CN102276495B

CN102276495B - 3-氨基-2-羟基苯丙酸类金属蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN102276495B
Application number: CN201110137099.6A
Authority: CN
Inventors: 徐文方; 张晓攀; 方浩
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2031-05-25
Also published as: CN102276495A

Abstract

本发明涉及一种3-氨基-2-羟基苯丙酸类金属蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用。本发明提供了一类强效的金属蛋白酶抑制剂，可有效治疗金属蛋白酶活性异常表达的疾病。具体而言，本发明涉及具有通式(I)结构的化合物，还涉及其各种光学异构体，药学上可接受的盐，溶剂合物以及前药。本发明还涉及含有式(I)结构化合物的药物组合物及其制药用途。

Description

3-氨基-2-羟基苯丙酸类金属蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一类3-氨基-2-羟基苯丙酸类金属蛋白酶抑制剂及其制备方法和用途，属于化学技术领域。

背景技术

1、氨肽酶N(APN/CD13)

氨肽酶N(APN，CD13)通常是指人丙氨酰氨肽酶(EC 3.4.11.2)，是一种锌离子依赖性的水解蛋白酶，属于金属蛋白酶M1家族，以同源二聚体的形式存在于细胞膜上，与细胞表面抗原CD13是同一种物质；氨肽酶N在多种组织的多种细胞表面都有表达，尤其是在小肠的肠上皮细胞和肾近曲小管的上皮细胞中最为丰富，在肝脏、胎盘和子宫中也有表达。在造血细胞谱系中，不仅在骨髓前体细胞、单核/巨嗜细胞和粒细胞中有表达，同时在关节炎和肾癌患者的T淋巴细胞中也有表达；APN参与机体的生理调节，在血细胞分化，血管发生，细胞增殖与凋亡和免疫调节等多个生理病理调控网络中起重要作用。

氨肽酶N能从肽、酰胺或芳酰胺上水解释放N端的中性氨基酸或碱性氨基酸(Ala＞Phe＞Tyr＞Leu＞Arg＞Thr＞Trp)，作用的天然底物包括：血管作用肽(赖氨酸-缓激肽，血管紧张素III)，神经肽激素(亮氨酸和蛋氨酸脑磷脂，神经激肽A，生长激素抑制因子)，细胞因子和免疫调节剂(白介素-8，吞噬刺激素，胸腺喷丁)等。

研究证明，氨肽酶N在肿瘤发生、发展、侵袭转移、肿瘤血管生成、免疫功能调节以及病毒感染中发挥重要的作用。

1)氨肽酶N在肿瘤细胞表面高度表达，能够降解细胞外基质，并作为一个新型信号转导分子参与肿瘤新血管的生成，从而促进肿瘤细胞浸润与转移(Bauvois，B.et al.Med ResRev，.2006，26(1)：88；Zhang，X.，et al.Curr.Med.Chem.，2008，15(27)：2850.)。2)APN参与T淋巴细胞依赖的炎症反应，能够表达于抗原递呈细胞表面，降解免疫活性物质(如白介素-8)；还降低了T细胞对其抗原的识别能力，同时消弱了巨噬细胞和NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，使机体免疫力下降。3)APN通过降解能够使HIV辅助受体CCR5脱敏的趋化因子Fmlp，从而降低细胞的天然免疫功能，并使CCR5增敏，促进HIV病毒进入宿主细胞(Shen W.，Li B，et al.Blood，2000，96(8)，2887；Shipp MA，et al.Blood，1993，82(4)，1052.)。4)APN作为人冠状病毒HCoV-229E和传染性胃肠炎病毒(TGEV)表面的受体，在上呼吸道感染(如：SARS)和急性肠炎中扮演重要角色。(Delmas，B.，et al.Nature，1992，357，417；Yeager，C.L，et al.Nature，1992，420.)。5)APN能够降解血管紧张素，参与机体血压的调节(Mitsui，T.，et al.Biol.Pharm.Bull.，2004，27(6)：768.)。

2、基质金属蛋白酶(MMPs)

MMPs是一类钙离子和锌离子依赖性的蛋白水解酶，属于金属内肽酶，与细胞间基质的降解和血管生成密切相关，通常产生于正常组织细胞包括内皮细胞、结缔组织细胞、淋巴细胞，和巨噬细胞。MMPs的正常生理功能是与内源性金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)共同调控细胞外基质(ECM)的更新，维持细胞稳定性。MMPs可以降解几乎所有的胞间基质蛋白，从而方便了肿瘤的生长和侵袭转移，并通过降解过程中激活某些生长因子调节细胞增殖，参与如胚胎发育、伤口愈合以及血管生成等多种生理过程。MMPs的活性由基因表达水平和酶原激活/抑制因子的分泌水平严格控制，在很多病理过程，如关节炎、组织溃烂、恶性肿瘤的生长和转移过程中起到了非常重要的作用。

目前在哺乳动物中发现了MMPs家族的28个成员(Szabo，KA.et al.Clinical andAppliedImmunology Reviews.2004，4，295.)，根据其结构、特异性底物和不同的细胞位置，分为不同的亚型，包括4种胶原酶(MMP-1，-8，-13，-18)，2种明胶酶(MMP-2，-9)，3种基质降解酶(MMP-3，-10，-11)，6种膜型基质金属蛋白酶(MMP-14，-15，-16，-17，-24，-25)，以及其他未归类的如基质溶解素(MMP-7，-26)和巨噬细胞金属弹性蛋白(MMP-12)等。其中明胶酶(MMP-2和-9)已经被证明与侵袭性肿瘤的恶性表型及癌症病人的不良预后密切相关，他们参与了肿瘤细胞对基底膜、基质的侵袭，对血管壁的穿透，以及肿瘤细胞的转移。今年来研究表明，MMPs还与原发瘤和继发瘤的生长、以及血管生成有关，甚至对肿瘤细胞的增殖过程亦起促进作用。因此，以MMPs为靶点的治疗策略也迅速发展起来，MMPs抑制剂已成为癌症治疗药物研究中的热点。

十几年来，对MMPs抑制剂的研究开发极为迅速，但至今为止没有一个上市，究其原因是因为MMPs抑制剂大多数为肽或肽的类似物，对酶的降解比较敏感，另外由于大多数具有长链结构，所含的可旋转单键数目比较多，因此对同家族的成员选择性不好，这是导致大多数基质金属蛋白酶抑制剂在临床阶段被枪毙的主要原因。另外，作为目前唯一上市的APN抑制剂Bestatin，由于是从橄榄网状链霉菌(Streptomyces olivorecticuli)的培养液中分离得到，来源有限。

本发明所涉及的3-氨基-2-羟基苯丙酸类化合物，作为Bestatin的结构类似物，具有类肽的性质，可以提高对水解酶的稳定性。本发明中对APN抑制活性最好的化合物其活性优于目前唯一上市的药物Bestatin，而且表现出对APN较高的选择性，通过结构优化有望开发出高选择性和特异性的APN抑制剂。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种3-氨基-2-羟基苯丙酸类金属蛋白酶抑制剂及其制备方法和用途。

具体地说，本发明提供了下面通式(I)的化合物，其作为苯丙酸类金属蛋白酶抑制，以及制备该化合物的中间体，制备本发明化合物的方法，以及上述化合物在制备预防或治疗与金属蛋白酶活性异常表达相关的哺乳动物疾病的药物中的应用，本发明还提供了一种包括通式(I)的化合物的药物组合物。

本发明的技术方案如下：

具有通式(I)的化合物，或其光学异构体、非对映异构体或消旋体混合物，其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，

其中，

R₁是羟胺基；或C1-12脂肪链烷氧基，芳基C1-12烷氧基，芳杂基C1-12烷氧基，C1-12脂肪链烷胺基，芳基C1-12烷胺基、芳杂基C1-12烷胺基、各种C端取代或未取代的天然氨基酸或非天然氨基酸及其衍生物，或任选被一个或多个如下基团取代：羟基，卤素，硝基，氰基，胍基，羧基，羟胺基，C1-12烷基，卤C1-12烷基，芳基C1-12烷基，芳杂基C1-12烷基；

所述“或任选被一个或多个如下基团取代”指的是“C1-12脂肪链烷氧基，芳基C1-12烷氧基，芳杂基C1-12烷氧基，C1-12脂肪链烷胺基，芳基C1-12烷胺基、芳杂基C1-12烷胺基、各种C端取代或未取代的天然氨基酸或非天然氨基酸及其衍生物”中任选被一个或多个如下基团取代。

R₂是氢，或各种天然或非天然氨基酸α碳上的取代基。

这些氨基酸包括：各种α-氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、色氨酸、精氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、酪氨酸、苯甘氨酸等；各种β-氨基酸如氨基丙酸、β-氨基苯丙酸等；D-氨基酸如D型的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、色氨酸、精氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、酪氨酸、苯甘氨酸等；

所述R₂中天然或非天然氨基酸优选亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或苯甘氨酸。

R₃是氢，各种氨基酸制备的酰基，芳酰基，杂芳酰基，芳基C1-6烷酰基，杂芳基C1-9烷酰基，C1-6烷酰基，芳磺酰基，杂磺酰基，芳基C1-6烷磺酰基或杂芳基C1-9烷磺酰基；或各种用于保护氨基酸氨基的保护基。

所述R₃中各种用于保护氨基酸氨基的保护基是叔丁氧羰基，苄氧羰基，邻苯二甲酰亚胺基，对甲苯磺酰基，三苯甲基，甲酰基，乙酰基或三氟乙酰基。

式(I)中*所示的碳具有(3R，2S)构型，或者具有(3S，2R)构型。

优选的，上述化合物(I)是下列之一：

(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)丙酸(5a)；

(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-3-甲基丁酸(5b)；

(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-4-甲基戊酸(5c)；

(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-3-甲基戊酸(5d)；

(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-2-苯基乙酸(5e)；

(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-3-苯基丙酸(5f)；

(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸(5g)；

(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-3-羟基丙酸(5h)；

(S)-2-(N-(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氨基)-3-甲基丁酸(5i)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-4-甲基戊酰基)氨基)-4-甲基戊酸(5j)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-4-甲基戊酰基)氨基)-2-苯基乙酸(5k)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-4-甲基戊酰基)氨基)-3-苯基丙酸(5l)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-4-甲基戊酰基)氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸(5m)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-3-苯基丙酰基)氨基)-4-甲基戊酸(5n)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-3-苯基丙酰基)氨基)-3-苯基丙酸(5o)；

(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-N-((S)-1-羟胺基-1-氧代丙-2-基)-3-苯基丙酰胺(7a)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-甲基丁酰胺(7b)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-4-甲基戊酰胺(7c)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-甲基戊酰胺(7d)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-2-苯基乙酰胺(7e)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-苯基丙酰胺(7f)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酰胺(7g)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-羟基丙酰胺(7h)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-苄基-4-甲基戊酰胺(9a)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(2-甲基苯基)-4-甲基戊酰胺(9b)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-甲基苯基)-4-甲基戊酰胺(9c)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-氯苯基)-4-甲基戊酰胺(9d)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-氟苯基)-4-甲基戊酰胺(9e)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-溴苯基)-4-甲基戊酰胺(9f)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-甲氧基苯基)-4-甲基戊酰胺(9g)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(2-氟苯基)-4-甲基戊酰胺(9h)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-氟苄基)-4-甲基戊酰胺(9i)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-甲基苄基)-4-甲基戊酰胺(9j)；

(S)-2-(N-(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-甲氧基苄基)-4-甲基戊酰胺(9k)。

上述通式(I)的化合物的中间体为(2R，3S)-3-叔丁氧羰酰胺基-2-羟基-3-苯基丙酸。

本发明还提供了这些化合物在制备预防或治疗与金属蛋白酶，包括基质金属蛋白酶和氨肽酶N，活性异常表达相关的哺乳动物疾病的药物中的应用；所述的与金属蛋白酶活性异常表达的相关哺乳动物疾病包括：炎症，癌症，多发性硬化症，各种组织溃疡或组织溃疡性病症，牙周病，大疱性表皮松懈症和白血病。因此，本发明还涉及含有(I)结构化合物的药物组合物。

此外，本发明还包括一种适于口服给予哺乳动物的药物组合物，包含上述通式(I)的任一化合物，和药学上可接受载体，任选包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

此外，本发明还包括一种适于胃肠外给予哺乳动物的药物组合物，包含上述通式(I)的任一化合物，和药学上可接受载体，任选包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

发明详述

所用的定义和术语

本文中所用的术语和定义含义如下：

“芳基”是指芳族碳环基团。优选的芳环含有6-10个碳原子。

“杂芳基”是芳族杂环，可以是单环或双环基团。较佳的杂芳基包括，例如噻吩基，呋喃基、吡咯基、吡啶基、吡嗪基、噻唑基、嘧啶基、喹啉基、以及四氮唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、吲哚基等。

“杂烷基”指饱和或不饱和、含碳原子和至少一个杂原子的链，其中任意一个杂原子不相邻。杂烷基中含有2-15个原子(碳原子)，优选含有2-10个原子。杂烷基可以是直连或支链、取代或未取代的。

“环烷基”是取代或未取代的，饱和或不饱和的环状基团，其含有碳原子和/或一个或多个杂原子。该环可以是单环或稠环，桥环或螺环的环系。单环通常有3-9个原子，优选有4-7个原子，多环含有7-17个原子，优选含有7-13个原子。

“卤”，或“卤素”包括氟、氯、溴或碘，优选氟和氯。

“各种氨基酸制备的酰基”是指将各种氨基酸的羧基经酰化后得到的基团，优选疏水性氨基酸，如甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，苯甘氨酸，甲硫氨酸。

“芳酰基”是指芳香族碳环末端连有羰基的基团，优选的芳环含有6-10个碳原子。

“杂芳酰基”指芳族杂环末端连有羰基的基团，可以是单环或双环基团。较佳的杂芳基包括噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，吡嗪基，噻唑基，嘧啶基，喹啉基以及四氮唑基，苯并噻唑基，苯并呋喃基，吲哚基等。

“环烷酰基”指取代或为取代的，饱和或不饱和的环状末端连有羰基的基团，其含有碳原子和/或一个或多个杂原子。该环可以是单环或稠环，桥环或螺环的环系。单环通常有3-9个原子，优选有4-7个原子，多环含有7-17个原子，优选含有7-13个原子。

“药学上可接受的盐”是指式(I)化合物具有疗效且无毒的盐形式。其可由任一酸性基团(如羧基)形成阴离子盐，或由任一碱性基团(如氨基)形成阳离子盐。本领域已知许多这样的盐。在任何酸性基团(如羧基)上形成的阳离子盐，或是在任何碱性基团(如氨基)上形成的阴离子盐。这些盐有许多是本领域已知的，如阳离子盐包括碱金属(如钠和钾)和碱土金属(如镁和钙)的盐以及有机盐(如铵盐)。还可通过使用相应的酸处理碱性形式的(I)方便地获得阴离子盐，这样的酸包括无机酸如硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、羟基乙酸、2-羟基丙酸、2-氧代丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、2-羟基-1，2，3-丙三酸、甲磺酸、乙磺酸、苯甲磺酸、4-甲基苯磺酸、环己基亚磺酸、2-羟基苯甲酸、4-氨基-2-羟基苯甲酸等。这些盐是熟练技术人员熟知的，熟练的技术人员可制备本领域知识所提供的任何盐。此外，熟练技术人员可根据溶解度、稳定性、容易制剂等因素取某种盐而舍另一种盐。这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。

“溶剂合物”是溶质(如金属蛋白酶抑制剂)和溶剂(如水)组合形成的配合物。参见J.Honig等，The Van Nostrand Chemist’s Dictionary，p.650(1953)。本发明采用的药学上可接受的溶剂包括不干扰金属蛋白酶抑制剂的生物活性的那些溶剂(例如水、乙醇、乙酸、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜以及该领域技术人员所知的或容易确定的溶剂)。

本文所用的“光学异构体”、“对映体”、“非对映体”、“消旋体”等定义了本发明化合物或其生理上的衍生物所有可能的立体异构体的形式。除非另有指示，本发明化合物的化学命名包括所有可能的立体化学形式的混合物，所属混合物包含基本结构分子的所有非对映体和对映体，以及基本纯净的本发明化合物的单个异构体形式，即其中含有低于10％，优选低于5％，特别是低于2％，最优选低于1％的其它异构体。本发明类肽化合物各种立体异构体形式均明显包含于本发明的范围内。

式(I)化合物还可以其它被保护的形式或衍生物的形式存在，这些形式对本领域技术人员而言是显而易见的，均应该包含于本发明的范围内。

如上所述的取代基自身还可被一个或多个取代基取代。这样的取代基包括在C.Hansch和A.Leo，Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology(1979)中列出的那些取代基。优选的取代基包括，例如烷基，烯基，烷氧基，羟基，氧基，硝基，氨基，氨基烷基(如氨甲基等)，氰基，卤，羧基，羰基烷氧基(如羰基乙氧基等)，硫基，芳基，环烷基，杂芳基，杂环烷基(如哌啶基，吗啉基，吡咯基等)，亚氨基，羟烷基，芳基氧基，芳基烷基，及其结合。

所述化合物的制备方法，反应步骤及反应式如下：

以(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酸(1)为原料，经叔丁氧羰基(Boc)保护氨基得化合物(2)；化合物(2)在二氯甲烷中，以N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三氮唑(HOBT)作为复合缩合剂，与各种氨基酸以及二肽的甲酯盐酸盐反应得到中间体(3a-3o)，最后在NaOH溶液中，经皂化反应脱去羧酸甲酯得中间体(4a-4o)，化合物(4a-4o)在3NHCl-EtOAc溶液中脱除Boc保护基得目标化合物(5a-5o)；其中中间体(3a-3h)在羟胺钾作用下，生成化合物(6a-6h)，化合物(6a-6h)在3N HCl-EtOAc溶液中脱除Boc保护基后得目标化合物(7a-7h)；化合物(4c)在二氯甲烷中，以N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三氮唑(HOBT)作为复合缩合剂，与各种取代芳胺反应得到中间体(8a-8k)，之后再在3N HCl-EtOAc溶液中脱除Boc保护基得目标化合物(9a-9k)。

反应式如下：

所述化合物的具体操作步骤在实施例中将加以详细说明。

本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene，Protecting Groups inOrganic Synthesis.

显然，上述路线为立体选择性合成，通过上述路线还可制备得到其光学活性的类肽化合物。例如将原料(2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酸替换为其光学异构体(2S，3R)、(2R，3R)、(2S，3S)等，本领域技术人员可方便地获得各种其他异构体，并可通过常规分离手段纯化，如手性盐或手性层析柱等。

上述通式(I)化合物的体外抑酶活性试验如下：

基质金属蛋白酶MMPs抑制活性的测试描述于Vijaykumar，M.B.等，Matrix Biol.2000，19，26中。琥珀酰明胶已证明能被明胶酶(包括MMP-2，-9)水解，肽键水解产生的游离氨基浓度的高低与酶活性大小呈正相关。琥珀酸酐保护明胶中的游离氨基，水解后暴露的伯氨与2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)反应显色，通过检测450nm处的吸收度确定氨基的含量，从而确定明胶酶的活性。

氨肽酶N(APN)抑制活性的测试描述于Lejczak，B等.Biochemistry，1989，28，3549中。底物L-亮氨酰-p-硝基苯胺被APN降解，产生在405nm有吸收的p-硝基苯胺，并且p-硝基苯胺的浓度与酶活性的大小呈正相关。通过检测405nm处得吸收度确定p-硝基苯胺的含量，从而确定氨肽酶的活性，间接反映出抑制剂对酶活性抑制程度的大小。

上述通式(I)化合物的体外抑制细胞增殖的活性试验如下：

化合物的细胞活性的测试使用噻唑兰检测方法(MTT法)，人急性白血病细胞株(HL60)的细胞悬液分别接种于96孔板，每孔中加入含不同浓度化合物的培养基，经孵育后，用MTT染色，继续孵育后，于酶标仪上在570nm处测定每孔的吸光度(OD值)，计算出细胞生长抑制率，从而确定化合物的活性。

含有本发明化合物的药物组合物：

本发明的部分衍生物可以游离形式或以盐形式存在。本领域技术人员已知许多化合物类型的药学上可接受的盐及其制备方法。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐，包括这样的化合物碱与无机或有机酸形成的季铵盐。

本发明的化合物可形成水合物或溶剂合物。本领域熟练人员已知将化合物与水一起冻干时所形成的水合物或在溶液中与合适的有机溶剂浓缩时形成溶剂合物的方法。

本发明包含含有治疗量本发明化合物的药物，和一种或多种药学上可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。载体包括如盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它们的结合物，下文更详细地论述。如果需要，该组合物还可以包含较小量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。该组合物可以是液体，悬浮液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂或粉末。该组合物可以用传统的黏合剂和载体如三酸甘油酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体如药物品级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素和碳酸镁等等。视需要制剂而定，配制可以设计混合，制粒和压缩或溶解成分。在另一个途径中，该组合物可以配制成纳米颗粒。

使用的药物载体可以为固体或者液体。

典型的固体载体包括乳糖，石膏粉，蔗糖，滑石，凝胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸镁，硬脂酸等等。固体载体可以包括一种或多种可能同时作为增香剂，润滑剂，增溶剂，悬浮剂，填料，助流剂，压缩助剂，粘合剂或片剂-崩解剂的物质；它还可以是包封材料。在粉末中，载体为精细粉碎的固体，它与精细粉碎的活性成分的混合。在片剂中活性成分与具有必要的压缩性质的载体以合适的比例混合，以需要的形状和大小压缩。粉末和片剂优选包含至多99％活性成分。合适的固体载体包括，例如，磷酸钙，硬脂酸镁，滑石，糖，乳糖，糊精，淀粉，凝胶，纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠盐，聚乙烯吡咯烷酮烷酮，低熔点蜡和离子交换树脂。

典型的液体载体包括糖浆，花生油，橄榄油，水等等。液体载体用于制备溶液，悬浮液，乳剂，糖浆，酊剂和密封的组合物。活性成分可以溶解或悬浮于药学上可接受的液体载体如水，有机溶剂，二者的混合物或药学上可接受的油类或脂肪。液体载体可以包含其他合适的药物添加剂如增溶剂，乳化剂，缓冲剂，防腐剂，增甜剂，增香剂，悬浮剂，增稠剂，颜料，粘度调节剂，稳定形或渗透压-调节剂。用于口服和肠胃外给药的液体载体的合适的例子包括水(部分地包含如同上述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠盐溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)和它们的衍生物，和油类(例如分馏椰子油和花生油)。用于肠胃外给药的载体还可以为油脂如油酸乙酯和异丙基肉豆蔻酸盐。无菌的液体载体用于肠胃外给药的无菌的液态组合物。用于加压组合物的液体载体可以为卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。无菌溶液或悬浮溶液液体药物组合物可以用来，例如，静脉内，肌内，腹膜内或皮下注射。注射时可单次推入或逐渐注入，入30分钟的经脉内灌注。该化合物还可以以液体或者固体组合物的形式口服给药。

载体或赋形剂可以包括本领域已知的时间延迟材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，还可包括蜡，乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，异丁烯酸甲酯等等。当制剂用于口服时，公认PHOSALPG-50(磷脂(phospholipid)与1，2-丙二醇浓缩，A.Nattermann&Cie.GmbH)中的0.01％吐温80用于其他化合物的可接受的口服制剂的配制，可以适应于本发明各种化合物的配制。

给予本发明化合物时可以使用各式各样的药物形式。如果使用固体载体，制剂可以为片剂，被放入硬胶囊中的粉末或小药丸形式或锭剂或糖锭形式。固体载体的量在很大程度上变化，但是优选从约25mg到约1.0g。如果使用液体载体，制剂可以为糖浆，乳剂，软胶囊，在安瓿或小瓶或非水的液体悬浮液中的无菌注射溶液或悬浮液。

为了获得稳定的水溶性的剂型，可以将化合物或其药学上可接受的盐溶于有机或无机酸的水溶液，0.3M琥珀酸或柠檬酸溶液。选择性地，酸性的衍生物可以溶于合适的碱性溶液。如果得不到可溶形式，可将化合物溶于合适的共溶剂或它们的结合。这样的合适的共溶剂的例子包括，但是不局限于，浓度范围从0-60％总体积的乙醇，丙二醇，聚乙二醇300，聚山梨酸酯80，甘油，聚氧乙烯脂肪酸酯，脂肪醇或甘油羟脂肪酸酯等等。

各种释放系统是已知的并且可以用于化合物或其他各种制剂的给药，这些制剂包括片剂，胶囊，可注射的溶液，脂质体中的胶囊，微粒，微胶囊，等等。引入的方法包括但是不局限于皮肤的，皮内，肌内，腹膜内的，静脉内的，皮下的，鼻腔内的，肺的，硬膜外的，眼睛的和(通常优选的)口服途径。化合物可以通过任何方便的或者其它适当的途径给药，例如通过注入或快速浓注，通过上皮的或粘膜线路(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜，等等)吸收或通过负载药物的支架以及可以于其他生物活性剂一起给药。可以全身或局部给药。用于鼻，支气管或肺疾病的治疗或预防时，优选的给药途径为口服，鼻给药或支气管烟雾剂或喷雾器。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

实施例1.本发明化合物的合成

以化合物(5c)，(7c)和(9a)为例

(1)(2R，3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-2-羟基-3-苯基丙酸(2)的制备

化合物1(5.43g，30.0mmol)溶于66mL1mol/L的氢氧化钠溶液中，并加入20mL碳酸二叔丁酯(8.40g，33.0mmol)的四氢呋喃溶液。反应过程中用1mol/L的氢氧化钠溶液控制反应液pH在8-9。室温反应12小时后，蒸除反应液中的四氢呋喃，再用石油醚将反应液萃取3次，并用1mol/L的柠檬酸溶液酸化至pH2-3，然后用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得8.16g浅白色固体2，无需纯化可直接用于下步反应。

(2)(S)-2-(N-((2R，3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-4-甲基戊酸甲酯(3c)的制备

化合物2(5.62g，20.0mmol)，L-亮氨酸甲酯盐酸盐(4.36g，24.0mmol)，HOBT(3.24g，24.0mmol)溶于80mL无水二氯甲烷中，滴加入TEA(2.4g，24.0mmol)，冰浴条件下滴加EDCI(4.60g，24.0mmol)的二氯甲烷溶液，约1h滴加完毕，撤去冰浴室温继续搅拌反应。反应结束后，蒸除二氯甲烷，加入乙酸乙酯，依次用饱和碳酸钠溶液，1mol/L的柠檬酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。柱层析后得化合物3c，为白色固体6.12g，产率74.9％。ESI-MSm/z：408.9[M+H]⁺。

(3)(S)-2-(N-((2R，3S)-3-(叔丁氧羰基)氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-4-甲基戊酸(4c)的制备

将化合物3c(4.08g，10mmol)溶于50ml甲醇中，冷却至5℃，搅拌下缓慢滴加1mol/L的NaOH溶液12ml，滴加完毕后，室温反应2h，蒸除甲醇，加入20ml蒸馏水，用1mol/L的柠檬酸溶液调节反应液为pH为2-3，然后用乙酸乙酯萃取三次，有机相合并后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得4c，为浅白色固体3.82g，无需纯化可直接用于下步反应。

(4)(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-4-甲基戊酸盐酸盐(5c)的制备

化合物4c(0.2g，0.51mmol)溶解于10mL3mol/L的氯化氢-乙酸乙酯溶液中。室温搅拌4h，产物5c以盐酸盐的形式析出，过滤、以无水乙醚洗涤得白色固体粉末0.14g。产率：93.3％，mp：226-227℃；¹H-NMR(DMSO-d₆)δ0.57(d，J＝6.6Hz，3H)，0.69(d，J＝6.6Hz，3H)，0.85-0.89(m，1H)，1.26-1.34(m，2H)，4.04-4.08(m，1H)，4.27-4.28(m，1H)，4.36-4.37(m，1H)，6.51(s，1H)，7.36-7.37(m，3H)，7.43-7.45(m，2H)，8.18-8.21(m，1H)，8.47(s，2H)；HRMS(AP-ESI)m/z calcd for C₁₅H₂₃N₂O₄[M+H]⁺295.1652，found 295.1651。

(5)(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-4-甲基戊酰胺盐酸盐(7c)的制备

羟胺钾(NH₂OK)甲醇溶液的制备：14mL氢氧化钾的饱和无水甲醇溶液滴加到24mL含有4.67g(67mmol)盐酸羟胺的无水甲醇溶液中，控制内温低于40℃，滴加完毕，冷却反应液，滤除白色氯化钾沉淀，所得滤液密闭保存备用。

化合物3c(0.4g，1.02mmol)溶于5mL无水甲醇后，向其中加入3.5mL上述羟胺钾(NH₂OK)溶液，室温搅拌30min后，TLC检测反应进程。反应结束后，蒸除甲醇，1mol/L的柠檬酸溶液酸化至pH3-4，然后用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层后用饱和食盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，蒸干溶剂得粗品，粗品经乙酸乙酯/乙醇重结晶得0.23g白色粉末6c。化合物6c(0.23g，0.56mmol)溶解于10mL 3mol/L的氯化氢-乙酸乙酯溶液中。室温搅拌4h，产物7c以盐酸盐的形式析出，过滤、以无水乙醚洗涤得白色固体粉末0.18g。产率：93.0％，mp：176-178℃；¹H-NMR(DMSO-d₆)δ0.55(d，J6.6Hz，3H)，0.66(d，J 6.6Hz，3H)，0.75-0.78(m，1H)，1.15-1.22(m，2H)，4.01-4.05(m，1H)，4.27-4.29(m，1H)，4.38-4.40(m，1H)，6.49(s，1H)，7.36-7.40(m，3H)，7.44-7.46(m，2H)，8.14-8.15(m，1H)，8.47(s，3H)，8.85(s，1H)，10.63(s，1H)；HRMS(AP-ESI)m/z calcd for C₁₅H₂₄N₃O₄[M+H]⁺310.1761，found 310.1765。

(6)(S)-2-(N-((2R，3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-苄基-4-甲基戊酰胺盐酸盐(9a)的制备

化合物4c(1.58g，4mmol)，苄胺(0.52g，4.8mmol)，HOBT(0.65g，4.8mmol)溶于80mL无水二氯甲烷中，滴加入TEA(0.45g，4.5mmol)，冰浴条件下滴加EDCI(0.92g，4.8mmol)的二氯甲烷溶液，约1h滴加完毕，撤去冰浴室温继续搅拌反应。反应结束后，蒸除二氯甲烷，加入乙酸乙酯，依次用饱和碳酸钠溶液，1mol/L的柠檬酸溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。柱层析后得化合物8a，为白色固体1.26g，产率65.1％。化合物8a(0.25g，0.52mmol)溶解于10mL 3mol/L的氯化氢-乙酸乙酯溶液中。室温搅拌4h，产物9a以盐酸盐的形式析出，过滤、以无水乙醚洗涤得白色固体粉末0.21g。产率：95.5％，mp：138-140℃；¹H-NMR(DMSO-d₆)δ0.56(d，J＝6.0Hz，3H)，0.68(d，J＝6.0Hz，3H)，0.80-0.85(m，1H)，1.27(t，J＝7.8Hz，2H)，4.13-4.17(m，1H)，4.20-4.31(m，3H)，4.39-4.41(m，1H)，6.61(s，1H)，7.22-7.24(m，3H)，7.30-7.32(m，2H)，7.36-7.37(m，3H)，7.44-7.46(m，2H)，8.18(d，J＝9.0Hz，1H)，8.46(s，3H)，8.51(t，J＝9.0Hz，1H)；HRMS(AP-ESI)m/z calcd for C₂₂H₃₀N₃O₃[M+H]⁺384.2281，found 384.2296。

实施例2.目标化合物抑制明胶酶的活性实验(In vitro)

试验原理及详细步骤参见CN1528745A吡咯烷类基质金属蛋白酶抑制剂及其制备方法。实验结果见表一。

实施例3.目标化合物抑制氨肽酶N的活性实验(In vitro)

试验原理及详细步骤参见CN1974554A环酰亚胺类肽金属蛋白酶抑制剂及其应用。实验结果见表一。

表一.体外抑酶活性试验结果

a表中数值为三次试验的平均值，“±”后的数值表示标准偏差；NA^b＝无活性。

实验结果表明：大多数化合物都表现出较强的体外抑酶活性，其中化合物7b，7c，7e对氨肽酶N的抑制活性较好，化合物7e对APN抑制活性最好IC₅₀值达到1.26μmol/L，优于阳性对照药Bestatin，而且还表现出对APN较强的选择性，有进一步研究开发的价值。实施例4.目标化合物抑制细胞增殖的活性试验(In vitro)

选取化合物(I)中对APN酶抑制活性较好的化合物7b，7c，7e进行体外抑制HL-60细胞增殖的活性试验，结果见表二。

1.[材料]ES-2细胞株，MDA-MB-231细胞株，四甲基偶氮唑蓝MTT，10％胎牛血清，96孔板。

2.[方法]

细胞培养卵巢透明细胞癌ES-2细胞株和乳腺癌MDA-MB-231细胞株均采用常规培养。实验时均用对数生长期细胞。

细胞生长检测(MTT法)将ES-2细胞和MDA-MB-231细胞悬液均调整至1×10⁵/ml，分别接种于96孔板(50μl/孔)，10⁴个细胞/孔。铺板4h后，每孔中加入50μl含不同浓度化合物的培养基，使孔中化合物终浓度分别为：4000、800、160、32、6.4μmol/L，每个浓度设三个复孔，不加细胞的孔读数作为空白，加细胞不加化合物的孔作化合物空白孔，Bestatin作化合物阳性对照。于37℃，5％二氧化碳中孵育48h，每孔加入10μl 0.5％的MTT染色液，继续孵育4h后，2500rpm，离心30min，然后抛弃板孔中培养基，加入二甲基亚砜，200μl/孔。酶标仪上于570nm处测定每孔的吸光度OD值，细胞生长抑制率按下式计算：

表二.细胞增殖实验结果

a表中数值为三次试验的平均值，“±”后的数值表示标准偏差。

上表测试数据表明，化合物7c和7e在体外抗肿瘤细胞增殖的试验中显示出优于阳性对照bestatin的活性，具有良好的开发前景。

Claims

1.(S)-2-(N-(S)-2-(N-((2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氨基)-3-甲基丁酸(5i)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-4-甲基戊酰基)氨基)-4-甲基戊酸(5j)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-4-甲基戊酰基)氨基)-2-苯基乙酸(5k)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-4-甲基戊酰基)氨基)-3-苯基丙酸(5l)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-4-甲基戊酰基)氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸(5m)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-3-苯基丙酰基)氨基)-4-甲基戊酸(5n)；

(S)-2-(N-(S)-2-((2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰胺基)-3-苯基丙酰基)氨基)-3-苯基丙酸(5o)；

(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-N-((S)-1-羟胺基-1-氧代丙-2-基)-3-苯基丙酰胺(7a)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-甲基丁酰胺(7b)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-4-甲基戊酰胺(7c)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-甲基戊酰胺(7d)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-2-苯基乙酰胺(7e)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-苯基丙酰胺(7f)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酰胺(7g)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-羟基-3-羟基丙酰胺(7h)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-苄基-4-甲基戊酰胺(9a)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(2-甲基苯基)-4-甲基戊酰胺(9b)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-甲基苯基)-4-甲基戊酰胺(9c)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-氯苯基)-4-甲基戊酰胺(9d)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-氟苯基)-4-甲基戊酰胺(9e)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-溴苯基)-4-甲基戊酰胺(9f)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-甲氧基苯基)-4-甲基戊酰胺(9g)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(2-氟苯基)-4-甲基戊酰胺(9h)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-氟苄基)-4-甲基戊酰胺(9i)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-甲基苄基)-4-甲基戊酰胺(9j)；

(S)-2-(N-(2R,3S)-3-氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基)氨基)-N-(4-甲氧基苄基)-4-甲基戊酰胺(9k)。

2.权利要求1所述的化合物在制备预防或治疗与金属蛋白酶活性异常表达相关的哺乳动物疾病的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的与金属蛋白酶活性异常表达的相关哺乳动物疾病选自：炎症，癌症，多发性硬化症，各种组织溃疡或组织溃疡性病症，牙周病，大疱性表皮松懈症或白血病。

4.一种药物组合物，包含权利要求1的化合物，和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。