CN102268006B - 一种复合酶提取斑蝥素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合酶提取斑蝥素的方法，其是将斑蝥药材用纤维素酶和果胶酶复合酶酶解，将酶解产物用体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸混合液浸提，将浸提产物趁热抽滤后再向残渣中加入体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸浸提，合并两次滤液并旋蒸干，将所得固体用体积比为1-2:1-2的水-氯仿混合液溶解，萃取下层有机相后再将下层有机相旋蒸干，向所得固体中加入体积比为1-2:1-2的无水乙醇-石油醚混合液溶解，最后用丙酮重结晶，得到斑蝥素。本发明与传统提取法比较具有提取速度快、成本低、省时省力、提取率高、杂质含量少、易于纯化等优点，适宜大规模工业化生产。

Description

一种复合酶提取斑蝥素的方法
技术领域
本发明属于中药制药或原料加工领域，具体涉及一种复合酶法提取斑蝥素的方法。
背景技术
斑蝥，包括芫青科昆虫南方大斑蝥（大斑芫青）Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑蝥（眼斑芫青）M.cichorii Linnaeus，是一种用途极广的中药材，临床及药理研究表明斑蝥临床应用除抗癌外，尚有抗病毒、抑真菌、壮阳、升高白细胞等多种活性。斑蝥含斑蝥素、脂肪、蜡质、蚁酸和色素等物质，其中斑蝥素是主要有效成份。斑蝥素作为应用价值极高的抗癌药，对其应用的研究越来越引起世人的关注。
目前采用的斑蝥素的提取方法有酸法、碱法、渗辘法、混合提取法等，以上方法存在着提取不彻底、含量较低、产品中杂质多、品质不好等问题。在水提法和加热回流法提取过程中，由于操作温度高，斑蝥中的斑蝥素易发生分解；而在渗辘法提取过程中，虽然避免了高温带来的影响，但要达到较高的萃取效率需时间较长。新发展的技术如超声波提取、微波提取、高压提取和超临界萃取等方法，不但设备成本高，新工艺也尚不成熟。
发明人通过大量实验，提出了一种斑蝥素的酶法提取方法，该方法经济、环保、低能耗，且能最大程度地提取出斑蝥中的有效物质，并能应用于工业化生产。本发明的制备斑蝥素的新方法，在国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种简单易行、成本低廉、适于大规模生产的斑蝥素提取工艺。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种复合酶提取斑蝥素的方法，所述方法是将斑蝥药材用复合酶酶解，将酶解产物用体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸混合液浸提，将浸提产物趁热抽滤后再向残渣中加入体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸浸提，合并两次滤液并旋转蒸发干，将所得固体用体积比为1-2:1-2的水-氯仿混合液溶解，萃取下层有机相后再将下层有机相旋转蒸发干，向所得固体中加入体积比为1-2:1-2的无水乙醇-石油醚混合液溶解，最后用丙酮重结晶，得到斑蝥素；所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物；所述浓盐酸为37wt%的盐酸水溶液。
如上所述的方法，所述方法的步骤如下：
a. 称取斑蝥药材，粉碎至10-20目；
b. 将粉碎后的斑蝥药材加入水中，浸泡半小时，每500g药材加入纤维素酶0.8-2g，果胶酶1.6-4g；
c. 调pH至5.0-6.0，在40-50℃下水浴酶解2-4h，后煮沸2-5min使酶失活；
d. 将酶灭活后，加入体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸混合溶液，加溶液总量为药材重量的4-9倍；
e. 在40-70℃水浴中浸提20-26小时，趁热抽滤；
f. 滤毕，向残渣中加入体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸混合液600-6000mL浸提，趁热抽滤；
g. 将上述两次提取的滤液合并后旋转蒸发干；
h. 将蒸干后所得固体用体积比为1-2:1-2的水-氯仿共400-4000mL溶解，萃取下层有机相；
i. 将萃取的下层有机相旋转蒸发干；
j. 向蒸干后所得固体中加入体积比为1-2:1-2的无水乙醇-石油醚混合液共200-2000mL溶解；
k. 所得溶液用丙酮重结晶，即得斑蝥素。
如上所述的方法，其中，所述各酶的比活力为：纤维素酶60万U/g、果胶酶80万U/g。
如上所述的方法，其中优选地，步骤b中，所加水重量为斑蝥药材重量的1-2.5倍。
如上所述的方法，其中，所述斑蝥药材为芫青科昆虫南方大斑蝥（大斑芫青） Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑蝥（眼斑芫青） M.cichorii Linnaeus的干燥体。
本发明的有益效果为：
1、斑蝥素具有明显的抗病毒、抑菌、壮阳、升高白细胞等多种活性，用于制药，用途广泛，本发明提供了一种提取制备斑蝥素的新方法。
2、本发明的提取方法采用复合酶对原料进行酶解处理，成本低、对环境友好、产量高、纯度高，适宜工业化生产。本发明制得的斑蝥素提取率较普通的混合提取法提高50%以上。
3、本发明的提取方法操作简便，避免了反复重结晶带来的耗时。
4、本发明方法中未使用氨水等碱化措施，提取液澄清，粘度低，产品杂质少，后续处理方便。
附图说明
图1为斑蝥素酶标准品的HPLC图谱。
图2为斑蝥药材未加酶提取的HPLC图谱。
图3为斑蝥药材加酶提取的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1 
（1）取南方大斑蝥（Mylabris phalerata Pallas）药材500g，粉碎，过10-20目筛。
（2）用水浸润，每500g药材加入纤维素酶0.8g、果胶酶1.6g。
（3）HCl调pH至5.0，温度为50℃酶解2.5h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）将酶解产物用氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1.5:1:1）于66℃水浴中浸提24小时，将浸提产物热抽滤，向残渣中再加入氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1:2:1）浸提，热抽滤。
（5）合并两次滤液旋蒸干，所得固体用水-氯仿（体积比2:1）溶解，萃取下层有机相。
（6）再将下层有机相旋蒸近干，所得固体中加入无水乙醇-石油醚（体积比1:2）溶解，最后用丙酮重结晶，得斑蝥素。
经复合酶处理后，用氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比单纯的氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取提高了50%。
实施例2 
（1）取南方大斑蝥药材500g，粉碎，过10-20目筛。
（2）用水浸润，每500g药材加入纤维素酶1g、果胶酶1.8g。
（3）HCl调pH至5.8，温度为48℃酶解3h，而后煮沸4min，使酶失活。
（4）将酶解产物用氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1.5:1.5:1）于57℃水浴中浸提23小时，将浸提产品热抽滤，向残渣中再加入氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1:2:1.5）浸提，热抽滤。
（5）合并两次滤液旋蒸干，所得固体用水-氯仿（体积比2:1.5）溶解，萃取下层有机相。
（6）再将下层有机相旋蒸近干，所得固体中加入无水乙醇-石油醚（体积比1.5:2）溶解，最后用丙酮重结晶，得斑蝥素。
经复合酶处理后，用氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比单纯的氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取提高了56%。
实施例3 
（1）取黄黑小斑蝥（M.cichorii Linnaeus）药材500g，粉碎，过10-20目筛。
（2）用水浸润，每500g药材加入纤维素酶1.5g、果胶酶2.0g。
（3）HCl调pH至6.0，温度为45℃酶解2.5h，而后煮沸2min，使酶失活。
（4）将酶解产物用氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1.5:1:1）于70℃水浴中浸提25小时，将浸提产品热抽滤，向残渣中再加入氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1:2:1.5）浸提，热抽滤。
（5）合并两次滤液旋蒸干，所得固体用水-氯仿（体积比2:1.5）溶解，萃取下层有机相。
（6）再将下层有机相旋蒸近干，所得固体中加入无水乙醇-石油醚（体积比1.5:2）溶解，最后用丙酮重结晶，得斑蝥素。
经复合酶处理后，用氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比单纯的氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取提高了59%。
实施例4 
（1）取黄黑小斑蝥药材500g，粉碎，过10-20目筛。
（2）用水浸润，每500g药材加入纤维素酶1.4g、果胶酶2.2g。
（3）HCl调pH至5.7，温度为48℃酶解2h，而后煮沸5min，使酶失活。
（4）将酶解产物用氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1:2:1）于50℃水浴中浸提25小时，将浸提产品热抽滤，向残渣中再加入氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1:2:1.5）浸提，热抽滤。
（5）合并两次滤液旋蒸干，所得固体用水-氯仿（体积比2.5:1.5）溶解，萃取下层有机相。
（6）再将下层有机相旋蒸近干，所得固体中加入无水乙醇-石油醚（体积比1.5:2.5）溶解，最后用丙酮重结晶，得斑蝥素。
经复合酶处理后，用氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比单纯的氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取提高了53%。
实施例5 
（1）取黄黑小斑蝥药材500g，粉碎，过10-20目筛。
（2）用水浸润，每500g药材加入纤维素酶1.6g、果胶酶3.2g。
（3）HCl调pH至5.4，温度为47℃酶解2h，而后煮沸3min，使酶失活。
（4）用氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1:2:1.5）于42℃水浴中浸提23小时，将浸提产品热抽滤，向残渣中加入氯仿-无水乙醇-浓盐酸（体积比1:2.5:1.5）浸提。
（5）合并两次滤液旋蒸干，所得固体用水-氯仿（体积比2.0:1.0）溶解，萃取下层有机相。
（6）再将下层有机相旋蒸近干，所得固体中加入无水乙醇-石油醚（体积比1.5:2.0）溶解，最后用丙酮重结晶，得斑蝥素。
经复合酶处理后，用氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比单纯的氯仿-无水乙醇-浓盐酸提取提高了59%。
斑蝥素的含量检测
（1）称取斑蝥素标准品，采用高效液相色谱（HPLC）检测，色谱条件：柱型：C18；流动相：乙腈-水（体积比40:60）；流速：1mL/min；柱温：25℃。在273nm处测定峰面积，标准品的HPLC图谱见图1（斑蝥素保留时间t=7.2min）。
（2）斑蝥药材未加酶提取的HPLC图谱，见图2（斑蝥素保留时间t=7.2min）。
（3）斑蝥药材加酶提取的HPLC图谱，见图3（斑蝥素保留时间t=7.2min）。
（4）斑蝥药材未加酶提取和加酶提取斑蝥素的结果见表1。
表 1 酶法提取结果
提取方法 保留时间（min） 峰面积 斑蝥素含量（mg/mL）
酶解混合提取法 7.210 452193 2.727
未加酶混合提取法 7.231 11109 1.734
（5）结论
采用本发明的酶解混合提取法斑蝥素含量远较未加酶的混合提取法为高，可达2.727mg/mL，比药典提取法增加了（2.727-1.304）%/0.404=57.3%。

Claims (4)

1.一种复合酶提取斑蝥素的方法，其特征在于，所述方法是将斑蝥药材用复合酶酶解，将酶解产物用体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸混合液浸提，将浸提产物趁热抽滤后再向残渣中加入体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸浸提，合并两次滤液并旋转蒸发干，将所得固体用体积比为1-2:1-2的水-氯仿混合液溶解，萃取下层有机相后再将下层有机相旋转蒸发干，向所得固体中加入体积比为1-2:1-2的无水乙醇-石油醚混合液溶解，最后用丙酮重结晶，得到斑蝥素；所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物；所述浓盐酸为37wt%的盐酸水溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
a.称取斑蝥药材，粉碎至10-20目；
b.将粉碎后的斑蝥药材加入水中，浸泡半小时，每500g药材加入纤维素酶0.8-2g，果胶酶1.6-4g；
c.调pH至5.0-6.0，在40-50℃下水浴酶解2-4h，后煮沸2-5min使酶失活；
d.将酶灭活后，加入体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸混合溶液，加入溶液的总重量为药材重量的4-9倍；
e.在40-70℃水浴中浸提20-26小时，趁热抽滤；
f.滤毕，向残渣中加入体积比为1-2:1-2:1-2的氯仿-无水乙醇-浓盐酸混合液600-6000mL浸提，趁热抽滤；
g.将上述两次提取的滤液合并后旋转蒸发干；
h.将蒸干后所得固体用体积比为1-2:1-2的水-氯仿共400-4000mL溶解，萃取下层有机相；
i.将萃取的下层有机相旋转蒸发干；
j.向蒸干后所得固体中加入体积比为1-2:1-2的无水乙醇-石油醚混合液共200-2000mL溶解；
k.所得溶液用丙酮重结晶，即得斑蝥素。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b中，所加水重量为斑蝥药材重量的1-2.5倍。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述斑蝥药材为芫青科昆虫南方大斑蝥的干燥体或黄黑小斑蝥的干燥体。
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