CN102276610A - N7-鸟嘌呤烷化物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种N7-鸟嘌呤烷化物的制备方法，该方法是以2′-脱氧鸟苷为原料，以碘乙烷、环氧乙烷、1-溴-2-氯乙烷、3-溴丙烯或1，2-二溴乙烷作为烷化剂，在二甲基亚砜、冰醋酸或二甲基乙酰胺溶液中，于15～50℃，反应0.5～96h，反应完毕后进行减压蒸馏，粗产品经硅胶柱层析分离纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝10～20∶1和乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝10～20∶1洗脱液分别洗脱，得到N7-鸟嘌呤烷化物。本发明方法具有反应条件温和、分离纯化过程简单、产物收率高、对环境污染较少等优点，有利于N7-鸟嘌呤烷化物的大量生产。
Description
技术领域
本发明涉及一类DNA碱基修饰物的制备方法，具体涉及N7-鸟嘌呤烷化物的制备方法。
背景技术
碱基修饰是DNA损伤的一种重要形式。外源化学致癌物或者药物进入生物体内后，与细胞内的DNA发生作用生成各种不同结构的碱基修饰产物，造成DNA分子结构和稳定性的变化，进而可能导致DNA断链、交联、碱基错误配对等损伤。碱基的烷化修饰是DNA在亲电试剂作用下生成的一种常见损伤产物，一些致癌物就是通过导致DNA碱基的烷化修饰而诱发癌症的。碱基烷化产物一般都形成于碱基的亲核部位，其中鸟嘌呤的N7位是亲核位点中最活泼的。N7-鸟嘌呤烷化物是一类极为重要的DNA损伤产物，其结构式如式(I)所示，其中R表示-CH2CH3、-CH2CH2OH、-CH2CH2Cl、-CH2CH＝CH2或-CH2CH2Br。
N7-鸟嘌呤烷化物是致癌或者抗癌过程中的重要分子标记物，其在动物体内的生成机理、分析检测方法和体外制备方法是化学、药学和毒理学领域的热点问题。比如，亚硝胺是一类重要的致癌物质，研究表明其在细胞色素P450作用下代谢活化生成α-羟基亚硝胺，然后经分解生成活泼亲电试剂烷基重氮盐离子，进而导致鸟嘌呤的烷化损伤。烟草特异亚硝胺4-(N-亚硝基甲氨基)-1-3-(吡啶基)-1-丁酮(NNK)是一种强致癌物，能够导致肺癌，Hecht(S.S.Hecht，Chem.Res.Toxicol.，1998，11：559～603)的研究表明NNK致癌的作用与导致DNA生成N7-鸟嘌呤烷化物有关。Mathison等(B.H.Mathison，et al.Toxicol.Appl.Pharm.，1994，127(1)：91～98)将异烟肼、肼苯哒嗪和甲醛分别与小牛胸腺DNA反应，在反应混合液中均发现了N7-甲基鸟嘌呤的生成。动物实验表明，肼类化合物在体内经甲酰化后生成腙进而分解生成甲基化中间体与DNA作用生成N7-甲基鸟嘌呤和O6-甲基鸟嘌呤。烯烃类化合物在P450的作用下代谢成相应的环氧烷，进而与DNA反应生成N7-鸟嘌呤烷化物。一些药物也能够导致DNA碱基的烷化修饰，比如临床上用于治疗淋巴瘤的氮芥和用于治疗脑瘤的亚硝基脲，均能够导致鸟嘌呤烷化进而引起DNA交联。Osborne等(M.R.Osborne，et al.Chem.Res.Toxicol.，1995，8：316～320)研究表明，N，N-2-氯乙基甲胺可诱导大马哈鱼睾丸DNA生成两种N7-鸟嘌呤烷化物和以其为中间体的两种交联物。Bodell(W.J.Bodell，J.Neuro-oncology，2009，91(3)：257～264)报道氯乙基亚硝基脲和DNA反应能生成13种DNA损伤产物，其中包括碱基烷化修饰物N7-(2-羟乙基)鸟嘌呤和N7-(2-氯乙基)鸟嘌呤，并且这两种烷化物的含量明显高于其它烷化产物，说明鸟嘌呤N7位最容易受到烷基重氮盐离子的进攻。
现有文献中报道的DNA碱基烷化修饰物的制备方法包括以下两个步骤：1、以DNA核苷为原料，加入过量的烷化剂，以二甲基甲酰胺为溶剂，加热反应，经葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，向分离出的溶液中加入浓氨水，即有沉淀物析出，然后过滤沉淀物。2、酸解沉淀物，进行脱糖反应，经高效液相色谱分离得到目标化合物。该方法存在的问题如下：
(1)所用溶剂对核苷的溶解性不好，易造成反应不完全，影响产率；
(2)制备过程中需要经过葡聚糖凝胶柱层析和高效液相色谱两次分离纯化，产物损失较多，产率低，分离过程复杂；
(3)洗脱液用量大，对环境污染严重；
(4)使用葡聚糖凝胶柱层析和高效液相色谱成本高、产品纯化量少，不利于大量生产。
发明内容
本发明的目的是提供了一种简单方便、原料易得、收率高的N7-鸟嘌呤烷化物的制备方法，主要解决了现有制备方法存在的制备过程繁琐、分离纯化复杂、产率低、适用性不广等技术问题。
本发明所提供的N7-鸟嘌呤烷化物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将2’-脱氧鸟苷1～3mmol溶于有机溶剂，超声1～2min；
(2)待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，加入烷化剂碘乙烷、环氧乙烷、1-溴-2-氯乙烷、3-溴丙烯或1，2-二溴乙烷，2’-脱氧鸟苷与烷化剂的摩尔比为1∶2～15，控制反应温度在15～50℃，反应0.5～96h；
(3)反应完毕后，控制温度在15～40℃进行减压蒸馏，除去溶剂；
(4)将得到的粗产品用硅胶柱层析法进行分离纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝10～20∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝10～20∶1洗脱液洗脱，即可得到式(I)所示化合物，
其中R表示-CH2CH3、-CH2CH2OH、-CH2CH2Cl、-CH2CH＝CH2或-CH2CH2Br。
上述步骤(1)中所述有机溶剂为二甲基亚砜、冰醋酸或二甲基乙酰胺。
上述步骤(2)中2’-脱氧鸟苷与烷化剂的摩尔比优选1∶5～10。
上述步骤(2)中反应温度优选25～37℃。
上述步骤(2)中反应时间优选1～72h。
上述步骤(3)中减压蒸馏温度优选23～35℃。
上述步骤(4)中优选用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝12～18∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝12～18∶1洗脱液洗脱。
其反应路线为：
本发明采用2’-脱氧鸟苷为原料，通过简便可控的反应制得N7-鸟嘌呤烷化物，该方法相比现有技术，具有以下优点：
(1)所选有机溶剂对2’-脱氧鸟苷的溶解性好，有利于原料的反应完全；
(2)反应条件温和，操作过程简单，收率高；
(3)无需中间产物的分离纯化，既节约了洗脱剂、减轻了环境污染，又降低了分离过程中的产物损失；
(4)用硅胶柱层析分离纯化，成本低，分离过程简单，有利于N7-鸟嘌呤烷化物的大量生产。
具体实施方式
实施例1 N7-乙基鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷300mg(1.12mmol)和二甲基乙酰胺6mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声1min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入碘乙烷0.6mL(7.42mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于25℃反应24h，反应完毕后，23℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝12∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝12∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-乙基鸟嘌呤189mg，产品为黄色固体，收率为95.3％。
UVλ：245，284nm；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.78～1.74(m，3H，CH3)，3.87～3.84(m，2H，CH2)，6.16(s，2H，NH2)，7.82(s，1H，CH)，11.00(s，1H，NH)；MS(ESI)：m/z 180(M+H+)。
实施例2 N7-乙基鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷360mg(1.35mmol)和二甲基乙酰胺9mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声1.5min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入碘乙烷1mL(12.37mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于25℃反应20h，反应完毕后，25℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝15∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝15∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-乙基鸟嘌呤234mg，产品为黄色固体，收率为97.5％。产物的紫外、核磁和质谱数据同实施例1。
实施例3 N7-(2-羟乙基)鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷480mg(1.80mmol)和冰醋酸9mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声2min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入环氧乙烷0.6mL(11.86mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于37℃反应1h，反应完毕后，35℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝15∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝12∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-羟乙基鸟嘌呤339mg，产品为白色固体，收率96.6％。
UVλ：247，284nm；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.73～3.69(m，2H，CH2)，4.14～4.12(m，2H，CH2)，6.39(s，2H，NH2)，8.08(s，1H，CH)，10.67(s，1H，NH)；MS(ESI)：m/z 196(M+H+)。
实施例4 N7-(2-羟乙基)鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷450mg(1.69mmol)和冰醋酸7mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声2min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入环氧乙烷0.5mL(9.89mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于37℃反应30min，反应完毕后，33℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝18∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝12∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-羟乙基鸟嘌呤318mg，产品为白色固体，收率93.5％。产物的紫外、核磁和质谱数据同实施例3。
实施例5 N7-(2-氯乙基)鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷600mg(2.25mmol)和二甲基亚砜10mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声2min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入1-溴-2-氯乙烷1.8mL(21.89mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于37℃反应72h，反应完毕后，35℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝15∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝13∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-氯乙基鸟嘌呤452mg，产品为白色固体，收率94.4％。
UVλ：244，285nm；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ4.06～4.03(m，2H，CH2)，4.52～4.49(m，2H，CH2)，6.18(s，2H，NH2)，7.98(s，1H，CH)，10.88(s，1H，NH)；MS(ESI)：m/z 214(M+H+)。
实施例6 N7-(2-氯乙基)鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷520mg(1.95mmol)和二甲基亚砜8mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声1.5min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入1-溴-2-氯乙烷1.32mL(16.05mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于37℃反应48h，反应完毕后，32℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝15∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝14∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-氯乙基鸟嘌呤408mg产品为白色固体，收率92.6％。产物的紫外、核磁和质谱数据同实施例5。
实施例7 N7-烯丙基鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷400mg(1.50mmol)和二甲基亚砜8mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声1.5min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入3-溴丙烯1.28mL(15.13mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于25℃反应16h，反应完毕后，23℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝16∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝12∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-烯丙基鸟嘌呤280mg，产品为白色固体，收率98.4％。
UVλ：247，285nm；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ5.22～5.18(m，2H，＝CH2)，5.93～5.70(m，1H，＝CH-)，4.68～4.53(m，1H，CH2)，7.02(s，2H，NH2)，8.03(s，1H，CH)，11.24(s，1H，NH)；MS(ESI)：m/z 192(M+H+)。
实施例8 N7-烯丙基鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷600mg(2.25mmol)和二甲基亚砜10mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声2min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入3-溴丙烯1mL(11.82mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于25℃反应20h，反应完毕后，25℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝16∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝16∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-烯丙基鸟嘌呤360mg，产品为白色固体，收率96.3％。产物的紫外、核磁和质谱数据同实施例7。
实施例9 N7-溴乙基鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷600mg(2.25mmol)和二甲基亚砜10mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声1.5min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入1，2-二溴乙烷1mL(11.54mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于37℃反应48h，反应完毕后，35℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝18∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝16∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-溴乙基鸟嘌呤525mg，产品为白色固体，收率92.3％。
UVλ：243，285nm；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ3.75～3.78(m，2H，CH2)，4.51～4.53(m，2H，CH2)，6.38(s，2H，NH2)，8.08(s，1H，CH)，10.98(s，1H，NH)；MS(ESI)：m/z 257(M+H+)。
实施例10 N7-溴乙基鸟嘌呤的制备
将2’-脱氧鸟苷500mg(1.87mmol)和二甲基亚砜7mL加入到25mL圆底烧瓶中，超声2min，待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，再加入1，2-二溴乙烷1.25mL(14.43mmol)，放入搅拌子，密闭搅拌，于37℃反应50h，反应完毕后，32℃下减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱层析纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝18∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝18∶1洗脱液洗脱，得到终产物N7-溴乙基鸟嘌呤463mg，产品为白色固体，收率95.8％。产物的紫外、核磁和质谱数据同实施例9。
Claims (7)
1.一种N7-鸟嘌呤烷化物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将2’-脱氧鸟苷1～3mmol溶于有机溶剂，超声1～2min；
(2)待2’-脱氧鸟苷完全溶解后，加入烷化剂碘乙烷、环氧乙烷、1-溴-2-氯乙烷、3-溴丙烯或1，2-二溴乙烷，2’-脱氧鸟苷与烷化剂的摩尔比为1∶2～15，控制反应温度在15～50℃，反应0.5～96h；
(3)反应完毕后，控制温度在15～40℃进行减压蒸馏，除去溶剂；
(4)将得到的粗产品用硅胶柱层析法进行分离纯化，用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝10～20∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝10～20∶1洗脱液洗脱，即可得到式(I)所示化合物，
其中R表示-CH2CH3、-CH2CH2OH、-CH2CH2Cl、-CH2CH＝CH2或-CH2CH2Br。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于上述步骤(2)中2’-脱氧鸟苷与烷化剂的摩尔比为1∶5～10。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于上述步骤(2)中反应温度为25～37℃。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于上述步骤(2)中反应时间为1～72h。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于上述步骤(3)中减压蒸馏温度为23～35℃。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于上述步骤(1)中所述有机溶剂为二甲基亚砜、冰醋酸或二甲基乙酰胺。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于上述步骤(4)中用乙酸乙酯∶石油醚(体积比)＝12～18∶1洗脱液洗脱，再用乙酸乙酯∶无水甲醇(体积比)＝12～18∶1洗脱液洗脱。
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