CN102268064B - 一种糖肽富集分离材料及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖肽富集分离材料及其应用。该糖肽富集分离材料，为质量比为1∶1的石墨碳和活性炭的混合物。实验表明，本发明所提供的糖肽富集分离材料对糖肽有很好的富集效果，富集产物糖肽纯度高于90％，回收率高于85％，比较其他比例的石墨碳和活性炭的混合物，本发明的材料对糖肽表现出来的特异性不是二者物理化学性质的简单加和作用，而是二者高度协同作用的结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖肽富集分离材料及其应用。
背景技术
糖肽是肽链上以共价键形式连有糖链的肽段，是糖蛋白质酶切的产物。由于糖肽与非糖肽的物理化学性质存在巨大的差异，在利用质谱鉴定糖肽时非糖肽对糖肽有着严重抑制作用，以致利用常规的蛋白质鉴定方法难以对糖肽进行检测和鉴定。糖蛋白质中糖链结构的变化与疾病发生、发展和预后存在着密切的关系，糖链结构的变化将是预测疾病进程的重要标志物，对糖肽进行富集分离是开展糖链结构研究的关键一步。
利用凝集素能够特异结合糖链的特性可以实现对糖蛋白质的富集，但该方法的缺点是每种凝集素只针对一种类型的糖链，在研究糖链组成和结构时仍然需要对糖肽进行富集，且该方法费用昂贵；基于糖肽分子量远大于非糖肽的特点，可以利用体积排阻色谱法富集分离糖肽，但该技术的分离效率较低；肼解法是目前分离糖肽高特异的方法之一，该方法的不足之处是在糖肽富集过程中糖链的组成可能被破坏，得到的糖链信息不完整；亲水性色谱法可以富集亲水性的糖肽，同时也可以富集亲水性的非糖肽，其方法获得的糖肽纯度较低；功能性磁珠(包括硼酸功能化的磁珠及大孔径硅胶等)也被用来富集糖肽，这类技术方法需要一些化学反应，这增加了富集过程的复杂度，限制了该方法的广泛应用，且不能实现高通量的糖肽富集；亲水性相互作用液相色谱和离子色谱也可用来从糖蛋白质酶切产物中富集分离糖肽，但存在明显的偏好性，并在富集糖肽过程中引入了大量无机盐离子，增加了后续糖链鉴定的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种经济、高效、无偏好的糖肽富集分离材料及其应用。
本发明所提供的糖肽富集分离材料，为质量比为1∶1的石墨碳和活性碳的混合物，石墨碳粒度(颗粒直径)范围为5-8μm。活性碳粒度(颗粒直径)范围为3-5μm。
以上述糖肽富集分离材料为填料的层析柱系统也属于本发明的保护内容。
本发明还提供上述的糖肽富集分离材料在富集分离糖肽中的应用。所述应用是利用上述的糖肽富集分离材料作为层析柱的填料，富集分离糖肽；富集分离包括下述步骤：
1)用平衡液平衡层析柱；
2)将待分离的样品溶液过层析柱；
3)用去离子水冲洗层析柱；
4)用洗脱液洗脱，收集洗脱液；
所述平衡液的pH值为3.0；所述样品溶液的pH值为3.0；所述洗脱液的pH值为4.0。
所述平衡液为pH3.0，体积百分浓度为0.2％的甲酸溶液；所述样品溶液为含待测样品，pH3.0，体积百分浓度为0.2％的甲酸溶液，所述洗脱液为pH4.0，含有0.2％甲酸的30％的乙腈溶液；所述百分浓度为体积百分浓度。
实验表明，本发明所提供的糖肽富集分离材料对糖肽有很好的富集效果，富集产物纯度高于90％，回收率高于85％，比较其他比例的石墨碳和活性炭的混合物，本发明的材料对糖肽表现出来的特异性不是二者物理化学性质的简单加和作用，而是二者高度协同作用的结果。本发明利用惰性无机材料与适当的洗脱液(有机缓冲液)结合实现了对糖肽的高效和无偏好富集分离。
附图说明
图1.石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集分离卵清蛋白质双酶切前后的质谱图。a：富集前双酶切的卵清蛋白质谱图；b：富集后质谱图，星号所标注的为糖肽峰。
图2.胎球蛋白质双酶切后经石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集分离前后的质谱图。a：富集前双酶切胎球蛋白质的质谱图；b：富集后的质谱图，星号标注的为糖肽峰。
图3.触珠蛋白β链双酶切后经石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集前后的质谱图。a：富集前双酶切触珠蛋白β链的质谱图；b：富集后的质谱图，星号标注为糖肽峰；c：m/z 2554.2离子的二级质谱图。
图4.石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集卵清蛋白质糖肽的三次重复实验结果。
图5.石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集胎球蛋白质糖肽的三次重复实验结果。
图6.石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集触珠蛋白β链糖肽的三次重复实验结果。
图7.石墨碳与活性碳不同混合比例对富集卵清蛋白质糖肽的影响(G：石墨碳；A：活性炭)。石墨碳与活性炭质量比(G：/A)：3∶0(a)；2∶1(b)；1∶1(c)；1∶2(d)；0∶3(e)
图8.石墨碳与活性碳不同混合比例对富集胎球蛋白质糖肽的影响(G：石墨碳；A：活性炭)。石墨碳与活性炭质量比(G：/A)：3∶0(a)；2∶1(b)；1∶1(c)；1∶2(d)；0∶3(e)
图9.石墨碳与活性碳不同混合比例对富集触珠蛋白β链糖肽的影响(G：石墨碳；A：活性炭)。石墨碳与活性炭质量比(G：/A)：3∶0(a)；2∶1(b)；1∶1(c)；1∶2(d)；0∶3(e)
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、糖肽富集分离材料的制备及其效果验证
一、糖肽富集分离材料及其应用方法
1、糖肽富集分离材料：
本发明的发明人在长期试验过程中，发现以石墨碳和活性碳(1∶1，质量比)的混合物作为分离固定相，可以高效、无偏好地富集分离来自各种类型糖蛋白质的糖肽。以下述试验为例说明本发明的使用方法和效果。
2、应用方法：
利用该混合物(1∶1，质量比)可以制成各种分析型、制备型色谱柱以及微量样本处理用的ZipTip柱等。
二、糖肽富集分离材料及其应用实验结果：
1、石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集分离糖肽的实验结果
以鸡卵清蛋白质(非唾液酸化糖蛋白质)、牛胎球蛋白质(高唾液酸化糖蛋白质)和健康人血液中的触珠蛋白β链(低唾液酸化糖蛋白)三种不同类型的糖蛋白质为验证对象。利用胰酶(Roche公司，货号：11418025001)分别将上述三种蛋白质进行酶切，之后分别再用蛋白酶K(Promega公司，货号V302B 224258)酶切。双酶切后肽段混合物用甲酸溶解调pH为3.0，用石墨碳和活性碳(1∶1，质量比)混合物为固定相填充Tip制成ZipTip柱富集糖肽。具体过程为：所用石墨碳粒度范围为5-8μm，活性碳粒度范围为3-5μm。称取相同质量的石墨碳与活性碳，溶于80％(体积百分浓度)的乙腈溶液中制成等质量比例混合的石墨碳与活性碳混合物，装柱前充分混匀。然后进行如下的糖肽富集分离过程：
1)装柱：取适量的石墨碳与活性碳混合物溶液，装入Tip管内，制成长度5-8mm的ZipTip柱，并用80％(体积百分浓度)的乙腈溶液冲洗备用。
2)平衡：加入30μL pH3.0，0.2％(体积百分浓度)的甲酸溶液，30g离心10分钟，重复3次。
3)上样：双酶切好的样品，用甲酸溶液调样本溶液pH值为3.0，然后用pH3.0，0.2％(体积百分浓度)的甲酸溶液稀释到30μL，加到平衡好的ZipTip柱内，30g离心10分钟。
4)冲洗：20μL去离子水，30g离心10分钟，重复2次。
5)洗脱：10μL pH4.0，含有0.2％(体积百分浓度)甲酸的30％(体积百分浓度)乙腈溶液，30g离心5分钟，重复3次，并收集，即富集分离得到的糖肽溶液。
富集分离到的糖肽溶液冷冻抽干，-80℃保存以备质谱检测。
上述三种糖蛋白质的糖肽质谱鉴定结果如图1-3所示。结果表明：
1)鸡卵清蛋白质是由386氨基酸残基组成的分泌性糖蛋白，其肽链上只有一个糖基化位点(第292位的天冬酰胺)。经过双酶切后，质谱鉴定结果如图1a和1b所示。图1b是富集后的质谱图，质谱峰主要为卵清蛋白质的糖肽信号。图1b中糖肽信号峰间的质荷比(m/z)之差与单糖残基质量数一致(如162和203Da分别对应己糖和N-乙酰己糖)，糖肽峰成簇出现，表明糖蛋白质的糖基化存在微观不均一性。图1b中m/z1750.1，1912.1，2157.9，2359.1和2522.6对应的肽段为YNLT，它们分别对应的糖链为(GlcNAc)2Man3(HexNAc)1Hex1，(GlcNAc)2Man3(HexNAc)1Hex2，(GlcNAc)2Man3(HexNAc)3Hex1，(GlcNAc)2Man3(HexNAc)4Hex1及(GlcNAc)2Man3(HexNAc)4Hex2。由图1b可知，石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物可以高效的富集卵清蛋白质双酶切后的糖肽。
2)胎球蛋白质有三个糖基化位点，分别位于第37、137及271位的天冬酰胺上，胎球蛋白质是一高唾液酸化的糖蛋白，在其天线末端连接着唾液酸。图2为用石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集双酶切胎球蛋白质前后的质谱图。质谱图中出现一系列的相差291Da的糖肽信号峰(图2b)，291Da是唾液酸残基的质量数。图2结果表明石墨碳与活性碳(1∶1，质量比)混合物柱对高唾液酸化的糖蛋白质也有很好的富集效果。
3)触珠蛋白β链有四个糖基化位点，分别位于第184、207、211和241位的天冬酰胺上。触珠蛋白β链上所连接的糖链结构复杂，可能包含双天线、三天线和四天线的复杂或者杂合型的糖链，另外还存在唾液酸化和岩藻糖化。触珠蛋白β链双酶切后的混合肽段经石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集分离后，其质谱图中是以质荷比(m/z)相差291Da的质谱峰为主的一簇糖肽峰(图3b)。根据二级质谱图(图3c)，可以得出质荷比(m/z)在2554.2的糖肽所连的糖链是(GlcNAc)2Man3(HexNAc)2Hex2。
2、石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)柱的重现性考察
为了验证石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集糖肽的重现性，以卵清蛋白质、胎球蛋白质及触珠蛋白β链为实验对象，分别对每个蛋白质进行重复实验三次。方法如下：所用石墨碳粒度范围为5-8μm，活性碳粒度范围为3-5μm。称取相同质量的石墨碳与活性碳，溶于80％的(体积百分浓度)乙腈中制成等比例混合的石墨碳与活性碳混合物，装柱前充分混匀。然后进行如下的糖肽富集分离过程：
1)装柱：取适量的石墨碳与活性碳混合物溶液，装入Tip管内，制成长度5-8mm的ZipTip柱，并用80％(体积百分浓度)的乙腈溶液冲洗备用。
2)平衡：加入30μL pH3.0，0.2％(体积百分浓度)的甲酸溶液，30g离心10分钟，重复3次。
3)上样：双酶切好的样品，用甲酸溶液调样本溶液pH值为3.0，然后用pH3.0，0.2％(体积百分浓度)的甲酸溶液稀释到30μL，加到平衡好的ZipTip柱内，30g离心10分钟。
4)冲洗：20μL去离子水，30g离心10分钟，重复2次。
5)洗脱：10μL pH4.0，含有0.2％(体积百分浓度)甲酸的30％(体积百分浓度)乙腈溶液，30g离心5分钟，重复3次，并收集，即富集分离得到的糖肽溶液。
富集分离到的糖肽溶液冷冻抽干，-80℃保存以备质谱检测。
其结果分别见图4-6。
每次富集到的糖肽的相对强度列于表1。实验结果表明石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物用于糖肽的富集分离时具有较高的重现性。
表1.石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集糖肽三次重复实验的糖肽峰相对强度
括号内数值为糖肽的质荷比(m/z)，括号外数值为对应糖肽信号的相对强度(％)
3、石墨碳与活性碳不同混合比例对糖肽富集效率的影响
为了验证石墨碳与活性碳等比例混合富集糖肽的特异性，实验中将石墨碳与活性碳按不同质量比混合。所用石墨碳粒度范围为5-8μm，活性碳粒度范围为3-5μm。按照3∶0、2∶1、1∶1、1∶2及0∶3(质量比)的比例称取石墨碳与活性碳，分别溶于80％的乙腈中制成不同混合比例的石墨碳与活性碳混合物，装柱前充分混匀。然后进行如下的糖肽富集分离过程：
1)装柱：取适量的石墨碳与活性碳混合物溶液，装入Tip管内，制成长度5-8mm的ZipTip柱，并用80％(体积百分浓度)的乙腈溶液冲洗备用。
2)平衡：加入30μL pH3.0，0.2％(体积百分浓度)的甲酸溶液，30g离心10分钟，重复3次。
3)上样：双酶切好的样品，用甲酸溶液调样本溶液pH值为3.0，然后用pH3.0，0.2％(体积百分浓度)的甲酸溶液稀释到30μL，加到平衡好的ZipTip柱内，30g离心10分钟。
4)冲洗：20μL去离子水，30g离心10分钟，重复2次。
5)洗脱：10μLpH4.0，含有0.2％(体积百分浓度)甲酸的30％(体积百分浓度)乙腈溶液，30g离心5分钟，重复3次，并收集，即富集分离得到的糖肽溶液。
富集分离到的糖肽溶液冷冻抽干，-80℃保存以备质谱检测。
卵清蛋白质、胎球蛋白质及触珠蛋白β链的双酶切后分别利用上述不同石墨碳与活性碳比例装成的柱进行糖肽富集，结果见图7-9，每个蛋白质重复实验三次。由图7-9可知，当石墨碳与活性碳按质量等比例混合时，富集糖肽的效果最好。此时，在质谱图中糖肽是主要信号峰，非糖肽峰基本消失。根据质谱图中质谱信号的峰面积计算得到，糖肽纯度高于90％，回收率高于85％。
上述实验表明，石墨碳/活性碳(1∶1，质量比)混合物富集分离糖肽时表现出来的特异性不是二者物理化学性质的简单加和作用，而是二者高度协同作用的结果。
Claims (7)
1.一种糖肽富集分离材料，为质量比为1∶1的石墨碳和活性炭的混合物；
所述石墨碳粒度范围为5-8μm，所述活性碳粒度范围为3-5μm。
2.以权利要求1所述糖肽富集分离材料为填料的层析柱。
3.权利要求1所述的糖肽富集分离材料在富集分离糖肽中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用是利用权利要求1所述的糖肽富集分离材料作为层析柱的填料，富集分离糖肽；富集分离包括下述步骤：
1)用平衡液平衡层析柱；
2)将待分离的样品溶液过层析柱；
3)用去离子水冲洗层析柱；
4)用洗脱液洗脱，收集洗脱液；
所述平衡液的pH值为3.0；所述样品溶液的pH值为3.0；所述洗脱液的pH值为4.0。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述洗脱液为pH4.0，含有0.2％甲酸的30％的乙腈溶液；所述百分浓度为体积百分浓度。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述样品溶液为含待测样品，pH3.0，体积百分浓度为0.2％的甲酸溶液；所述百分浓度为体积百分浓度。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述平衡液为pH3.0，体积百分浓度为0.2％的甲酸溶液；所述百分浓度为体积百分浓度。
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