BR112012008000B1

BR112012008000B1 - Composição vacinal e processo de preparação da mesma

Info

Publication number: BR112012008000B1
Application number: BR112012008000-8A
Authority: BR
Inventors: Michel Chevalier; Nadège Moreno; Eric Calvosa; Sandrine Cigarini; Virginie Fabre; Alain Francon
Original assignee: Sanofi Pasteur
Priority date: 2009-10-07
Filing date: 2010-10-07
Publication date: 2021-07-13
Also published as: RU2012118386A; AU2010304898B2; US20110081380A1; PL2485766T3; PE20121405A1; CN102281900A; MX2012003935A; AU2010304898A1; EP3915586A1; EP2485766B1; AR078558A1; RU2560675C2; BR112012008000A2; WO2011042663A1; MX338300B; US8557253B2; CN102281900B; US20140037684A1; PT2485766T; MA33723B1

Abstract

composição vacinal, processo de preparação da mesma e excipiente estabilizante para vacina com vírus inteiros inativados. a presente invenção refere-a uma composição vacinal, compreendendo: a) vírus inteiros inativados e b) um excipiente estabilizante que compreende: i. uma solução tampão; ii. uma mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais; iii. um dissacarídeo; iv. um poliol; v. um agente quelante; vi. ureia ou um derivado da ureia; e vii. um tensoativo não iônico.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma composição vacinal, compreendendo vírus inteiro inativado e um excipiente que estabiliza a composição vacinal, a composição de excipiente compreendendo uma solução tampão, uma mistura de aminoácidos essenciais e não- essenciais, um dissacarídeo, um poliol, um agente quelante, ureia ou um derivado da ureia e um tensoativo não iônico. Ela se refere também a um processo de preparação dessa composição vacinal, assim como à composição do excipiente como tal;

[0002] No domínio das vacinas virais, distinguem-se classicamente 3 tipos de vacinas virais: as vacinas com vírus vivos, as vacinas com vírus inteiros inativados e as vacinas virais subunitárias. Esses três tipos de vacinas se distinguem por características que lhe são próprias e que condicionam a composição dos excipientes que são utilizados para sua conservação. As vacinas são unitárias, contendo um número restrito de antígenos virais são geralmente mais fáceis de conservar que as vacinas com vírus inteiros inativados para os quais se busca conservar a integridade estrutural dos vírus, mesmo se forem mortos, ou que as vacinas com vírus vivos para os quais se busca conservar também o poder infeccioso dos vírus. Para cada tipo de vacinas virais dos excipientes adaptados foram preparados. Para as vacinas virais com vírus atenuados, diferentes excipientes estabilizantes foram preparados em função do preparo de vírus atenuados a conservar. JP 57007423 descreve um excipiente à base de dissacarídeo e de poliálcool em um tampão fosfato para estabilizar uma cepa atenuada do vírus do sarampo. EP 065905 descreve um excipiente que compreende um ou vários aminoácidos escolhidos dentre um grupo de onze aminoácidos, da lactose e do sorbitol em um tampão fosfato para estabilizar uma cepa atenuada do vírus da dengue. Enfim, EP 0869814 descreve uma composição vacinal que compreende uma cepa atenuada do vírus da varicela e um agente estabilizante contendo sorbitol, manitol, sacarose, dextrano, uma mistura de aminoácidos, da ureia e da EDTA.

[0003] No domínio das vacinas com vírus inativados, as composições vacinais prontas para serem administradas contêm frequentemente proteínas de origem animal, tais como a albumina bovina ou humana, a gelatina ou a caseína. As proteínas são conhecidas por melhorar a conservação (estabilização) dessas vacinas notadamente as vacinas que contêm vírus difíceis de conservar. É o caso das composições vacinais contendo vírus rábico inativado. Frazatti-Gallina et Coll. Na Vacina (2004), volume 23, páginas 511-517 sublinha o papel importante das proteínas na estabilização da vacina antirrábica, já que o excipiente contém albumina.

[0004] Todavia, a presença de proteínas nas vacinas, além do fato de elas poderem representar um risco potencial de transmissão de doenças, caso sua origem não seja rigorosamente controlada, podem representar também um risco alérgico potencial que se procura evitar, notadamente quando as vacinas contêm proteínas séricas, tais como a albumina ou derivados da albumina.

[0005] Existe, portanto, a necessidade de encontrar um excipiente estabilizante, cuja composição não contém proteína para estabilizar as vacinas virais com vírus inteiros inativados e, em particular, para estabilizar vacinas contendo vírus inteiros inativados difíceis de conservar, como o vírus rábico.

[0006] Existe também a necessidade de encontrar um excipiente estabilizante que convém também para estabilizar vacinas com vírus inativados ligeiramente dosados, isto é, que contêm uma pequena quantidade de proteínas totais em uma dose eficaz de vacina. Essa necessidade é ainda mais importante para as vacinas muito purificadas, contendo muito poucas impurezas proteicas residuais. As impurezas proteicas residuais, mesmo se elas representarem um risco alérgico potencial podem contribuir em uma certa medida para estabilizar as vacinas virais inativadas ligeiramente dosadas. Elas podem impedir os fenômenos de agregação, de degradação estrutural ou de adsorção do vírus, podendo reduzir a eficácia da vacina.

[0007] Para isso, a presente invenção tem por objeto:

[0008] Uma composição vacinal compreendendo: a) uma preparação de vírus inteiros inativados, e b) um excipiente estabilizante que compreende: I. uma solução tampão; II. uma mistura de aminoácidos essenciais e não- essenciais; III. um dissacarídeo; IV. um poliol; V. um agente quelante; VI. ureia ou um derivado da ureia, e VII. um tensoativo não iônico.

[0009] Preferencialmente, o vírus inteiro inativado é o vírus rábico.

[00010] Segundo um aspecto da invenção, a composição vacinal é também desprovida de qualquer proteína sérica.

[00011] Segundo um aspecto da invenção, a composição vacinal é também desprovida de qualquer proteína exógena de origem animal, e, preferencialmente, desprovida de qualquer produto exógeno de origem animal.

[00012] Segundo ainda um outro aspecto, as proteínas dos vírus representam pelo menos 70% das proteínas totais que estão presentes na composição vacinal.

[00013] Segundo ainda um outro aspecto, a concentração em proteínas totais na composição vacinal é <100 μg/meio de ligação e preferencialmente < 80 μg/meio de ligação.

[00014] Em um aspecto particular, a quantidade de proteínas totais que fica contida em uma dose eficaz da composição vacinal é < 100 μg.

[00015] Em um outro aspecto particular, a quantidade de proteínas totais que fica contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 1 e 50 μg.

[00016] Em um outro aspecto da invenção, o excipiente estabilizante é desprovido de qualquer proteína e de qualquer outro peptídeo, ou, preferencialmente, desprovido de qualquer proteína, de qualquer peptídeo e de qualquer oligopeptídeo.

[00017] Segundo um outro aspecto, a mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais contido na composição vacinal compreende pelo menos a arginina ou um sal de arginina e ácido glutâmico ou um sal de ácido glutâmico.

[00018] Segundo um aspecto particular, a quantidade de aminoácidos essenciais e não-essenciais contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 0,5 e 2,5 mg.

[00019] Segundo um outro aspecto, o dissacarídeo que fica contido no excipiente é a maltose.

[00020] Segundo um outro aspecto, o poliol fica contido na composição vacinal é o sorbitol.

[00021] Segundo um aspecto particular, a quantidade total de dissacarídeo e de poliol contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 10 e 50 mg.

[00022] Em um outro aspecto, o agente quelante que fica contido na composição vacinal é o EDTA ou um sal de EDTA.

[00023] Segundo um aspecto particular, a quantidade de agente quelante contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 0,01 e 0,1 mg.

[00024] Segundo um outro aspecto particular, a quantidade de ureia ou de derivado da ureia contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 0,3 e 1,5 mg.

[00025] Em um outro aspecto, o tensoativo não iônico que fica contido na composição vacinal é um poloxâmero.

[00026] Preferencialmente, o poloxâmero é o poloxâmero 188.

[00027] Segundo um aspecto particular, a quantidade de tensoativo não iônico contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 0,001 e 0,5 mg.

[00028] Segundo um outro aspecto, o pH da composição vacinal está compreendido entre 7,0 e 10,0 e, de preferência, entre 7,0 e 9,0.

[00029] Em um outro aspecto, a solução tampão que é contida na solução vacinal é um tampão fosfato, um tampão Tris, um tampão HEPES ou uma mistura destes.

[00030] Em um aspecto particular, a solução tampão é um tampão fosfato, cuja molaridade está compreendida entre 10 e 100 mM.

[00031] A invenção tem também por objeto um processo de preparação de uma composição vacinal, contendo uma preparação de vírus inteiros purificados e inativados, segundo o qual: a. produzir uma preparação de vírus inteiros, coletando o sobrenadante de uma cultura de células infectadas por vírus; b. purificar e inativar a preparação de vírus inteiros ou alternativamente inativar e purificar a preparação de vírus inteiros e c. diluir a preparação de vírus inteiros purificados e inativados em um excipiente estabilizante, cuja composição compreende: I. uma solução tampão; II. uma mistura de aminoácidos essenciais e não- essenciais; III. um dissacarídeo; IV. um poliol V. um agente quelante; VI. ureia ou um derivado da ureia; e VII. um tensoativo não iônico.

[00032] Segundo um modo preferido, o processo, de acordo com a invenção, é realizado sem introduzir produto exógeno de origem animal.

[00033] Em um modo preferido de realização do processo, segundo a invenção, o vírus é o vírus rábico.

[00034] Em um outro aspecto, o processo, de acordo com a invenção, compreende após ter diluído a preparação de vírus inteiros purificados e inativados, uma etapa de repartição da composição vacinal assim obtida em dispositivos de acondicionamento e opcionalmente uma etapa de liofilização da composição vacinal.

[00035] A invenção tem também por objeto uma composição vacinal contendo uma preparação de vírus inteiros purificados e inativados sob uma forma liofilizada obtido segundo um dos modos de realização do processo da invenção.

[00036] A invenção tem também por objeto um excipiente estabilizante para uma vacina com vírus inteiros inativados cuja composição compreende: I. uma solução tampão; II. uma mistura de aminoácidos essenciais e não- essenciais; III. um dissacarídeo; IV. um poliol V. um agente quelante; VI. ureia ou um derivado da ureia; e VII. um tensoativo não iônico.

[00037] Preferencialmente, a composição do excipiente estabilizante é também desprovida de qualquer proteína, ou de qualquer proteína e de qualquer outro peptídeo, ou, preferencialmente, desprovido de qualquer proteína, de qualquer peptídeo e de qualquer oligopeptídeo.

[00038] De forma particularmente preferida, a composição do excipiente estabilizante é também desprovida de qualquer produto de origem animal.

Descrição Detalhada da Invenção

[00039] A composição vacinal, de acordo com a invenção, compreende vírus inteiro inativado (ou uma preparação de vírus inteiros inativados) e um excipiente estabilizante, cuja composição compreende um tampão, uma mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais, um dissacarídeo, um poliol, um agente quelante, a ureia ou um derivado da ureia e um tendo ativo não iônico. A composição de excipiente substitui vantajosamente os excipientes da técnica anterior que contêm em sua composição uma proteína. De forma particularmente interessante, ela estabiliza as composições vacinais difíceis de conservar e particularmente as composições vacinais que contêm como vírus inteiro inativado do vírus rábico, sem que seja necessário acrescentar uma proteína.

[00040] A composição vacinal, de acordo com a invenção, é estável ao mesmo tempo sob a forma líquida, sob a forma líquida congelada ou sob a forma de liofilizado, o que oferece uma flexibilidade muito grande de utilização.

[00041] O excipiente estabilizante, de acordo com a invenção, preserva a atividade biológica da composição vacinal no decorrer do tempo quer ela esteja sob a forma congelada, líquida ou liofilizada. A temperatura de conservação das composições vacinais congeladas é geralmente < -35°C; ela está compreendida entre + 2°C a + 8°C para as composições sob a forma líquida e a uma temperatura de aproximadamente mais 5°C para as composições sob a forma liofilizada. Vantajosamente, ele preserva também a atividade biológica e a integridade física dos vírus em composições vacinais conservadas em condições desfavoráveis, como a conservação a + 37°C das composições vacinais sob a forma líquida ou quando se submetem as composições vacinais a uma sucessão de descongelamentos e de recongelamentos.

[00042] A atividade biológica do vírus na composição vacinal é avaliada, medindo-se no decorrer do tempo a quantidade de um imunogene constitutivo do vírus, que é essencial para induzir uma imunidade protetora ao encontro do vírus e/ou testando sua eficácia em um teste de prova em um modelo animal oficialmente reconhecido. No caso de uma composição vacinal contendo vírus rábico inativado, a estabilidade da composição vacinal é avaliada medindo-se no decorrer do tempo (ou no decorrer de descongelamentos sucessivos), o título em vírus que é estimado com base na medida da concentração em glicoproteína G sob a forma não desnaturada e/ou testando a eficácia da composição vacinal por meio do teste oficial NIH. Para avaliar a taxa de glico proteína G, pode-se aplicar um método ELISA, de tipo sanduíche, que reconhece pelo menos um, preferencialmente, dois epitopos conformacionais da glico proteína G, conforme descrito no exemplo 1. Quando se utiliza um ELISA que reconhece dois epitopos conformacionais da proteína G, utiliza-se habitualmente como anticorpo de captura um anticorpo que neutraliza o vírus rábico que reconhece um epitopo conformacional localizado no local antigênico II da glico proteína G (Journal of Clinical investigation (1989) volume 84, página 971 a 975) e como anticorpo de revelação um anticorpo neutralizante que reconhece um epitopo conformacional localizado no local antigênico III da proteína G (Biologicals (2003), volume 31, páginas 9 a 16). Os resultados são expressos em unidades internacionais, pois se utiliza habitualmente como referência uma aferição que foi calibrada face a referência internacional do NIBSC. Pode-se também aplicar a tecnologia BIAcore, considerada como alternativa interessante ao método ELISA, que se baseia na utilização da ressonância plasmônica de superfície para quantificar o título em vírus.

[00043] O excipiente estabilizante, segundo a invenção, age também, preservando a integridade física das partículas virais. Ele impede notadamente a formação de agregados e/ou a degradação da estrutura das partículas virais no decorrer do tempo. Isto pode ser controlado por meio de um aparelho, tal como o zetasizer Nano ZS (Malvern instrument) que detecta os agregados e estabelece o perfil de distribuição do tamanho das partículas virais na composição vacinal.

[00044] O vírus ou a preparação do vírus está sob a forma de partículas virais plenas que foram inativadas, geralmente por tratamento químico ao formol, ao formaldeído ou à β propiolactona. Outros processos de inativação como aquele quer é descrito em WO 2005/093049 podem também ser utilizados. As preparações de vírus inteiros inativados principalmente utilizadas contêm vírus envolvidos, pois eles são frequentemente mais difíceis de conservar e requerem a utilização de composições de excipientes específicos para assegurar sua conservação. Trata-se notadamente de preparações de vírus inteiros inativados da encefalite japonesa. De forma particularmente preferida, as preparações de vírus inteiros inativados contêm vírus rábico.

[00045] As preparações de vírus provêm de coletas que estão geralmente sob a forma de coletas do sobrenadante de cultura de células infectadas pelo vírus. Podem-se utilizar meios clássicos contendo soro de origem animal para produzir o estoque de células e infectar as células. Vantajosamente, os meios que servem para a cultura e a infecção das células não contêm proteína sérica, nem mesmo produto de origem animal. As proteínas que estão eventualmente presentes nesses meios são geralmente proteínas de baixo peso molecular (< 10 KD) ou antes de tudo peptídeos com concentrações muito baixas, o que diminui muito os riscos alérgicos. É o caso, por exemplo, dos meios comercializados sob as denominações VP SFM (In Vitrogen), Opti Pro TM serum-free (In Vitrogen), Ex-Cell ® MDCK (Sigma-Aldrich), Ex-Cell TM Vero (SAFC biosciences) MP-BHK ® serum free (MP Biomedicals), SFC-10 BHK Express serum free (Promo Cell), SFC-20 BHK Express protein free (Promo Cell), HyQ PF Vero (Hyclone Ref. SH30352.02), Hyclone SFM4 Megavir, o meio MDSS2 (Axcell biotecnology), o meio DMEM Iscove modificado (Hyclone), os meios nutritivos de Ham (Ham-F10, Ham-F12), o meio de leibovitz L-15 (Hyclone). Por exemplo, as coletas de vírus rábicos são obtidas a partir de um estoque de células Vero que foram produzidas, depois infectadas, utilizando-se meios de cultura e de infecção viral, que são, de preferência, desprovidos de qualquer proteína sérica, de qualquer proteína de origem animal e mesmo de qualquer produto de origem animal, tal como o meio VP SFM.

[00046] Vantajosamente, a preparação de vírus inteiros inativados contidos na composição vacinal, de acordo com a invenção, é muito purificada. Habitualmente, purifica-se, depois inativar ou inversamente inativar, depois purificar o vírus que provém das coletas. Quando todas as etapas de produção e de purificação do vírus são realizadas sem utilizar proteína sérica, sem utilizar proteína exógena de origem animal, ou mesmo sem utilizar produto exógeno de origem animal, vantajosamente a composição vacinal, de acordo com a invenção, é desprovida de qualquer proteína sérica para reduzir ao máximo os riscos alérgicos, e desprovida de qualquer proteína exógena de origem animal ou mesmo de qualquer produto de origem animal para reduzir ao máximo os riscos de tratamento transmissão de doenças. Por proteína ou produto de origem animal, entende-se uma proteína ou um produto, cujo processo de fabricação compreende pelo menos uma etapa na qual se utiliza uma matéria proveniente do animal ou do homem. Por "proteína ou produto exógeno" entende-se uma proteína ou um produto que é introduzido em uma das etapas do processo de produção e/ou de purificação do vírus. Por exemplo, as proteínas ou os produtos que são contidos eventualmente na composição dos meios de cultura, as enzimas tais como a tripsina ou a benzonase que são utilizadas quando das etapas de produção e/ou de purificação do vírus são proteínas ou produtos exógenos. As proteínas ou produtos exógenos são de origem animal desde quando seu processo de fabricação compreende pelo menos uma etapa na qual se utiliza uma matéria proveniente do animal ou do homem. As proteínas ou os produtos exógenos são de origem não animal quando são fabricados por outros meios, por exemplo, utilizando-se uma matéria vegetal, por síntese química ou por recombinação genética, utilizando-se levedos, bactérias ou plantas. As proteínas ou os produtos provenientes das células a partir das quais os vírus são produzidos para se obter a composição vacinal, de acordo com a invenção, são, ao contrário, proteínas ou produtos endógenos, pois são produzidos (ou ampliados) ao mesmo tempo que os vírus.

[00047] No âmbito da presente invenção pode-se aplicar, com proveito, processos de purificação particularmente com desempenhos que levam à obtenção de preparações virais muito puras, cita-se, a título de exemplo, o processo de purificação de vírus que compreende uma cromatografia trocadora de ânions seguida de uma cromatografia trocadora de cátions e completado por uma cromatografia de afinidade por quelação metálica que é descrita em WO 97/06243. Para purificar e inativar o vírus rábico a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas, um método de escolha consiste em utilizar o processo que é descrito no pedido de patente depositado na França em 14 de abril de 2009 com o número 0952310 que compreende uma etapa de cromatografia por troca de cátions sobre um suporte, compreendendo uma matriz de polimetacrilato sobre a qual são enxertados grupamentos sulfoisobutilas, uma etapa de tratamento à benzonase, uma etapa de ultracentrifugação sobre gradiente de sacarose e uma etapa de inativação com a β propiolactona. As preparações de vírus rábicos inteiros e inativados obtidos são particularmente puras, mas são mais difíceis de conservar (estabilizar), pois há muito poucas impurezas proteicas residuais. Essa dificuldade será tanto maior, quanto menores forem as quantidades de vírus na preparação vacinal.

[00048] Graças à composição do excipiente, a composição vacinal, de acordo com a invenção, permanece estável mesmo nos casos em que a concentração em proteínas totais é < 100 μg/mL, < 80 μg/mL ou mesmo < 20 μg/mL. Geralmente, as proteínas do vírus representam pelo menos 70% das proteínas totais, preferencialmente pelo menos 80% das proteínas totais e de forma particularmente preferida pelo menos 90% das proteínas totais que estão presentes na composição vacinal, de acordo com a invenção. Em uma dose eficaz de vacina isto representa habitualmente uma quantidade em proteínas totais < 100 μg/mL, < 50 μg/mL ou mesmo < 20 μg/mL. A título indicativo, a quantidade de ADN residual é quanto a ela < 100 pg, e preferencialmente < 50 pg por dose eficaz de vacina. Por "dose eficaz de vacina (ou dose eficaz de uma composição vacinal)", entende a quantidade de vírus inativados contida em uma dose que é necessária para induzir uma imunidade protetora no homem ou no animal após administração segundo a via de imunização e o protocolo de imunização que são preconizados no âmbito de uma primeira vacinação ou de uma vacinação de comanda. No caso da vacinação contra o vírus rábico, a eficácia da vacinação antirrábica é determinada por meio do teste oficial admitido pela OMS, o teste NIH (descrito na monografia sobre a raiva da OMS (WHO Technical Series Report 941 - janvier 2007). Uma dose de vacina antirrábica inativada é eficaz, quando ela contém pelo menos 2,5 UI segundo esse teste. A administração dessa dose por via intramuscular no homem, segundo os protocolos de vacinação ou de soro-vacinação habitualmente preconizados induz o desenvolvimento de uma imunidade protetora contra a raiva.

[00049] As "proteínas totais" correspondem a todas as proteínas que estão presentes na composição vacinal. Elas são representadas pelas proteínas virais, e as proteínas residuais que não foram eliminadas, quando da purificação como as proteínas celulares, as proteínas dos meios de cultura celular e de infecção viral, e as proteínas que foram eventualmente introduzidas no processo de purificação (por exemplo, a benzonase no caso do processo de purificação do vírus rábico, tal como mencionado acima). Utiliza-se geralmente o método de Bradford para quantificar as proteínas totais. Para quantificar a proporção de proteínas virais dentre as proteínas totais, realiza-se sobre uma amostra da composição vacinal uma eletroforese sobre gel de poliacrilamida em condições desnaturantes e redutora seguida de uma revelação ao azul de coomassie e de uma análise densitométrica do perfil eletroforético. No caso de uma composição vacinal contendo o vírus rábico inteiro e inativado, as proteínas virais representadas pela glicoproteína de envoltório G, a núcleo proteína N, a fosfoproteína P, a proteína matricial M e o ARN polimerase ARN dependente L são facilmente identificáveis sobre uma eletroforese em gel de poliacrilamida. A quantidade de proteínas totais contida em uma dose eficaz da composição vacinal da composição vacinal, de acordo com a invenção, é geralmente compreendida entre 1 μg e 50 μg, preferencialmente entre 2 μg e 20 μg. De forma particularmente preferida pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, ou mesmo pelo menos 90% das proteínas totais são proteínas virais. O excipiente, de acordo com a invenção, é particularmente vantajoso, já que ele estabiliza composições vacinais difíceis de conservar, tais como composições vacinais contendo vírus rábicos inteiros e inativados, e nas quais se encontra uma dose vacinal eficaz: - uma quantidade de proteínas virais que representa pelo menos 70%, proteínas totais e/ou - menos de 100 μg de proteínas totais, mais frequentemente uma quantidade de proteínas totais compreendida entre 1 μg e 50 μg, preferencialmente entre 2 μg e 20 μg.

[00050] A composição do excipiente, de acordo com a invenção, é, preferencialmente, desprovida de qualquer proteína, de qualquer peptídeo e mesmo de qualquer oligopeptídeo e geralmente não contém produto de origem animal, para diminuir ao máximo os problemas de segurança biológica e/ou alérgicos que podem ser associados à sua utilização.

[00051] No contexto da presente invenção, a expressão "o excipiente estabilizante é desprovido de qualquer proteína" deve estar compreendida como significante um excipiente estabilizante, cuja composição é desprovida de qualquer macromolécula biológica, compreendendo uma cadeia de mais de 50 aminoácidos ligados entre si por meio de ligações peptídicas. A expressão "o excipiente estabilizante é desprovido de qualquer proteína e de qualquer peptídeo" deve estar compreendida como significante um excipiente estabilizante, cuja composição é desprovida de qualquer macromolécula biológica compreendendo uma cadeia de mais de 20 aminoácidos ligados entre si, por meio de ligações peptídicas. A expressão "o excipiente estabilizante é desprovido de qualquer proteína, de qualquer peptídeo e de qualquer oligopeptídeo" deve estar compreendida como significando um excipiente estabilizante cuja composição é desprovida de qualquer molécula biológica, compreendendo aminoácidos ligados entre si por uma ou várias ligações peptídicas. Por exemplo, um dipeptídeo que contém dois aminoácidos ligados entre si por uma única ligação peptídica é excluído da composição de um excipiente estabilizante desprovido de qualquer proteína, de qualquer peptídeo e de qualquer oligopeptídeo, mas pode fazer parte da composição de um excipiente estabilizante desprovido de qualquer proteína e de qualquer peptídeo.

[00052] A mistura de aminoácidos que faz parte da composição do excipiente compreende pelo menos um aminoácido essencial no conjunto dos aminoácidos essenciais representados pela sistina, pela tirosina pela arginina, pela histidina, pela isoleucina, pela leucina, pela lisina, pela metionina, pela fenil alanina, a treonina, o triptofano e a valina e pelo menos um aminoácido não-essencial no conjunto dos aminoácidos não-essenciais representado pelo ácido aspártico, pelo ácido glutâmico, pela alanina, pela asparagina, pela glutamina, pela glicina, pela prolina e pela serina. Os aminoácidos com função ácida podem estar sob a forma de ácidos ou de sais. O mesmo acontece com os aminoácidos básicos.

[00053] Preferencialmente, o excipiente, de acordo com a invenção, contém pelo menos a arginina ou um sal de arginina, tal como o cloridrato de arginina e ácido glutâmico ou um sal de ácido glutâmico, tal como o glutamato de sódio. Em definitivo, a mistura de aminoácidos compreende, preferencialmente, de um a doze aminoácidos essenciais dentre os quais se encontra pelo menos a arginina ou um sal deste e de um a oito aminoácidos não-essenciais, dentre os quais se acha pelo menos o ácido glutâmico ou um sal deste. A concentração total em aminoácidos na composição vacinal é geralmente < 20 g/L, mais frequentemente compreendida entre 2 g/L e 10 g/L. Em uma dose eficaz da composição vacinal, de acordo com a invenção, isto representa uma quantidade total em aminoácidos essenciais e não- essenciais < 5 mg, preferencialmente a uma quantidade que está compreendida entre 0,5 e 2,5 mg e de forma particularmente preferida entre 0,8 e 1,8 mg. A razão entre a quantidade de arginina (sob a forma de cloridrato) e a quantidade total de aminoácidos contida no excipiente é em geral superior a 0,5 enquanto que a razão entre a quantidade de ácido glutâmico (sob a forma glutamato de sódio) e a quantidade total de aminoácidos contida no excipiente é inferior a 0,5.

[00054] O excipiente, de acordo com a invenção, contém também um dissacarídeo. São excluídos os dissacarídeos que são obtidos a partir de uma matéria-prima de origem animal, como o leite. Como dissacarídeo convém ao objeto da invenção, citam-se a sacarose, a maltose ou a trealose, mas preferencialmente, utiliza-se a maltose única ou em combinação com um outro dissacarídeo como a sacarose. O poliol que é também incluído na composição do excipiente é de origem não animal. Trata-se principalmente de um hexol, tal como o sorbitol e/ou o manitol. Preferencialmente, utiliza-se o sorbitol, pois o manitol tem o inconveniente de cristalizar, quando a composição vacinal, de acordo com a invenção, está sob uma forma liofilizada. A concentração total em dissacarídeo e em poliol na composição vacinal está geralmente compreendida entre 30 g/L e 100 g/L. Preferencialmente, o excipiente, de acordo com a invenção. Contém maltose e sorbitol. Em uma dose eficaz da composição vacinal isto corresponde habitualmente a uma quantidade compreendida entre 10 e 50 mg e preferencialmente a uma quantidade compreendida entre 20 e 25 mg. A quantidade de maltose representa geralmente pelo menos 70% da quantidade total de maltose e de sorbitol.

[00055] O agente quelante é também um dos componentes do excipiente, segundo a invenção. Trata-se principalmente do EDTA (Ácido etileno diamina tetra-acético) ou de um sal deste (Na+, K+, ...). A concentração em EDTA ou em sal de EDTA na composição vacinal está geralmente compreendida entre 0,02 e 0,5 g/L e preferencialmente entre 0,02 e 0,2 g/L. Em uma dose eficaz da composição vacinal isto corresponde habitualmente a uma quantidade compreendida entre 0,01 e 0,1 mg, preferencialmente entre 0,01 e 0,05 mg e de forma particularmente preferida entre 0,01 e 0,04 mg de EDTA ou de sal de EDTA.

[00056] A ureia ou um derivado da ureia, tal como a alilureia, a acetamida, o metil carbamato ou o butil carbamato faz também parte da composição do excipiente. Preferencialmente, a composição vacinal contém ureia a uma concentração geralmente compreendida entre 1 g e 10 g/L, preferencialmente a uma concentração compreendida entre 1 g e 5 g/L. Em uma dose eficaz da composição vacinal isto corresponde habitualmente a uma quantidade compreendida entre 0,3 e 3 mg, preferencialmente entre 0,3 e 1,5 mg e de forma particularmente preferida entre 0,4 e 1,2 mg de ureia.

[00057] O excipiente, de acordo com a invenção, compreendendo também um tensoativo não iônico que contribui para a estabilização da composição vacinal. Sem ser ligado pela teoria, ele contribui para a manutenção da atividade biológica do vírus e para a manutenção da integridade física das partículas virais, evitando a formação de agregados ou a degradação da estrutura dos vírus. Ele pode também evitar a adsorção do vírus sobre as paredes do acondicionamento, em particular quando as paredes são em vidro ou em plástico. O tensoativo não iônico conveniente ao objeto da invenção é produzido a partir de uma matéria-prima de origem não animal e é compatível sobre o plano farmacêutico com uma administração por via parenteral do produto. Como classe de tensoativo não iônico conveniente particularmente ao objeto da invenção, citam-se os poloxâmeros que são "copolímeros em bloco" de óxido de etileno e de óxido de propileno tendo por fórmula química HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH segundo a qual a designa o número de unidades de óxido de etileno e b designa o número de unidades de óxido de propileno. Os poloxâmeros têm um peso molecular que vai geralmente de 1000 a 16000 dáltons. Os poloxâmeros que têm um interesse particular têm um peso molecular compreendido entre 5000 e 15500 dáltons. Os poloxâmeros são comercializados notadamente pela denominação comercial de Pluronic ® dentre os quais o pluronic ® F68 ou poloxâmero 188 que designa um poloxâmero sob a forma sólida à temperatura ambiente, cujo peso molecular da parte poli óxi propileno é de aproximadamente 1750 dáltons e cuja parte polioxietileno representa aproximadamente 80% do peso total da molécula. Dentre os poloxâmeros, recomenda-se particularmente o poloxâmero 188 (pluronic ® F68). Eventualmente, pode-se utilizar um éster de sorbitano, em particular um éster poli óxi etilenado de sorbitano comercializado sob a denominação comercial de Tween ®, como o tween ® 20 (monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano ou polissorbato 20) ou o tween ® 80 (mono-oleato de polioxietileno (20) sorbitano ou polissorbato 80). O tensoativo não iônico conveniente ao objeto da invenção é utilizado a uma concentração muito baixa que preserva a estrutura e o tamanho das partículas virais inativadas que deve permanecer similar àquela dos vírus vivos. Com concentração muito forte, o tendo ativo pode dissociar ou modificar a estrutura das partículas virais em particular aquela dos vírus envolvidos, o que pode afetar a imunogenicidade da composição vacinal. Quando o pluronic ® F68 é utilizado como tensoativo, a concentração total na composição é < 1g/L, geralmente compreendida entre 0,005 g/L e 1 g/L, e de forma particularmente preferida entre 0,01 g/L e 0,1 g/L. Nessa faixa de concentração o poloxâmero 188 não exerce ação adjuvante sobre o sistema imunitário. Em uma dose eficaz da composição vacinal, isto corresponde habitualmente a uma quantidade compreendida entre 0,001 mg e 0,5 mg, e preferencialmente entre 0,03 e 0,3 mg. De forma muito preferida, a composição vacinal contém poloxâmero 188 ou eventualmente uma mistura de poloxâmero 188 e de polissorbato 20.

[00058] O tampão do excipiente, de acordo com a invenção, é escolhido d tal modo que o pH da composição vacinal esteja compreendido entre 7,0 e 10,0, preferencialmente, entre 7,0 e 9,0 e, de forma particularmente preferida, entre 7,3 e 8,3. É nessa faixa de pH que a termo-estabilidade física das partículas de vírus inativadas é máxima, em particular aquela das partículas de vírus rábico. Os estudos de diagrama de fase mostram que é preciso aquecer a preparação de vírus rábicos a uma temperatura de pelo menos 60°C para observar uma agregação das partículas de vírus rábicos, quando o pH está compreendido entre 7,3 e 8,3, enquanto que a um pH < 6,0 se observa uma agregação importante à temperatura ambiente. A solução tampão é habitualmente um tampão fosfato, um tampão Tris ou tampão HEPES, ou uma mistura destes. Sua concentração está geralmente compreendida entre 10 e 100 mM. Preferencialmente, a composição do excipiente compreende um tampão fosfato, cuja molaridade está habitualmente compreendida entre 10 e 100 mM, ou um tampão fosfato e um tampão Tris em mistura.

[00059] Uma composição vacinal particularmente preferida, de acordo com a invenção, compreende: uma preparação de vírus rábicos inteiros e inativados, e um excipiente estabilizante que compreende: • um tampão fosfato; • uma mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais contendo pelo menos a arginina ou um sal de arginina e ácido glutâmico ou um sal de ácido glutâmico; • maltose; • sorbitol; • EDTA ou um sal de EDTA; • ureia; • poloxâmero 188; • o pH da composição vacinal estando compreendido entre 7,3 e 8,3.

[00060] Eventualmente tween 20 pode ser incorporado como tensoativo não iônico adicional a essa composição vacinal. Essa composição vacinal é vantajosamente desprovida de qualquer proteína sérica e de qualquer produto exógeno de origem animal e contém geralmente uma preparação de vírus rábicos muito purificada. A concentração em poloxâmero 188 na composição vacinal é < 1 g/j e de forma muito preferida entre 0,01 g/L e 0,1 g/L. A molaridade do tampão fosfato está geralmente compreendida entre 10 e 100 mM. A arginina e o ácido glutâmico ou seus sais respectivos são os componentes muito majoritários da mistura de aminoácidos, pois representam geralmente em peso pelo menos os 2/3 da quantidade total de aminoácidos essenciais e não-essenciais. A mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais está habitualmente a uma concentração compreendida entre 2 e 10 g/L, a concentração total em maltose e sorbitol está habitualmente compreendida entre 50 e 100 g/L, a concentração em EDTA ou em sal de EDTA está habitualmente compreendida entre 0,02 e 0,2/l e ureia está a uma concentração habitualmente compreendida entre 1 e 5 g/L. A concentração em proteínas totais a composição vacinal está habitualmente entre 5 e 50 μg/mL. Em uma dose eficaz de vacina antirrábica, isto representa habitualmente uma quantidade de aminoácidos essenciais e não- essenciais compreendida entre 0,5 mg e 2,5 mg, uma quantidade de maltose e de sorbitol compreendida entre 10 e 50 mg, uma quantidade de EDTA ou de sal de EDTA compreendida entre 0,01 mg e 0,1 mg, uma quantidade de ureia compreendida entre 0,3 e 1,5 mg, uma quantidade de poloxâmero 188 compreendida entre 2 e 20 μg.

[00061] O processo de preparação de uma composição vacinal, de acordo com a invenção, além das etapas de produção, de purificação e de inativação da preparação de vírus compreende uma etapa na qual se introduz o excipiente estabilizante no preparo de vírus inteiros purificados e inativados e uma etapa de repartição da composição assim obtida em dispositivos de acondicionamento. Em geral, dilui-se a preparação de vírus no excipiente estabilizante, de acordo com a invenção, antes de repartir a composição vacinal nos dispositivos de acondicionamento.

[00062] A composição vacinal, de acordo com a invenção, pode se apresentar sob a forma de granel: nesse caso, a concentração em vírus inteiros inativados é mais elevada do que aquela que existe na composição vacinal uma repartida, mas a composição do excipiente é a mesma. O granel é conservado congelado a uma temperatura < - 35°C. A etapa de repartição da composição vacinal é feita então, descongelando-se o granel que diluir em seguida no excipiente estabilizante, de forma a se obter a concentração viral desejada. Obtém-se então o produto final granel que é em seguida repartido nos dispositivos de acondicionamento. Para garantir a esterilidade da composição vacinal, pode-se também incorporar uma etapa de filtragem esterilizante, por exemplo, sobre membrana filtrante de 0,2 μm, antes da etapa de repartição.

[00063] O granel é geralmente obtido, diafiltrando-se a preparação de vírus purificados e inativados obtida no fim da aplicação do processo de purificação em uma solução tampão que corresponde, em geral, ao tampão de excipiente. Se, por exemplo, o tampão do excipiente é um tampão fosfato 50 mM, utiliza-se um tampão fosfato 50 mM como tampão de diafiltragem. Caso se deseje aumentar a concentração em vírus a etapa de diafiltragem será precedida de uma etapa de ultrafiltragem. Utiliza-se uma membrana ultrafiltrante tendo um limite de corte baixo, compreendido geralmente entre 5 kDa e 100 kDa, preferencialmente entre 8 kDa e 50 kDa, e de forma particularmente preferida em torno de 10 kDa, de forma a reter ao máximo o vírus no retentado e eliminar os sais que podem ter um impacto negativo sobre o processo de liofilização. Mistura-se em seguida o retentado contendo a preparação de vírus com o excipiente estabilizante para se obter um granel, cuja composição corresponde à composição vacinal, de acordo com a invenção. Pode-se também utilizar como tampão de diafiltragem um tampão que tem a mesma composição que o excipiente estabilizante para se obter em uma única etapa o granel.

[00064] O processo de preparação de uma composição vacinal, de acordo com a invenção, contendo os vírus rábicos inteiros e inativados, compreende as seguintes etapas: produz-se uma preparação de vírus inteiros, coletando o sobrenadante de uma cultura de células Vero infectadas por vírus, utilizando meios de cultura celular e de infecção viral que, de preferência, são desprovidos de qualquer proteína sérica e de qualquer produto de origem animal, como, por exemplo, utilizando o meio VP SFM. Purifica-se e inativa-se o vírus, utilizando-se notadamente o processo, tal como descrito no pedido de patente depositado na França em 14 de abril de 2009 com o número 0952310 que compreende uma etapa de cromatografia por troca de cátions sobre um suporte que compreende, preferencialmente uma matriz à base de polimetacrilato sobre a qual são enxertados grupamentos sulfoisobutila, um tratamento com uma benzonase recombinante, uma etapa de ultracentrifugação sobre gradiente de sacarose e uma etapa de inativação com a β propiolactona. A preparação de vírus rábicos inteiros e inativados obtida é muito pura, e é desprovida de qualquer proteína sérica e de qualquer produto exógeno de origem animal; o teor residual em ADN é < 100 pg/meio de ligação e as proteínas virais representam pelo menos 70% das proteínas totais. Prepara-se em seguida um granel, segundo as modalidades descritas no parágrafo precedente que se conserva em geral a uma temperatura < - 35°C. Dilui-se em seguida o granel à concentração viral desejada no excipiente, segundo a invenção antes de reparti-lo nos dispositivos de acondicionamento. Introduzem-se habitualmente entre 0,1 mL e 1 mL da composição vacinal em cada dispositivo de acondicionamento, de tal modo a composição uma vez repartida contenha pelo menos uma dose eficaz de vacina. Os dispositivos de acondicionamento servindo para a repartição do produto final granel são habitualmente sob a forma de frascos (em vidro ou em plástico) ou de seringas, mas qualquer outro dispositivo de acondicionamento compatível com a prática da vacinação pode ser também utilizado.

[00065] A análise granulométrica das composições vacinais, de acordo com a invenção, contendo vírus rábicos purificados por meio do aparelho zétasizer Nano ZS (Malvern Instrument) que mede o movimento brauniano das partículas sobre a base da difusão "quase elástica" da luz (Dynamic Light scattering) mostra a existência de uma única população homogênea de partículas virais compreendida entre 100 e 300 nm com um valor médio em torno de 180 nm que corresponde ao tamanho médio do vírus rábico selvagem. Não se detectam agregados, nem modificações do perfil de distribuição do tamanho das partículas virais no decorrer da conservação das composições vacinais, de acordo com a invenção.

[00066] As composições vacinais são estáveis sob a forma líquida durante pelo menos 3 meses a uma temperatura de 2-8°C e durante pelo menos 1 mês a 23-27°C (ver exemplo 3). Elas podem ser também conservadas durante pelo menos 12 meses e preferencialmente durante pelo menos 24 meses sob a forma congelada a uma temperatura < - 35°C. As composições vacinais podem ser também conservadas sob a forma liofilizada, aplicando-se a um processo clássico de liofilização. A composição do de acordo com a invenção, não acarreta perda significativa de vírus durante a etapa de liofilização. Um método de liofilização consiste em congelar a composição a uma temperatura inferior a - 40°C, depois em secar o produto em duas etapas. A dessicação primária ocorrendo a uma temperatura próxima de - 15°C sob 80 μ árias e a dessicação secundária ocorrendo a uma temperatura próxima de + 40°C sob 80 μ bárias. As doses de vacina liofilizadas têm uma taxa residual de umidade < 3% e são estáveis a uma temperatura de 2 - 8°C durante pelo menos 18 meses (ver exemplo 3). Em definitivo, a composição vacinal antirrábica, tal como descrito na invenção se mostra tão estável quanto uma composição vacinal da técnica anterior comercializado sob a denominação de VeroraBTM que contém em uma dose de vacina uma quantidade de proteínas totais que é pelo menos 100 vezes maior que aquela que se pode encontrar em uma dose eficaz dessa composição vacinal que é geralmente < 50 μg. Por outro lado, a composição do excipiente, de acordo com a invenção, permite vantajosamente conservar duramente composições vacinais sob a forma líquida ou congelada, mesmo se a forma preferida de conservação é a forma liofilizada.

[00067] A composição vacinal é administrada diretamente no sujeito a ser vacinado, quando ela é conservada sob a forma líquida ou após descongelamento, se ela for conservada congelada. Quando ela está sob uma forma liofilizada, o liofilizado é retomado extemporaneamente em um diluente que é habitualmente uma solução salina, como, por exemplo, uma solução de cloreto de sódio hipotônico. O diluente pode conter, além disso, um tensoativo com concentração muito baixa, cuja estrutura química é compatível no plano farmacêutico com uma utilização por via parenteral trata-se habitualmente do tween ® 20, do tween ® 80, ou do pluronic ® F68 que se utiliza a uma concentração muito baixa para exercer uma ação adjuvante. A concentração do surfactante no diluente é geralmente < 0,1% (p/p).

[00068] Quando a vacina está sob uma forma liofilizada, ela se apresenta habitualmente sob a forma de um quite com dois acondicionamentos, o primeiro (geralmente sob a forma de um frasco) contém a composição vacinal, liofilizada, o segundo (geralmente sob a forma de um frasco ou de uma seringa) contém o diluente. Pode-se também utilizar uma seringa de tipo "by pass", na qual a composição vacinal se acha na parte inferior da seringa, enquanto que a parte superior contém o diluente.

[00069] A invenção tem finalmente por objeto um excipiente estabilizante para uma vacina com vírus inteiros inativados, em particular para uma vacina com vírus rábicos inteiros inativados que compreende: a. uma solução tampão; b. uma mistura de aminoácidos essenciais e não- essenciais; c. um dissacarídeo; d. um poliol; e. um agente quelante f. ureia ou um derivado da ureia, e g. um tensoativo não iônico.

[00070] De preferência, o excipiente é desprovido de qualquer proteína, preferencialmente de qualquer peptídeo e de qualquer proteína e de forma ainda mais preferida de qualquer proteína, de qualquer peptídeo e de qualquer oligopeptídeo. É também de forma muito preferida desprovido de qualquer produto de origem animal.

[00071] A presente invenção será melhor compreendida com base nos exemplos seguintes que servem para ilustrar a invenção sem para tanto limitar o conteúdo.

[00072] A figura 1 é uma superposição dos perfis de distribuição do tamanho das partículas virais obtidos por dispersão de luz ("dynamic light scattering" - DLS)" no decorrer de um ciclo de 3 descongelamentos e recongelamentos sucessivos de uma composição vacinal antirrábico na qual a composição do excipiente estabilizante é F04 + 0,001% de poloxâmero 188. • D0 (antes do congelamento); ■ D1 (após o primeiro descongelamento); ▲ D2 (após o segundo descongelamento) e + D3 (após o terceiro descongelamento).

[00073] A figura 2 é uma superposição dos perfis de distribuição do tamanho das partículas virais obtidos por "dynamic light scattering (DLS)" no decorrer de um ciclo de 3 descongelamentos e recongelamentos sucessivos de uma composição vacinal antirrábico na qual a composição do excipiente estabilizante é F04 + 0,01% de poloxâmero 188. • D0 (antes do congelamento); ■ D1 (após o primeiro descongelamento); ▲ D2 (após o segundo descongelamento) e + D3 (após o terceiro descongelamento).

Exemplo 1: Influência do excipiente sobre a estabilidade de uma composição vacinal contendo vírus rábicos purificados inativados sob a forma de granel. 1.1 Preparação do granel

[00074] A produção do vírus rábico foi realizada sobre células Vero, utilizando um meio de infecção viral sem soro. As células da linhagem Vero foram adaptadas à condições de cultura em meio sem soro conforme descrito no pedido WO 01/40443. Elas foram em seguida transferidas em um biogerador, contendo microportadores de cytodex 1 no meio VP SFM (Invitrogen). Após um período de cultura de 3 a 4 dias a 37°C mantendo um pH de aproximadamente 7.2 + 0,2, uma saturação em oxigênio de 25% + 10% e submetendo-se o meio a uma pequena agitação, as células foram infectadas com vírus rábico (cepa Pitmann - Moore) a uma multiplicidade de infecção de 0,01, utilizando um meio de infecção viral sem soro, contendo o meio VP SFM (Invitrogen). Coletou-se o sobrenadante de cultura das células infectadas nos dias D7 (R1), D11 (R2) e D15 (R3). Após cada coleta, reintroduziu-se o meio de infecção viral novo. O sobrenadante de cultura contendo o vírus infeccioso foi clarificado, utilizando-se duas filtragens sucessivas: a primeira, utilizando-se um pré-filtro em polipropileno de 8 μm (Sartopure PP2. SARTORIUS) que elimina alguns microportadores aspirados, quando da coleta, as células Vero descoladas dos suportes e os restos celulares de tamanho considerável; a segunda, utilizando-se um filtro PES, composto da combinação de dois filtros 0,8 μm e 0,45 μm (Sartopore 2, SARTORIUS) que elimina os agregados. A quantidade de vírus rábico presente nas coletas clarificadas foi determinada sobre a base da medida da quantidade de glico proteína G (gpG) feita por ELISA da seguinte maneira:

[00075] Reparte-se nos poços de uma microplaca ELISA aproximadamente 0,12 μg/100 μl de uma solução de um anticorpo monoclonal 1112-1 anti-gpG (cujas características são descritas no Journal of Clinical investigation (1989), volume 84, páginas 971 a 975) previamente diluída em um revestimento tampão (tampão de carbonato/bicarbonato 0,2 M, pH 9,6). Após uma incubação de uma noite em câmara fria, seguida de várias lavagens com um tampão de lavagem (tampão fosfato adicionado de Tween 20, 0,5%), distribuíram- se em cada poço em cada poço 100 μl de um tampão de saturação (tampão fosfato adicionado de soro de albumina bovina a 1%). Após uma incubação de uma hora a 37°C, seguida de várias lavagens, realizou-se uma faixa de diluição de cada amostra a testar em um tampão de diluição (tampão fosfato adicionado de Tween 20 a 0,05% e de soro de albumina a 0,1%). Em paralelo, realizou-se em cada microplaca uma faixa de diluição e de aferição de referência, que foi calibrado face a referência internacional do NIBSC (por exemplo PISRAV). Após uma nova incubação de uma hora a 37°C, seguida de várias lavagens, distribuíram-se em cada poço 100 μl de uma solução de um anticorpo monoclonal D1 de rato anti-gpG (cujas características são descritas em Biologicals (2003), volume 31, páginas 9 a 16) que foi biotinilado e utilizado após a diluição a 1/5000 no tampão de diluição. As placas foram deixadas durante uma hora a 37°C, depois lavadas com várias retomadas antes da distribuição em cada um dos poços 100 μl de uma solução de estreptavidina acoplada à peroxidase (Southern Biotechnology Associates) previamente diluída a 1/15000 no tampão de diluição. Após uma nova incubação de uma hora a 37°C seguida de várias lavagens, realizou-se uma faixa de diluição de cada amostra a testar em um tampão de diluição (tampão fosfato adicionado de Tween 20 a 0,05% e de soro albumina a 0,1%). Em paralelo, realizou-se em cada microplaca em uma faixa de diluição de uma aferição de referência, que foi calibrada face a referência internacional do NIBSC (por exemplo, PISRAV). Após uma nova incubação de uma hora a 37°C seguida de várias lavagens foram distribuídos em cada poço 100 μl de uma solução de um anticorpo monoclonal D1 de rato anti-gpG (cujas características são descritas em Biologicals (2003), volume 31, páginas 9 a 16) que foi biotinilado e utilizado após diluição a 1/5000 no tampão de diluição. As placas foram deixadas durante uma hora a 37°C, depois lavadas em várias retomadas, antes de distribuir cada um dos poços 100 μl de uma solução de estreptavidina acoplada à peroxidase (Southern Biotechnology Associates) previamente diluída a 1/5000 no tampão de diluição. Após uma nova incubação de uma hora a 37°C seguida de várias lavagens foram distribuídos em cada poço 100 μl de uma solução de um tampão citrato 0,05 M, pH5 contendo o substrato de revelação (O-Fenileno diamina). Após um tempo de incubação de 30 minutos à temperatura ambiente ao abrigo da luz, parou-se a reação de revelação, acrescentando-se 50 μl/poço de uma solução de H2SO4 2N. A leitura espectrofotométrica dos microplacas foi realizada com dois comprimentos de onda (492 nm e 620 nm). A densidade óptica medida é a diferença entre as duas leituras para considerar a absorção do plástico. O cálculo da atividade relativa foi feito pelo método das retas paralelas, segundo as recomendações da farmacopeia europeia. O título em vírus rábico da amostra é baseado na determinação da concentração em glicoproteína G do vírus rábico que é expressa em UI/mL em relação à referência.

[00076] Após ter também controlado a condutividade e o pH do líquido clarificado, depositou-se sobre o suporte cromatográfico Fractogel ® EMD SO3- (Merck) previamente equilibrado com o auxílio de um tampão Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH - 7,5, o equivalente de 50 UI aproximadamente de glicoproteína G (medido por ELISA) por mL de suporte. O suporte cromatográfico foi em seguida lavado com o tampão de equilíbrio, depois o vírus rábico foi purificado no tampão Tris 20 mM, NaCl 600 mM, pH - 7,5 com recuperação do pico viral em uma fração independente. Procedeu-se em seguida a uma etapa de ultrafiltragem sobre membrana PES Medium Screen 100 KD (PALL) seguida de uma diafiltragem em tampão Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH - 7,5. Acrescentou-se uma solução de MgCl2, de modo que a concentração no diafiltrado era de 2 mM. O tratamento ao benzonaso foi realizado acrescentando-se 15 U/ mL de coleta bruta ao meio reacional e deixando o meio reacional durante duas horas à temperatura do laboratório. A etapa de ultracentrifugação foi realizada sobre almofadas de sacarose 34 - 60 % com um rotor 45 tipo Ti a 21000 rpm durante 2 horas a + 5°C. As frações do gradiente contendo vírus purificado foram coletadas, reunidas, depois diluídas no tampão fosfato 50 mM NaCl 150 mM, pH - 7,5, de tal modo que o volume final da suspensão de vírus purificados era de aproximadamente 12,5 vezes menor do que o volume da coleta clarificada. A suspensão de vírus purificados foi em seguida inativada por um tratamento com a β propiolactona, seguida de uma inativação da β propiolactona por aquecimento a uma temperatura de aproximadamente 37°C, durante 2 horas. A preparação de vírus purificados e inativados foi concentrada seis vezes por ultrafiltragem sobre membrana 10 kDa (Omega médium screen PALL) seguida de uma diafiltragem em tampão fosfato 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,5. A preparação de vírus rábico obtida está sob a forma de um granel concentrado, cujo título baseado na determinação da concentração em glicoproteína G era de aproximadamente 80 UI/mL. Em seguida foi dialisada uma alíquota do granel contra um dos quatro excipientes (F01 a F04) cujas composições eram as seguintes. 1.2 Composição dos excipientes testados. F01 : tampão fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, Maltose (5% p/p), pH-8,0 F02 : tampão fosfato 50 mM, Maltose (5% p/p), pH-8,0 F03 : tampão fosfato 50 mM, Maltose (5% p/p), poloxâmero 188 (BASF) (0,001% p/p), pH-8,0 F04 : tampão 489 PM, pH-8,0, cuja composição é a seguinte:

[00077] A solução de aminoácidos essenciais foi preparada, dissolvendo o conteúdo de um frasco contendo 111,5 g de aminoácidos essenciais (Gibco, Referência 074-90680N, lote número 14773) em 5 litros de água para preparo injetável acidificado por 100 mL de HCl 12 N (Prolabo).

[00078] A solução de aminoácidos não-essenciais foi preparada, dissolvendo-se um conteúdo de um frasco contendo 40,7 g de aminoácidos não-essenciais (Gibco, Referência 074-90681 N, lote número 14775) em 5 litros de água para preparo injetável.

1.3 Testes feitos sobre as 4 formulações do granel.

[00079] O granel foi formulado nas quatro composições de excipientes testados. A estabilidade dessas quatro formulações (composições vacinais) foi avaliada no decorrer do tempo em diferentes temperaturas de conservação: - 70°C, + 5°C e a + 37°C medindo em intervalos regulares o título em glicoproteína G (expresso em UI/mL). Os resultados obtidos estão representados nas tabelas 1 a 3 e são expressos UI/mL. Tabela I: estabilidade das 4 formulações do granel a + 37°C

Tabela II: estabilidade das 4 formulações do granel a + 5°C

Tabela III: estabilidade das 4 formulações do granel a - 70°C

*: F01, F02. F03 e F04 fazem referência à composição dos excipientes nos quais foi formulado o granel. ** : em UI/mL.

[00080] Esses resultados mostram que o excipiente F04 é aquele que estabiliza melhor a preparação de vírus rábicos purificados e inativados em particular, quando a temperatura de conservação aumenta. Isto mostra também que um excipiente que compreende um açúcar (maltose) e um surfactante não iônico, tal como o poloxâmero 188 em uma solução tamponada com pH de 8,0 não basta para estabilizar eficazmente uma preparação de vírus rábico.

Exemplo 2: Papel do surfactante na estabilização de composições vacinais contendo vírus rábico purificado. 2.1 Preparação das composições vacinais

[00081] Uma suspensão de vírus rábicos purificado foi obtida, utilizando-se o mesmo processo que aquele utilizado no exemplo 1. Após a etapa de centrifugação, a preparação de vírus purificado estava sob uma forma muito concentrada. A concentração em proteínas totais era de 7 mg/mL, utilizando-se o método de Bradford. Essa preparação de vírus foi repartida em três recipientes em polipropileno, depois diluída em três excipientes diferentes que se buscava avaliar por seu papel estabilizante, de modo que a concentração final em proteínas totais em cada um dos excipientes testados foi diminuída para 10 μg/mL (fator de diluição 1/700). A composição dos três excipientes testados diferia apenas por seu conteúdo em poloxâmero 188, mas continha todo o tampão 489 PM, pH = 8,0, cuja composição é descrita no exemplo 1. O excipiente sem poloxâmero 188 tinha a mesma composição que o excipiente F04 descrito no exemplo 1. Os dois outros excipientes foram suplementados respectivamente com 0,01 g/L de poloxâmero 188 (excipiente denominado F04 + 0,01% poloxâmero) e com 0,1 g/L de poloxâmero 188 (excipiente denominado F04 + 0,1% poloxâmero).

2.2 Estudos de estabilidade e resultados

[00082] A estabilidade das três composições vacinais foi avaliada, colocando-os em condições de conservação desfavoráveis, isto é, submetendo-os a uma sucessão de congelamentos e descongelamentos, conforme o seguinte protocolo.

[00083] As três composições vacinais foram congeladas a - 70°C no mesmo dia (dia D0). Cada uma das três composições foi em seguida submetida a três descongelamentos a + 5°C seguidos de um recongelamento a - 70°C nas sete às 14 horas, segundo o descongelamento nos dias 1, 2 e 3 (respectivamente D1, D2 e D3). A estabilidade das composições vacinais após cada descongelamento foi avaliada, medindo-se a concentração proteica viral total. A medida foi efetuada, utilizando-se a tecnologia BIAcore que se baseia na utilização da ressonância plasmônica de superfície. Analisou-se também o perfil de distribuição do total das partículas no decorrer dos descongelamentos sucessivos, aplicando-se a técnica de difusão quase elástica da luz (Dynamic Light Scattering ou ainda tecnologia DLS).

[00084] Para aplicar a tecnologia BIAcore, tem-se em um primeiro tempo acoplado por ligação de covalência o anticorpo monoclonal D1 de rato anti-gpG a um sensor chip, utilizando-se o quite de acoplamento fornecido pelo fabricante (kit de acoplamento de amina de referência, BR-1000-50). Em seguida, 30 μl da amostra a analisar foram automaticamente injetados no aparelho em um período de tempo de 3 minutos. A interação do vírus rábico presente na amostra com o anticorpo monoclonal fixado sobre o sensor acarretou uma modificação do índice de refração à superfície do sensor chip, traduzindo-se por uma modificação do sinal registrado (RU). Os resultados obtidos foram registrados em unidades arbitrarias (ΔRU) e foram comparados com os resultados obtidos com uma faixa de aferição de uma referência que continha uma quantidade como vírus rábicos purificados. O ΔRU medido para cada amostra foi convertido em concentração proteica viral total sobre a base da curva de aferição obtida com a referência. Para cada amostra testada, as medidas foram feitas quatro vezes (em quadruplicata). Após cada medida, o sensor chip foi limpo, efetuando-se duas injeções sucessivas de 10 μl de um tampão Glicina (10 mM, pH = 1,5). Os resultados obtidos para cada composição vacinal testada estão representados na tabela IV. Os valores são expressos em μg/mL de proteínas virais. Tabela IV: Estudo da estabilidade das 3 composições vacinais no decorrer de um ciclo de 3 descongelamentos e recongelamentos sucessivos.

1 : título médio em proteínas virais obtido sobre a base de quatro medidas feitas sobre a amostra testada em μg/mL. 2 * : desvio padrão calculado sobre a base das quatro medidas feitas sobre a amostra testada é indicado entre parênteses.

[00085] Esses resultados mostram, de forma clara, que o excipiente F04, na ausência de poloxâmero, é incapaz de preservar de forma eficaz a preparação de vírus rábicos, depois a perda em título viral é de 88% entre o título no D0 e o título medido após o terceiro descongelamento (D3). Ao contrário, visto que o excipiente F04 é muito ligeiramente suplementado com poloxâmero 188, a perda em título viral é muito diminuída (é de 33%, quando F04 é suplementado com 0,001 g/L de poloxâmero 188 e de 23%, quando F04 é suplementado com 0,01 g/L de poloxâmero 188). Esses resultados mostram que o excipiente devem conter, ao mesmo tempo, os componentes que estão presentes no tampão 489 PM e do poloxâmero 188 para conservar eficazmente uma composição vacinal contendo o vírus rábico.

[00086] O perfil de distribuição do tamanho das partículas de cada uma das três composições vacinais foi também analisado após cada descongelamento por DSL, utilizando o aparelho Zetasizer Nano Zs (Malvern Instrument). São introduzidos em uma cuba de uso único em poliestireno 450 μl da amostra a analisar que se submeteu em seguida a uma radiação laser monocromático (laser HeNe, À = 632,8 nm). O sinal registrado pelo aparelho correspondia às flutuações da luz dispersada resultante do movimento Browniano das partículas. Os dados registrados foram tratados por um programa.

[00087] Os resultados foram finalmente representados sob a forma de uma curva de distribuição do tamanho das partículas para cada amostra testada. As duas figuras representam uma superposição das 4 curvas de distribuição do tamanho das partículas que foram obtidas respectivamente com uma composição de vírus rábicos estabilizada com o excipiente F04 + 0,001% poloxâmero 188 nos dias D0 (antes do congelamento), D1, D2 e D3 (figura 1), e com uma composição de vírus rábicos estabilizada com o excipiente F04 + 0,01% poloxâmero 188 (figura 2).

[00088] As duas figuras mostram claramente que: 1) as curvas de distribuição do tamanho das partículas são unimodais e têm um perfil gaussiano, cuja mediana se situa a aproximadamente em 180 nm. Isto significa que a população das partículas virais na composição vacinal estabilizada com o excipiente F04 + 0,001% de poloxâmero 188 ou o excipiente F04 + 0,01% de poloxâmero 188 é homogêneo, não contém agregados e compreende uma população de vírus rábicos inteiros similar à população de vírus rábicos selvagens; e 2) as curvas de distribuição do tamanho das partículas não são modificadas, quando as composições vacinais de vírus rábicos são submetidas a vários descongelamentos e recongelamentos sucessivos.

[00089] A presença de um tensoativo não iônico, tal como o poloxâmero 188 na composição do excipiente preserva também a integridade física da população de vírus rábicos, mesmo quando a composição vacinal é colocada em más condições de conservação.

2.3 Estudos de estabilidade sobre composições vacinais liofilizadas 2.3.1 Preparação das composições vacinais liofilizadas

[00090] Um granel foi inicialmente preparado a partir de uma preparação de vírus purificados inteiros inativados que foi obtida utilizando-se o processo descrito no exemplo 1. Após a etapa de inativação viral, a preparação de vírus rábicos purificados e inativados foi diafiltrada sobre uma membrana de 10 kDa (Omega médium screen PALL), utilizando-se um excipiente denominado 488 TM que foi preparado a partir de um meio 488 cuja composição é a seguinte (ver tabela abaixo).

[00091] A mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais foi preparada, misturando-se dois litros e meio da solução de aminoácidos essenciais, preparada, segundo o exemplo 1 com dois litros e meio da solução de aminoácidos não-essenciais preparada segundo o exemplo 1 e ajustando-se o pH a aproximadamente 7,2 por meio de uma solução de soda a 30%.

[00092] A composição do excipiente 488 TM é a seguinte:

[00093] A preparação vacinal obtida estava sob a forma de um granel no excipiente 488 TM cujo título viral baseado na determinação por ELISA da concentração em glicoproteína G estava a aproximadamente 12 UI/mL. O granel foi em seguida conservado sob a forma congelada a - 70°C até o momento do preparo das composições vacinais liofilizadas.

[00094] Exatamente antes da etapa de liofilização uma parte do granel foi descongelada e diluída para levar o título final em glicoproteína G a aproximadamente 8 UI/ mL utilizando: - seja o excipiente F'04 cuja composição contém um volume do excipiente 488 TM para três volumes de tampão fosfato 50 mM, a concentração em maltose sendo ajustado a 50 g/L, pH = 8,0; - seja o excipiente F'05 que é idêntico ao excipiente F'04, mas ao qual se acrescentou poloxâmero 188 a uma concentração final de 0,01 g/L.

[00095] Em seguida repartiu-se as duas composições vacinais em frascos de liofilização à razão de 0,4 mL/frasco, depois se realizou um ciclo de liofilização clássico, compreendendo uma fase de congelamento a uma temperatura < - 40°C seguida de duas fases de dessicação sucessivas, a primeira fase de dessicação sendo realizada a uma temperatura de aproximadamente - 15°C sob uma pressão de aproximadamente 80 μ bárias e a segunda a uma temperatura de aproximadamente + 40°C sob uma pressão de aproximadamente 80 μ bárias.

[00096] Cada frasco de liofilização continha uma dose da composição vacinal a testar. As composições vacinais liofilizadas obtidas diferiam somente pela presença ou não do surfactante, segundo o fato de o granel ter sido diluído no excipiente F'04 ou F'05.

[00097] Indicou-se abaixo a composição do excipiente contido em uma dose da composição vacinal sob a forma liofilizada preparada a partir do excipiente F'05.

2.3.2: Eficácia das composições vacinais liofilizadas

[00098] As duas composições vacinais liofilizadas que foram preparadas, utilizando dois excipientes estabilizantes diferentes foram em seguida testadas para sua eficácia, utilizando o teste oficial NIH. Analisou-se "a eficácia" das duas composições vacinais liofilizadas, seja imediatamente após a liofilização (D0), seja após conservação de uma semana a 45°C, seja também após conservação de um mês a 37°C. Utilizou-se um único teste de atividade oficialmente reconhecido, o teste NIH, que permite determinar o número de UIs contidas em cada uma das doses das composições vacinais testados. Se o número de UIs é > 2,5 UI a dose de vacina testada é eficaz. O teste NIH foi feito cada vez em "dobro" para cada uma das condições testadas, coletando-se ao acaso dos frascos liofilizados no lote de frascos preparados e conservados nas mesmas condições e efetuando-se sobre essas coletas um teste NIH. O protocolo utilizado corresponde à monografia 0216 da Farmacopeia Europeia. Esse teste é um teste de prova realizado no rato, baseado na comparação da proteção conferida pela dose de vacina testada com aquela conferida por uma quantidade conhecida de uma vacina antirrábica de referência. A vacina antirrábica de referência é calibrada em unidades internacionais (UI). A unidade internacional (UI) é a atividade contida em uma quantidade determinada de um padrão internacional. A equivalência em UI do padrão internacional foi estabelecido pela OMS. Após ter verificado que os parâmetros de controle do teste de eficácia eram bem respeitados, determinou-se a partir dos valores da dose protetora 50% obtida para cada coleta testada e para a preparação de referência (calibrado em UIs), o número de UIs que ficam contidas na dose de vacina testada.

[00099] Os resultados obtidos estão representados na tabela V abaixo. Tabela V: eficácia das composições vacinais liofilizadas em função da composição do excipiente de liofilização utilizado em condições de conservação.

* : valor médio expressa em UI obtidas (todos os grupos de ratos que foram testados contém 16 ratos). ** : representa os valores extremos obtidos expressos em UI. NT : não testado

[000100] Esses resultados estão em acordo com os resultados discutidos no parágrafo precedente (2.2) e mostram que o poloxâmero 188 deve ser incluído na composição do excipiente utilizado para conservar as composições vacinais liofilizadas. Com efeito, só as composições vacinais liofilizadas que contém o excipiente F'05 (que contém poloxâmero 188) contém uma dose eficaz de vacina, já que o valor médio em UI é superior a 2,5 UI. Essas composições vacinais continuam estáveis já que sua eficácia não é diminuída no decorrer do tempo nas condições de conservação que foram testados.

[000101] Para resumir, os resultados que são apresentados no exemplo 2 mostram que as composições vacinais contendo vírus rábico podem ser bem conservadas com um excipiente estabilizante, cuja composição compreende um tampão fosfato uma mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais, um açúcar, tal como a maltose, um poliol, tal como o sorbitol, do EDTA, da ureia em combinação com surfactante não iônico, tal como o poloxâmero 188. Além disso, e de forma interessante, "o efeito estabilizante" do poloxâmero 188 é exercido a uma concentração muito pequena que é muito baixa para que o poloxâmero 188 possa ativar o sistema imunitário ou agir como adjuvante da resposta imune.

Exemplo 3: Estudo da estabilidade de composições vacinais contendo o vírus rábico purificado e inativado.

[000102] Os exemplos 1 e 2 tendo mostrado a importância de combinar os compostos de um excipiente que compreende uma mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais, a maltose, o sorbitol, o EDTA, a ureia em um tampão à base de fosfato e/ou de Tris com poloxâmero 188, a finalidade dos estudos apresentados no caso era de confirmar que essa combinação estabilizava eficazmente composições vacinais de vírus rábicos sob diferentes formas (líquida, congelada ou liofilizada) em uma ampla faixa de temperatura de conservação (+ 37°C, + 25°C, + 5°C, - 70°C) e em um longo período de tempo. Esses estudos foram realizados em várias composições vacinais de vírus rábicos que foram conservados sob a forma de um granel congelado a uma temperatura < - 35°C, sob a forma de um produto final granel líquido a + 5°C ou sob a forma de doses unitárias liofilizadas conservadas a + 5°C, + 25°C ou + 37°C.

3.1 Estudos da estabilidade de lotes de vacinas antirrábicas sob a forma de granel congelado.

[000103] O vírus rábico que serve ao preparo de lotes de granel foi preparado segundo o processo tal como descrito no exemplo 1. Após a etapa de inativação viral, a preparação de vírus purificado e inativado foi diafiltrada sobre uma membrana de 10 kDa, utilizando-se como tampão de diafiltragem um tampão de diafiltragem um tampão fosfato 50 mM. Em um segundo tempo, misturou-se um volume de retentado com um volume de excipiente de estabilização cuja composição é aquela do tampão 489 PM descrito no exemplo 1 (fora o fato que a concentração de cada um dos componentes é duas vezes mais importantes) ao qual foi acrescentado poloxâmero 188 à concentração de 0,02 g/L, pH ~ 8,0. Obteve-se assim um granel tendo uma concentração em proteínas totais de 50 μg/meio de ligação dentre as quais mais de 70% são proteínas do vírus rábico e que contém menos de 100 pg/mL de ADN residual. Estudou-se a estabilidade do granel no decorrer de tempo, após conservação a - 35°C e - 70°C medindo a cada três meses o título em glicoproteína G. Os resultados obtidos são apresentados na tabela VI abaixo. Tabela VI: Estabilidade de um lote de granel conservado a - 35°C ou a - 70°C.

* : título expresso em UI/mL NT : não testado

[000104] Após 12 meses de estocagem a - 35°C ou a - 70°C não se observa degradação da glicoproteína G que é o antígeno maior do vírus rábico o que confirma a boa estabilidade da composição vacinal sob a forma de granel congelado. Além disso, a análise da distribuição do tamanho das partículas virais por DLS após uma conservação de 12 meses a - 35°C ou a - 70°C mostraram que os perfilados conservavam um transcorrer gaussiano centrado em um valor mediano de 180 nm (perfis similares àqueles das figuras 1 e 2). Não há fragmentação dos perfis, indicando a presença de agregados virais. Os resultados mostraram também que a população de partículas de vírus rábicos não se modificava no decorrer do tempo. Não se observa degradação, nem agregação das partículas virais no decorrer do tempo. 3.2: Estudos da estabilidade de lotes de vacinas antirrábicas sob a forma de produto final granel (PFV) líquido.

[000105] Foram preparados 3 lotes de vacinas sob a forma de PFV líquido a partir de 3 lotes de granel, após diluição no tampão 489 PM (composição descrita no exemplo 1) ao qual se acrescenta poloxâmero 188 a uma concentração final de 0,01 g/L, pH ~ 8,0. Eles continham menos de 100 pg/mL de ADN residual (medido por PCR quantitativo). A concentração em proteínas totais era de aproximadamente 15 μg/mL e mais de 70% das proteínas totais estavam representadas por proteínas virais após análise densitométrica da eletroforese sobre gel de poliacrilamida. A estabilidade dos lotes de PFV conservados a + 5°C e a + 25°C foi estudada, medindo-se em intervalos regulares a taxa de glicoproteína G por ELISA sobre um período de tempo de 3 meses para os lotes de PFV conservados a + 5°C e no período de tempo de 30 dias para os lotes de PFV conservados a + 25°C. Os resultados obtidos expressos em UI/mL estão reunidos nas tabelas VII e VIII a seguir: Tabela VII: Estabilidade de 3 lotes de PFV conservados a + 5°C

Tabela VIII: Estabilidade dos 3 lotes de PFV conservados a + 25°C

[000106] Esses resultados mostram que não há degradação da glicoproteína G no decorrer da conservação dos lotes de PFV sob a forma líquida a + 5°C e a - 25°C durante os períodos de tempo estudados. Isto confirma que as vacinas antirrábicas podem ser conservadas sob a forma líquida ao frio (+ 5°C) durante pelo menos 3 meses e à temperatura ambiente (+ 25°C) durante pelo menos 30 dias, sem observar degradação do vírus. 3.3: Estudos da estabilidade de lotes de vacinas antirrábicas sob a forma liofilizada

[000107] 2 lotes de vacinas antirrábicas sob a forma liofilizada (LL1 e LL2) foram preparados a partir dos lotes de PFV do exemplo 3.2 que foram repartidos em frascos de liofilização em vidro à razão de 0,3 mL/frasco antes de proceder a um ciclo de liofilização no decorrer do qual o congelamento foi realizado a uma temperatura < 40°C, a fase de dessicação primária a uma temperatura próxima de - 15°C sob uma pressão de aproximadamente 80 μ bárias até sublimação completa do gelo e a fase de dessicação secundária a uma temperatura próxima de + 40°C sob uma pressão de aproximadamente 80 μ bárias até que a taxa de umidade residual seja de < 3% nos liofilizados. As perdas em título viral, quando da etapa de liofilização foram de < 5%.

[000108] A composição do excipiente contido em uma dose vacinal sob a forma liofilizada é a seguinte:

[000109] As doses unitárias liofilizadas obtidas tinham um aspecto homogêneo branco. O pH da suspensão de vírus rábicos após retomada dos liofilizados por 0,5 mL de uma solução de cloreto de sódio a 0,4% se situava em uma faixa de 7, 8 + 0,5. Estudou-se a estabilidade dos dois lotes liofilizados durante o tempo a três temperaturas de conservação: 35 - 39°C, 23 - 27°C e 2 - 8°C, verificando o aspecto dos liofilizados antes e depois da reconstituição, medindo a umidade residual, controlando-se o pH, o título viral e testando a eficácia das doses liofilizadas no teste NIH. A primeira diluição das faixas de diluição que foram realizadas para testar as doses liofilizadas no teste NIH, após retomada no cloreto de sódio foi realizada em uma solução de cloreto de sódio a 0,9% contendo 2 g/L de albumina humana.

[000110] Os títulos virais foram medidos com base na taxa de glicoproteína G por ELISA e expressos em UI/mL.

[000111] Os resultados dos testes referentes ao aspecto dos liofilizados e de medida da unidade residual e de pH estavam todos de acordo com as especificidades (isto é, um aspecto branco homogêneo para o liofilizado, uma solução límpida incolor após reconstituição em soro fisiológico hipotônico e uma taxa de umidade residual ( < 3%) independentemente da temperatura e da duração de conservação testada. O pH permaneceu estável em uma faixa de 7,8 + 0,5 por toda a duração dos estudos de estabilidade.

[000112] Os resultados referentes aos títulos e testes de eficácia (NIH) realizados em doses unitárias são reunidos nas tabelas IX a XI abaixo:

Tabela X: estabilidade dos dois lotes de vacinas antirrábicas conservadas sob a forma liofilizada a + 25°C

Tabela XI: estabilidade dos dois lotes de vacinas antirrábicas conservadas sob a forma liofilizada a + 37°C

M : significa mês ND: significa não determinado 1 : valor expresso em UI/mL. 2 * : valor médio expresso em número de UI completado pelos valores extremos observados indicados entre parênteses.

[000113] O conjunto desses resultados confirma que as vacinas antirrábicas conservadas sob a forma liofilizada permanecem muito estáveis e não perdem em eficácia no decorrer do tempo nas condições de temperatura testadas. Os títulos em glicoproteínas G e os valores do teste NIH (nitidamente superiores a 2,5 UI) permanecem estáveis no decorrer do tempo.

[000114] Em conclusão, todos os testes de estabilidade utilizados sobre lotes de vacinas antirrábicas conservadas sob a forma congelada, sob a forma líquida ou sob a forma liofilizada mostram que esses lotes permanecem estáveis no decorrer do tempo nas condições de temperatura testadas. Isto confirma que um excipiente, cuja composição compreende um tampão, uma mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais, maltose, sorbitol, EDTA, ureia e poloxâmero 188 estabiliza eficazmente uma composição vacinal antirrábica, independentemente de sua apresentação (congelada, líquida ou liofilizada) e em uma ampla faixa de temperaturas de conservação.

Claims

1. Composição vacinal, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma preparação de vírus rábicos inteiros inativados, e (b) um excipiente estabilizante que compreende: (i) uma solução tampão; (ii) uma mistura de aminoácidos essenciais e não- essenciais; (iii) um dissacarídeo; (iv) um poliol; (v) um agente quelante; (vi) ureia ou um derivado da ureia, e (vii) um tensoativo não iônico.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é desprovida de qualquer proteína sérica.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que é desprovida de qualquer proteína exógena de origem animal e, preferencialmente, desprovida de qualquer produto exógeno de origem animal.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as proteínas dos vírus representam de 70% a 99,99% das proteínas totais que estão presentes na composição vacinal.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a concentração em proteínas totais é < 100 μg/mL e, preferencialmente, < 80 μg/mL.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a quantidade de proteínas totais que está contida em uma dose eficaz da composição vacinal é < 100 μg.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a quantidade de proteínas totais que está contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 1 e 50 μg.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o excipiente estabilizante é desprovido de qualquer proteína e de qualquer outro peptídeo ou, preferencialmente, desprovido de qualquer proteína, de qualquer peptídeo e de qualquer oligopeptídeo.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a mistura de aminoácidos essenciais e não-essenciais compreende pelo menos a arginina ou um sal de arginina e ácido glutâmico ou um sal de ácido glutâmico.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a quantidade de aminoácidos essenciais e não-essenciais contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 0,5 e 2,5 mg.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o dissacarídeo é maltose.

12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o poliol é sorbitol.

13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a quantidade total de dissacarídeo e de poliol contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 10 e 50 mg.

14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o agente quelante é EDTA ou um sal de EDTA.

15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a quantidade de agente quelante contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 0,01 e 0,1 mg.

16. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a quantidade de ureia ou de derivado da ureia contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 0,3 e 1,5 mg.

17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que o tensoativo não iônico é um poloxâmero.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o tensoativo não iônico é o poloxâmero 188.

19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a quantidade de tensoativo não iônico contida em uma dose eficaz da composição vacinal está compreendida entre 0,001 e 0,5 mg.

20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o pH da composição vacinal está compreendido entre 7,0 e 10,0 e, de preferência, entre 7,0 e 9,0.

21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a solução tampão é um tampão fosfato, um tampão Tris, um tampão HEPES ou uma mistura destes.

22. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que a solução tampão é um tampão fosfato, cuja molaridade está compreendida entre 10 e 100 mM.

23. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que o excipiente estabilizante compreende: (i) um tampão fosfato, (ii) uma mistura de aminoácidos essenciais e não- essenciais, contendo pelo menos arginina ou um sal da mesma e ácido glutâmico ou um sal do mesmo, (iii) maltose, (iv) sorbitol, (v) EDTA ou um sal do mesmo; (vi) ureia, e (vii) poloxâmero 188.

24. Composição de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que, em uma dose eficaz da vacina rábica: a quantidade de aminoácidos essenciais e não-essenciais está entre 0,5 mg e 2,5 mg, a quantidade de maltose e sorbitol está entre 10 mg e 50 mg, a quantidade de EDTA ou um sal do mesmo está entre 0,01 mg e 0,1 mg, a quantidade de ureia está entre 0,3 mg e 1,5 mg, e a quantidade de poloxâmero 188 está entre 0,001 mg e 0,5 mg.

25. Processo de preparação de uma composição vacinal contendo uma preparação de vírus rábicos inteiros purificados e inativados, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) produzir uma preparação de vírus inteiros pela coleta do sobrenadante de uma cultura de células infectadas por vírus; (b) purificar e, então, inativar a preparação de vírus inteiros ou, alternativamente, inativar e purificar a preparação de vírus inteiros; e (c) diluir a preparação de vírus inteiros purificados e inativados em um excipiente estabilizante, cuja composição compreende: (i) uma solução tampão; (ii) uma mistura de aminoácidos essenciais e não- essenciais; (iii) um dissacarídeo; (iv) um poliol (v) um agente quelante; (vi) ureia ou um derivado da ureia; e (vii) um tensoativo não iônico.

26. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que é realizado sem introduzir qualquer produto exógeno de origem animal.

27. Processo de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que, após ter diluído a preparação de vírus inteiros purificados e inativados, a composição vacinal resultante é dividida em dispositivos de acondicionamento.

28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a composição vacinal é liofilizada.

29. Composição vacinal liofilizada, caracterizada pelo fato de que contém uma preparação de vírus inteiros purificados e inativados obtida a partir do processo como definido na reivindicação 28.