60.15 56.46
F04 57.26 57.48 59.92 56.56
*：F01、F02、F03和F04指赋形剂组合物，在其中已配制了散装剂型
**：以UI/ml表示。
这些结果表明，赋形剂F04是能使纯化并灭活的狂犬病病毒制备物稳定的赋形剂，特别在保存温度提高时尤其如此。这还表明，在pH 8.0缓冲液中含有蔗糖(麦芽糖)和非离子型表面活性剂(例如泊洛沙姆188)的赋形剂不足以有效地使狂犬病病毒制备物稳定。
实施例 2 ：表面活性剂在稳定含有纯化狂犬病病毒的疫苗组合物中的作用
2.1 疫苗组合物的制备
采用与实施例1使用的同样方法得到了纯化狂犬病病毒的悬浮液。在超离心步骤后，该纯化病毒制备物为非常浓的形式。通过采用Bradford方法，其总蛋白浓度是7mg/ml。这种病毒制备物分配在3个用聚丙烯制成的容器中，然后稀释在试图评价其稳定作用的3种不同赋形剂中，以使在每个所测试的赋形剂中的最后总蛋白浓度降低到10µg/ml(稀释因子1/700)。3种所测试的赋形剂的组成不同仅在于它们的泊洛沙姆188含量，但都含有489PM、pH=8.0缓冲液，其组成已在实施例1中描述。无泊洛沙姆188的赋形剂具有与实施例1描述的赋形剂F04的同样组成。另外两个赋形剂分别补充了0.01g/l泊洛沙姆188(命名为赋形剂F04+0.01%泊洛沙姆)，和0.1g/l泊洛沙姆188(命名为赋形剂F04+0.1%泊洛沙姆)。
2.2 稳定性研究和结果
通过将它们置于不利的保存条件下，即让它们受到按照下述方案的一系列冷冻和解冻，评价3种疫苗组合物的稳定性：
在同一天(J0)将3种疫苗组合物冷冻到-70℃。然后，3种组合物的每一种在+5℃下进行3次解冻，接着在-70℃下再冷冻7-14小时，然后在第1、2和3天(分别J1、J2和J3)进行解冻。在每次解冻后的疫苗组合物的稳定性通过测定总病毒蛋白浓度进行评价。采用基于应用表面等离子体共振的BIAcore技术进行这种测定。还通过采用光准弹性散射技术(动态光散射或DLS技术)，对在连续解冻过程中一些粒子尺寸分布曲线进行了分析。
为了实施BIAcore技术，首先使用由制造商提供的偶联试剂盒(参考胺偶联试剂盒，BR-1000-50)，通过共价键将anti-gpG鼠的单克隆抗体D1与传感器芯片偶联起来。然后，在3分钟时间内将30µl待分析试样自动注射到该仪器中。该试样中存在的狂犬病病毒与固定在传感器芯片上的单克隆抗体相互作用引起该传感器芯片表面的折射率发生变化，其表现为记录信号的变化(RU)。这些得到的结果以任意单位(ΔRU)进行记录，并且与使用一系列参考标准获得的结果进行比较，该参考标准含有已知量的纯化狂犬病病毒。对每个试样测定的ΔRU基于用该参考所得到的标准曲线被转化成总病毒蛋白浓度。对于每个测试试样，这些测定进行4次(一式四份)。每次测定后，通过进行两次连续注射10µl Glycine(10mM，pH=1.5)缓冲液清洗传感器芯片。对每个测试疫苗组合物所得到的结果列于表IV中。这些值用µg/ml病毒蛋白表示。
表IV：在3次连续解冻和再冷冻的周期过程中3种疫苗组合物的稳定性研究
Figure 438807DEST_PATH_IMAGE002
*：基于4次对测试试样进行的测定所得到的病毒蛋白平均滴度，以µg/ml表示
**：基于4次对测试试样进行的测定所计算的根方差在括号中表示。
这些结果清楚地表明，无泊洛沙姆的赋形剂F04不能有效保存狂犬病病毒制备物，因为在D0滴度与第三次解冻(D3)后测定滴度之间的病毒滴度损失88%。相反地，赋形剂F04一旦非常少量补充泊洛沙姆188，病毒滴度损失就大大降低(当F04补充0.001g/l泊洛沙姆188时，滴度损失是33%，当F04补充0.01g/l泊洛沙姆188时，滴度损失是23%)。这些结果表明，这种赋形剂应该同时含有在489PM缓冲液中存在的组分和泊洛沙姆188，以便有效保存含有该狂犬病病毒的疫苗组合物。
通过使用Zetasizer Nano Zs仪器(Malvern Instrument)采用DLS法还分析了3种疫苗组合物中每种在每次解冻后的粒子尺寸分布曲线。在一次性使用的用聚苯乙烯制成的槽中加入450µl待分析试样，然后让其接受单色激光辐射(HeNe激光器，λ=632.8nm)。该仪器记录的信号相应于由这些粒子布朗运动所造成的散射光的波动。这些记录的数据已采用计算机软件进行处理。最后，这些结果以对于每个所测试的试样的粒子尺寸分布曲线的形式进行表示。2个图表示4根粒子尺寸分布曲线的重叠，它们是分别使用由赋形剂F04+0.001%泊洛沙姆188稳定的狂犬病病毒组合物(图1)，以及使用由赋形剂F04+0.01%泊洛沙姆188稳定的狂犬病病毒组合物(图2)在第J0天(冷冻前)、第J1、J2和J3天得到的。
这两个图清楚地表明：
1）这些粒子尺寸分布曲线是单峰的，并为高斯分布，其中值约180nm。这意味着在使用赋形剂F04+0.001%泊洛沙姆188或赋形剂F04+0.01%泊洛沙姆188稳定的该疫苗组合物中的病毒粒子群是均匀的，不含有聚集体，并含有与野生狂犬病病毒群类似的全狂犬病病毒群，以及
2）当这些狂犬病病毒疫苗组合物受到多次连续解冻和再冷冻处理时，这些粒子尺寸分布曲线不改变。
在该赋形剂组合物中存在非离子型表面活性剂(如泊洛沙姆188)也能保持狂犬病病毒群的物理完整性，甚至当该疫苗组合物置于恶劣保存条件下时也如此。
2.3 对冻干疫苗组合物稳定性的研究
2.3.1: 冻干疫苗组合物的制备
首先使用灭活全纯化病毒制备物制备散装剂型，它是采用实施例1描述的方法得到的。在病毒灭活步骤之后，该纯化并灭活的狂犬病病毒制备物在10KDa膜(Omega medium screen PALL)上通过使用称为488TM的赋形剂进行渗滤，该赋形剂是用其组成为如下(参见下表)的培养基488制备的：
组分 体积/量
必需氨基酸和非必需氨基酸的混合物 200ml
山梨糖醇(Roquette) 50g
精氨酸盐酸盐(Jerafrance) 10g
EDTA(Prolabo) 0.37g
谷氨酸钠(SAFC) 4g
脲 10g
Tris Na H2PO4.2H2O(SAFC) 2.42g
软化水QSP 1000ml
6N盐酸(Sanofi)QSP pH=8.0
通过将2.5升实施例1制备的必需氨基酸溶液与2.5升实施例1制备的非必需氨基酸溶液混合，并通过用30%氢氧化钠溶液将其pH调节至约7.2制备得到这种必需和非必需氨基酸的混合物。
该赋形剂488TM组成如下：
组分 体积/量
培养基488 400ml
麦芽糖(Hayashibara) 50g
Tris Na H2PO4.2H2O(SAFC) 1.45g
软化水QSP 1000ml
6N盐酸(sanofi) QSP pH=8.0
得到的疫苗制备物为在赋形剂488TM中的散装剂型，其基于采用ELISA测定糖蛋白G浓度的病毒滴度是约12UI/ml。这种散装剂型在-70℃下以冷冻形式保存，直到制备冻干疫苗组合物时。
就在冻干步骤之前，一部分散装剂型进行冷冻与稀释，以便通过使用以下赋形剂将其最后糖蛋白G滴度调到约8UI/ml：
-或者赋形剂F’04，其组成含有每3体积50mM磷酸盐缓冲液为1体积赋形剂488TM，将麦芽糖的浓度调节到50g/l，pH=8.0；
-或者赋形剂F’05，它与赋形剂F’04相同，但往其中以0.01g/l最后浓度添加泊洛沙姆188。
然后，按照0.4ml/瓶把两种疫苗组合物分配到冻干瓶中，再进行通常的冻干周期，这种周期包括在温度<-40℃下冷冻阶段，接着两个连续干燥阶段，第一干燥段在约-15℃温度与约80微巴压力下进行，而第二干燥段在约+40℃温度与约80微巴压力下进行。
每个冻干瓶装有一剂量待测试疫苗组合物。所得到的这些冻干疫苗组合物的差别仅仅在于，根据这种散装剂型已稀释在赋形剂F’04或F’05中而存在或不存在这种表面活性剂。
下面列出在一剂量由赋形剂F’05制备的冻干剂型疫苗组合物中含有的赋形剂组成
组分 量(mg/剂量)
必需和非必需氨基酸的混合物 0.12
泊洛沙姆188 0.004
麦芽糖 20.00
精氨酸盐酸盐 0.41
山梨糖醇 2.05
EDTA二钠 0.01
脲 0.41
谷氨酸钠 0.16
Na2HPO4.2H2O 2.53
NaH2PO4.2H2O 0.12
Tris 0.24
HCl QSP
NaOH QSP
2.3.2: 冻干疫苗组合物的效力
使用两种不同的稳定赋形剂制备出两种冻干疫苗组合物，然后采用NIH正式测试法检测它们的效力。分析了两种冻干疫苗组合物的«效力»，或者冻干后立刻进行(J0)，或者在45℃下保存一星期后进行，或者在37℃下保存1个月后进行。采用唯一官方认可的活性测试，NIH测试，它能够测定在每个测试疫苗组合物剂量中含有的UI数。如果UI数≥2.5UI，这个测试疫苗剂量是有效的。NIH测试每次对于每个测试条件都进行«双次»，通过在同样条件下制备并保存的瓶批次中随意地取出两个冻干瓶，并且对这些提取物进行NIH测试来进行。采用的方案对应于欧洲药典的第0216篇专题论文的方案。这个测试是在小鼠中进行的检验性测试，其基于由该剂量的测试疫苗提供的保护与用已知量的参照抗狂犬病疫苗提供的保护的比较。这种参照抗狂犬病疫苗是以国际单位(UI)分级的。国际单位(UI)是在确定量的国际标准中含有的活性。OMS建立了国际标准的当量(UI)。在已证实该效力测试的控制参数得到很好满足后，由每个测试的提取物和参照制备物得到的50%保护剂量值(以UI分级)确定在该测试疫苗中含有的UI数。
得到的结果列于下表V中。
表V：冻干疫苗组合物效力随使用
冻干赋形剂组合物与保存条件的变化
冻干组合物保存时间(天)和温度 J0/+4℃ J7/ +45℃ J30/ +37℃
F’04 0.8* (0.4; 1.8)** 0.9 (0.4; 2.1) NT
F’05 6.1 (1.6; 41.3) 2.8 (0.9; 7.9) 3.5 (1.4; 8.7)
*：得到的以UI表示的平均值(所有测试小鼠组有16支小鼠)
**：表示以UI表示的所得到的极值
NT：未测试出。
这些结果与上段(2.2)中讨论的结果一致，并且表明泊洛沙姆188应该包含在用于保存这些冻干疫苗组合物的赋形剂组合物之中。事实上，只有含有赋形剂F’05(它含有泊洛沙姆188)的这些冻干疫苗组合物含有有效剂量的疫苗，因为其平均UI值高于2.5UI。这些疫苗组合物依然是稳定的，因为在这些测试的保存条件下它们的效力随着时间推移而没有降低。
概括地，实施例2中列出的这些结果表明，含有该狂犬病病毒的这些疫苗组合物能够与稳定赋形剂一起得到很好保存，该稳定赋形剂组成含有磷酸盐缓冲液、必需和非必需氨基酸的混合物、蔗糖(如麦芽糖)、多元醇(如山梨糖醇)、EDTA、脲以及与其组合的非离子型表面活性剂，像泊洛沙姆188。此外，有利的是，泊洛沙姆188的«稳定作用»在非常低的浓度下发挥，该浓度对于能够激活该免疫系统或用作为免疫反应调节剂是过低的。
实施例 3 ：含有纯化并灭活的狂犬病病毒的疫苗组合物的稳定性研究
实施例1和2已表明使赋形剂的成分与泊洛沙姆188组合的重要性，该赋形剂在基于磷酸盐和/或Tris的缓冲液中含有必需和非必需氨基酸的混合物、麦芽糖、山梨糖醇、EDTA、脲，在这里介绍研究的目的是证实在很宽的保存温度范围(+37℃、+25℃、+5℃、-70℃)内与在很长的时间段内，这种组合有效地使不同剂型(液体、冷冻或冻干)的狂犬病病毒疫苗组合物稳定。这些研究对多种狂犬病病毒疫苗组合物进行，这些狂犬病病毒疫苗组合物以冷冻散装剂型在温度≤-35℃下保存，以最终液体散装产品剂型在+5℃下或以单位冻干剂型在+5℃、+25℃或+37℃下保存。
3.1 冷冻散装剂型抗狂犬病疫苗批次的稳定性研究
根据如实施例1所描述的方法制备了用于制备散装剂型批次的狂犬病病毒。在病毒灭活步骤之后，纯化并灭活的病毒制备物在膜10KDa上通过使用50mM磷酸盐缓冲液作为渗滤缓冲液进行渗滤。其次，将1体积的截留物与1体积稳定赋形剂混合，该稳定赋形剂的组成是实施例1描述的缓冲液489PM的组成，(除了每个组分的浓度是两倍)，往其中添加浓度0.02g/l、pH≈8.0的泊洛沙姆188。得到具有50µg/ml总蛋白浓度的散装剂型，其中70%以上是狂犬病病毒蛋白，并且它含有100pg/ml以下的残留DNA。在-35℃和在-70℃下保存后通过每3个月测定糖蛋白G滴度研究了随着时间推移该散装剂型的稳定性。得到的结果列于下表VI中。
表VI：在-35℃或-70℃下保存的散装剂型批次的稳定性
保存温度 T0 T0 + 3个月 T0 + 6个月 T0 + 9个月 T0 + 12个月
-35℃ 20.4* 20.84 24.4 24.3 22.4
-70℃ 21.3 NT 22.4 22.8 21.8
*：滴度，以UI/ml表示
NT：未测试出。
在-35℃或-70℃下存储12个月后没有观察到是该狂犬病病毒的主要抗原的糖蛋白G降解，这证实了冷冻散装剂型疫苗组合物的良好稳定性。此外，在-35℃或-70℃保存12个月后采用DLS对病毒粒子尺寸分布的分析表明，这些曲线保持了以中值180nm为中心的高斯形状(与图1和2的曲线类似)。不存在表明有病毒聚集体存在的这些曲线分裂。这些结果还表明，狂犬病病毒粒子群随着时间推移没有发生变化。随着时间推移没有观察到所述病毒粒子降解和聚集。
3.2 ：液体散装成品剂型 (PFV) 抗狂犬病疫苗批次的稳定性研究 .
使用3个散装剂型批次在缓冲液489PM(实施例1中描述的组成)中稀释后制备了3液体PFV剂型的疫苗批次，在该缓冲液489PM中添加了泊洛沙姆188(0.01g/l最后浓度，pH≈8.0)。它们含有100pg/ml以下的残留DNA(采用定量PCR测定)。在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳光密度分析后总蛋白浓度是约15µg/ml，和70%以上总蛋白是病毒蛋白。通过采用ELISA在3个月时间内对在+5℃保存的PFV批次定期地测定糖蛋白G的含量，和在30天时间内对在+25℃保存的PFV批次定期地测定糖蛋白G的含量，研究了在+5℃和+25℃保存的PFV批次稳定性。得到的结果以UI/ml表示，并且汇集在下表VII和VIII。
表VII：在+5℃保存的3个PFV批次的稳定性
批号 T0 T0 + 1个月 T0 + 2个月 T0 + 3个月
N°1 10.5 12.0 8.6 10.8
N°2 11.1 10.7 9.3 11.9
N°3 13.9 11.1 11.6 11.2
表VIII：在+25℃保存的3个PFV批次的稳定性
批号 T0 T0 + 15天 T0 + 30天
N°1 12.0 10.9 10.9
N°2 10.7 11.4 10.1
N°3 11.1 12.0 11.5
这些结果表明，在所研究的时间段中液体剂型PFV批次在+5℃和+25℃的保存期间，没有糖蛋白G降解。这证实，这些抗狂犬病疫苗以液体剂型在低温(+5℃)可以保存至少3个月，在室温(+25℃)至少30天，而没有观察到该病毒降解。
3.3 ：冻干剂型抗狂犬病疫苗批次的稳定性研究
2个冻干剂型抗狂犬病疫苗批次(LL1和LL2)是用实施例3.2的PFV批次制备的，按照0.3ml/瓶，将它们分配在用玻璃制成的冻干瓶中，然后进行冻干周期，在其过程中在≤-40℃的温度下进行冷冻，第一个干燥段在约-15℃温度与约80微巴压力下直到冰完全升华，而第二个干燥段在约+40℃温度与约80微巴压力下直到在这些冻干物中残留水分含量≤3%。在冻干步骤时的病毒滴度损失<5%。
在呈冻干剂型的疫苗剂中含有的赋形剂的组成如下：
组分 量，以mg/剂量表示
必需和非必需氨基酸的混合物 0.37
泊洛沙姆188 0.003
麦芽糖 15.00
精氨酸盐酸盐 1.20
山梨糖醇 6.00
EDTA二钠 0.04
脲 1.2
谷氨酸钠 0.15
Na2HPO4.2H2O 2.53
NaH2PO4.2H2O 0.12
HCl QSP
NaOH QSP
得到的这些冻干单元剂量具有白色的均匀外观。在用0.5ml 0.4%氯化钠溶液再溶解这些冻干物后得到狂犬病病毒悬浮液的pH是7.8±0.5。研究了在3个保存温度35-39℃、23-27℃和2-8℃随着时间推移两个冻干批次的稳定性，通过验证冻干物在重构前后的外观、通过测定残留水分，通过控制其pH、病毒滴度，以及通过检测在NIH测试中冻干剂的效力来进行。稀释系列(其为了在NIH测试中在溶于氯化钠之后检测所述冻干剂而进行)的第一次稀释在含有2g/l人白蛋白的0.9%氯化钠溶液中进行。
采用ELISA法基于糖蛋白G含量测定了这些病毒滴度(以UI/ml表示)。
有关冻干物外观的测试结果和残留水分与pH测定结果是与特异性完全一样的(即该冻干物为均匀白色外观、在低渗性生理血清中重构后无色透明溶液，以及残留水分含量<3%)，无论所测试的保存温度和时间怎样也都如此。在稳定性研究的整个期间内pH依然是在7.8 ± 0.5范围内。
有关这些病毒滴度和对所述单位剂量进行的效力测试(NIH)的结果汇集在下表IX-XI中。
表IX：在+5℃以冻干剂型保存的两个抗狂犬病疫苗批次的稳定性
Figure 637707DEST_PATH_IMAGE003
表X：在+25℃以冻干剂型保存的两个抗狂犬病疫苗批次的稳定性
表XI：在+37℃以冻干剂型保存的两个抗狂犬病疫苗批次的稳定性
Figure 67711DEST_PATH_IMAGE005
M：表示月
ND：表示未测定出
*：以UI/ml表示的值
**：以UI数表示的平均值，其补全了在括号中列出的所观察的极值。
所有这些结果都证实，以冻干剂型保存的这些抗狂犬病疫苗保存非常稳定，并且在这些测试温度条件下随着时间推移没有效力损失。这些糖蛋白G滴度和NIH测试值(明显高于2.5UI)随着时间推移保存稳定。
结论：对以冷冻剂型、液体剂型或冻干剂型保存的多个抗狂犬病疫苗批次进行的所有稳定性测试表明，这些批次在这些测试温度的条件下随着时间推移保持稳定。这证实，其组成含有缓冲液、必需和非必需氨基酸的混合物、麦芽糖、山梨糖醇、EDTA、脲和泊洛沙姆188的赋形剂有效地使抗狂犬病疫苗组合物稳定，无论其存在方式(冷冻、液体或冻干) 怎样和在宽范围的保存温度下都如此。

Claims (31)

1.疫苗组合物，其含有：
a) 灭活的全病毒制备物，以及
b) 稳定赋形剂，其包含：
i. 缓冲溶液，
ii. 必需和非必需氨基酸的混合物，
iii. 二糖，
iv. 多元醇，
v. 螯合剂，
vi. 脲或脲衍生物，以及
vii. 非离子型表面活性剂。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述灭活的全病毒是狂犬病病毒。
3.根据权利要求1或2的组合物，其特征在于，所述组合物还没有任何血清蛋白。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其特征在于，所述组合物还没有任何动物来源的外源蛋白，优选地没有任何动物来源的外源产品。
5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其特征在于，病毒蛋白占在该疫苗组合物中存在的总蛋白的至少70%。
6.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其特征在于，总蛋白浓度为≤100µg/ml，优选地≤80µg/ml。
7.根据权利要求1-6中任一项的组合物，其特征在于，在一个有效剂量的疫苗组合物中所含有的总蛋白的量为≤100µg。
8.根据权利要求1-7中任一项的组合物，其特征在于，在一个有效剂量的疫苗组合物中所含有的总蛋白的量为1-50µg。
9.根据权利要求1-8中任一项的组合物，其特征在于，所述稳定赋形剂没有任何蛋白，或者没有任何蛋白和任何肽，或者优选地没有任何蛋白、任何肽和任何寡肽。
10.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其特征在于，所述必需和非必需氨基酸的混合物至少包含精氨酸或精氨酸盐和谷氨酸或谷氨酸盐。
11.根据权利要求1-10中任一项的组合物，其特征在于，在一个有效剂量的疫苗组合物中所含有的必需和非必需氨基酸的量为0.5-2.5mg。
12.根据权利要求1-11中任一项的组合物，其特征在于，所述二糖为麦芽糖。
13.根据权利要求1-12中任一项的组合物，其特征在于，所述多元醇为山梨糖醇。
14.根据权利要求1-13中任一项的组合物，其特征在于，在一个有效剂量的疫苗组合物中所含有的二糖和多元醇的总量为10-50mg。
15.根据权利要求1-14中任一项的组合物，其特征在于，所述鳌合剂为EDTA或EDTA盐。
16.根据权利要求1-15中任一项的组合物，其特征在于，在一个有效剂量的疫苗组合物中所含有的鳌合剂的量为0.01-0.1mg。
17.根据权利要求1-16中任一项的组合物，其特征在于，在一个有效剂量的疫苗组合物中所含有的脲或脲衍生物的量为0.3-1.5mg。
18.根据权利要求1-17中任一项的组合物，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为泊洛沙姆。
19.根据权利要求1-18中任一项的组合物，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为泊洛沙姆188。
20.根据权利要求1-19中任一项的组合物，其特征在于，在一个有效剂量的疫苗组合物中所含有的非离子型表面活性剂的量为0.001-0.5mg。
21.根据权利要求1-20中任一项的组合物，其特征在于，该疫苗组合物的pH为7.0-10.0，优选地7.0-9.0。
22.根据权利要求1-21中任一项的组合物，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或它们的混合物。
23.根据权利要求1-22中任一项的组合物，其特征在于，所述缓冲溶液为其摩尔浓度为10-100mM的磷酸盐缓冲液。
24.制备疫苗组合物的方法，所述疫苗组合物含有纯化并灭活的全病毒制备物，其中：
a) 通过收获被所述病毒感染的细胞培养物的上清液产生全病毒制备物，
b) 对所述全病毒制备物进行纯化和灭活，或者备选地将所述全病毒制备物灭活然后纯化，以及
c) 将所述纯化并灭活的全病毒制备物稀释在稳定赋形剂中，所述稳定赋形剂的组成包含：
i. 缓冲溶液，
ii. 必需和非必需氨基酸的混合物，
iii. 二糖，
iv. 多元醇，
v. 螯合剂，
vi. 脲或脲衍生物，以及
vii. 非离子型表面活性剂。
25.根据权利要求24的方法，其特征在于，在不引入动物来源的外源产品的情况下实施该方法。
26.根据权利要求24或25的方法，其特征在于，所述病毒为狂犬病病毒。
27.根据权利要求24-26中任一项的方法，其中在稀释所述纯化并灭活的全病毒制备物之后，将如此获得的疫苗组合物分配在包装装置中，以及任选地将该疫苗组合物冻干。
28.疫苗组合物，其含有根据权利要求27的方法获得的以冻干剂型存在的纯化并灭活的全病毒制备物。
29.用于灭活的全病毒疫苗的稳定赋形剂，其组成包含：
i. 缓冲溶液，
ii. 必需和非必需氨基酸的混合物，
iii. 二糖，
iv. 多元醇，
v. 螯合剂，
vi. 脲或脲衍生物，以及
vii. 非离子型表面活性剂。
30.根据权利要求29的稳定赋形剂，其特征在于，所述稳定赋形剂还没有任何蛋白，或者没有任何蛋白和任何肽，或者优选地没有任何蛋白、任何肽和任何寡肽。
31.根据权利要求30的稳定赋形剂，其特征在于，所述稳定赋形剂还没有任何动物来源的产品。
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