CN102266590B - 壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料的制备方法 - Google Patents
壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，以溶剂浇注-粒子沥滤技术为基础，结合挤压法，采用粒径均一、表面多孔的高纯度SiO2微球为致孔剂，可通过改变SiO2微球的尺寸来调节多孔支架材料的孔隙大小，制备出不同孔径的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架。与传统的使用粘结剂将致孔剂密堆积排列的方法相比，本发明方法简单，操作方便，致孔剂密堆积效果好，制备出的多孔支架无粘结剂残留，通透性好，孔径均一，孔隙率和压缩强度高于纯壳聚糖多孔支架。试验结果表明，该支架具有良好的体外和体内生物相容性。
Description
技术领域
本发明属于材料技术领域，具体涉及一种多孔支架材料的制备方法。
背景技术
细胞外基质(Extra Cellular Matrix，ECM)在组织再生中起着重要的作用，它不仅具有连接、支持、保水、抗压及保护等物理学作用，对细胞的基本生命活动也发挥全方位的生物学作用，它影响细胞的存活、生长与死亡，决定细胞的形状，控制细胞的分化，参与细胞的迁移等等，因此制备支架的主要目标就是在暂时的三维空间中模拟自然ECM的功能，使支架能够引导每一个细胞反应，包括细胞黏附、移动、分裂到表型选择等。
组织工程支架材料的选择和制备是组织工程技术是否运用成功的关键。除了考虑材料的化学性质外，材料的物理性质如：孔隙率、机械强度、孔之间的连通性以及用于细胞粘附的表面积等也起着重要的作用。组织工程用支架需要较高的孔隙率，且孔径和支架的结构在组织的培养中也起着关键的作用。
致孔剂是形成孔径大小、材料内部结构的决定因素，致孔剂相互粘结，是保证三维支架孔隙相互连通的基础，也是实现高孔隙率的主要途径。Murphy等利用NaCl的吸潮性，预先将作为致孔剂的NaCl粘结、干燥成型，再通过溶液浇注-颗粒沥析技术，制备出孔隙间相互连通、其孔隙间通道的尺寸由粘结条件控制的多孔三维细胞支架，但NaCl吸潮的过程中其粒径、形态会发生改变，致使所形成的多孔支架孔隙大小不一，形状不规则。Ma等人利用石蜡软化融结性质，将石蜡微球粘结成型，浇注聚乳酸的吡啶溶液后，用环(正)己烷浸取石蜡，获得孔隙形态为球形，孔隙间相互连通、且通道尺寸可控的三维支架。但是，石蜡软化融结的过程中会破坏石蜡微球的球形结构，致使所形成的支架材料孔隙不规则，需要使用吡啶为溶剂且难以保证石蜡完全从支架中去除。曹谊林等人将粘结剂与离心技术结合，探索和研究了控制大体积致孔剂粘结程度的新方法(称为离心粘结技术)，制备出了粘结程度可控、结构均匀的大体积致孔剂粘结块，并得到内部结构可控的大体积三维细胞支架。但是粘结剂的大量加入和残留可能会对支架的性能产生一定的影响。You N.X.以自制射流装置制备聚己内酯微球，弧形凹槽将微球密堆积，但其需在真空下操作，增加了实验的难度。Tetsuo A.利用挤压法对无定形NaCl和蔗糖进行密堆积排列，方法简单，容易操作，密堆积效果好，但是由于采用NaCl和蔗糖为致孔剂，为了实现致孔剂最大程度的密堆积，需要施加很大的挤压力，这就会导致部分粒径均一的致孔剂碎裂，沥滤后所形成的支架材料孔隙不规则，孔径不均一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述制备方法的缺点，提供一种操作简单，孔径均一、孔隙规则、孔隙率高的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：
1、溶解壳聚糖和羟基磷灰石
以20g/L的乙酸水溶液为溶剂溶解壳聚糖、羟基磷灰石，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比为1∶0.05～0.3，搅拌4～8小时，离心去气泡，得到壳聚糖与羟基磷灰石的混合液。
2、制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料
以SiO2微球为致孔剂，将SiO2微球加入带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SiO2微球，SiO2微球的加入量为注射器容积的0.125～0.25，加入步骤1得到的壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量为SiO2微球体积的0.5～1，推动注射器的活塞柄，使混合液流过紧密排列的SiO2微球，将注射器置于真空干燥箱中干燥，从注射器中取出粘结块，用刀切去粘结块上、下表面层，将切去上、下表面层的粘结块置于0.05g/mL的NaOH水溶液中煮沸2～4小时，用水冲洗至中性，在冰箱中-5～-50℃预冻12～24小时，冷冻干燥，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
本发明的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，SiO2微球的粒径为100～150μm。
上述的SiO2微球(Spherical 140SL-II-PREP)由日本半井公司(NACALAI TESQUE，INC，KYOTO，TAPAN)生产，再经80目和100目标准筛筛分。
本发明的溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤1中，优选壳聚糖与羟基磷灰石的质量比为1∶0.1～0.2，最佳选择壳聚糖与羟基磷灰石按质量比为1∶0.2。
本发明的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维复合多孔支架材料步骤2中，SiO2微球的加入量最佳为注射器容积的0.25，壳聚糖与羟基磷灰石的混合液的加入量与SiO2微球的体积相同。
本发明的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，最佳将切去上、下表面层的粘结块置于0.05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小时。
本发明的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，最佳选择在冰箱中-20℃预冻24小时。
本发明以溶剂浇注-粒子沥滤技术为基础，结合挤压法，采用粒径均一、表面多孔的高纯度SiO2微球为致孔剂，可通过改变SiO2微球的尺寸来调节多孔支架材料的孔隙大小，制备出不同孔径的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架。与传统的使用粘结剂将致孔剂密堆积排列的方法相比，本发明方法简单，操作方便，致孔剂密堆积效果好，制备出的多孔支架无粘结剂残留，通透性好，孔径均一，孔隙率最高可达到90.94％、压缩强度为818kPa，远高于纯壳聚糖多孔支架。试验结果表明，该支架具有良好的体外和体内生物相容性。
附图说明
图1是实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架的扫描电镜图。
图2是实施例2制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架的扫描电镜图。
图3是空白组术后7天肌肉组织HE染色图。
图4是空白组术后14天肌肉组织HE染色图。
图5是空白组术后28天肌肉组织HE染色图。
图6是试验组术后7天植入部位临近肌肉组织HE染色图。
图7是试验组术后14天植入部位临近肌肉组织HE染色图。
图8是试验组术后21天植入部位临近肌肉组织HE染色图。
图9是空白组术后7天撕裂肌肉组织的HE染色图。
图10是空白组术后14天撕裂肌肉组织的HE染色图。
图11是空白组术后21天撕裂肌肉组织的HE染色图。
图12是试验组术后7天植入部位撕裂肌肉组织的HE染色图。
图13是试验组术后14天植入部位撕裂肌肉组织的HE染色图。
图14是试验组术后21天植入部位撕裂肌肉组织的HE染色图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
1、溶解壳聚糖和羟基磷灰石
将1g壳聚糖(脱乙酰度为80％～95％)、0.1g羟基磷灰石溶解于100mL 20g/L的乙酸水溶液中，搅拌6小时，离心去气泡，得到壳聚糖与羟基磷灰石的混合液。
2、制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料
以SiO2微球为致孔剂，将粒径为100～150μm的SiO2微球加入20mL带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SiO2微球，直至其在注射器中的位置不发生改变为止，SiO2微球的加入量为注射器容积的0.25，再向注射器中加入壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量与SiO2微球的体积相同，推动注射器的活塞柄，使混合液流过紧密排列的SiO2微球，将注射器置于真空干燥箱中60℃干燥24小时，从注射器中取出粘结块，用刀切去粘结块上、下表面层，将切去上、下表面层的粘结块置于0.05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小时，用水冲洗至中性，在冰箱中-20℃预冻12～24小时，用液氮预冻30分钟，-50℃冷冻干燥24小时，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
所制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料采用Quanta200环境扫描电子显微镜进行形貌表征，结果见图1，并按照下述方法测试支架材料的孔隙率和压缩强度：
将比重瓶装满乙醇称重W1；将重Ws的样品浸入乙醇中，真空脱气，乙醇充盈于多孔支架中，再加满乙醇称重W2；取出浸满乙醇的样品，剩余的乙醇与比重瓶称重W3。按下式计算支架孔隙率ε：
ε＝Vp/(Vp+Vs)＝(W2-W3-Ws)/(W1-W3)
将支架材料制成直径为12mm、高10mm的圆柱体试样，在温度为25℃，采用动态粘弹谱仪按照GB/T1041-1992，以1N/分钟的变化速率在1～13N斜坡力的作用下，测其应变为25％的应力值。在测试过程中，试样在变形小于25％之前断裂，断裂强度即为压缩强度；试样在变形25％还没有断裂，变形25％时的强度即为压缩强度。每组取5个样品，取测试结果的平均值。
实验结果表明，该复合多孔支架的孔是开放的，孔与孔之间连通性较好，孔隙呈规则的圆孔，平均孔径为125μm，孔隙率为90.94％，压缩强度为794kPa。
实施例2
在实施例1的配制壳聚糖/羟基磷灰石混合液步骤1中，将1g壳聚糖(脱乙酰度为80％～95％)、0.2g羟基磷灰石溶解于100mL 20g/L的乙酸水溶液中，搅拌6小时，离心去气泡。其他步骤与实施例1相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料。
按照试验1的方法进行形貌表征和孔隙率、压缩强度测试，实验结果表明该复合多孔支架的孔是开放的，孔与孔之间连通性较好，平均孔径为117μm(见图2)，孔隙率为91.97％，压缩强度为818kPa。
实施例3
本实施例的溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤1中，将1g壳聚糖(脱乙酰度为80％～95％)、0.05g羟基磷灰石溶解于100mL 20g/L的乙酸水溶液中，搅拌4小时，离心去气泡。其他步骤与实施例1相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料。
实施例4
本实施例的溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤1中，将1g壳聚糖(脱乙酰度为80％～95％)、0.3g羟基磷灰石溶解于100mL 20g/L的乙酸水溶液中，搅拌8小时，离心去气泡。其他步骤与实施例1相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料。
实施例5
在实施例1～4的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，将粒径为100～150μm的SiO2微球加入20mL带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SiO2微球，直至其在注射器中的位置不发生改变为止，SiO2微球的加入量为注射器容积的0.125，该步骤的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
实施例6
在实施例1～4的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，将粒径为100～150μm的SiO2微球加入20mL带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SiO2微球，直至其在注射器中的位置不发生改变为止，SiO2微球的加入量为注射器容积的0.2，该步骤的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
实施例7
在实施例1～6的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，向注射器中加入壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量为SiO2微球体积的0.5，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
实施例8
在实施例1～6的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，向注射器中加入壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量为SiO2微球体积的0.75，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
实施例9
在实施例1～8的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，将切去上、下表面层的粘结块置于0.05g/mL的NaOH水溶液中煮沸2小时，用水冲洗至中性，在冰箱中-5℃预冻24小时，用液氮预冻30分钟，-50℃冷冻干燥24小时，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
实施例10
在实施例1～8的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，将切去上、下表面层的粘结块置于0.05g/mL的NaOH水溶液中煮沸4小时，用水冲洗至中性，在冰箱中-50℃预冻12小时，用液氮预冻30分钟，-50℃冷冻干燥24小时，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
为了证明本发明的有益效果，发明人对本发明实施例1和实施例2制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料进行了各种实验室研究试验，各种试验情况如下：
实验材料：第3代骨肉瘤细胞购于中国典型培养物保藏中心(武汉)；健康雄性SD大鼠，体重200～220g，购于西安交通大学医学院实验动物中心(西安)；Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)细胞培养液、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜，购于美国Sigma-Aldrich公司；白细胞介素1β试剂盒、白细胞介素6试剂盒、白细胞介素10试剂盒、肿瘤坏死因子TNF-α试剂盒，由美国R&D公司生产。
实验仪器：Zenyth 3100酶标仪，由奥地利Anthos公司生产；Q800DMA动态粘弹谱仪、由美国TA公司生产；RM2126组织切片机由德国LEICA公司生产。
1、多孔支架的体外活性实验
将直径为14mm、厚度为2mm的截面片状支架用60Co辐照消毒后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液浸湿，然后置于24孔板内，每孔1片支架；将第3代骨肉瘤细胞加入含10％胎牛血清的DMEM培养液中，得到细胞浓度为3×108个/L的细胞悬液，每片支架上均匀滴加100μL细胞悬液，静置4小时后再沿孔壁缓慢加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，每孔加1.5mL；将24孔板置于37℃、5％CO2、95％相对湿度的CO2培养箱中培养。
实验分为受试材料组、阴性对照组(空白组)、阳性对照组(含0.64％苯酚的DMEM培养液)。将受试材料组(实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石多孔支架材料)分别在CO2培养箱中培养24、48、72小时(分别做三组平行实验)，吸弃培养基，用PBS缓冲溶液清洗受试材料3次，置于新的培养板中，每孔1片支架，每孔加入1mL DMEM细胞培养液和40μL 5mg/mL的MTT水溶液，37℃孵育4小时，吸弃上清液，每孔加入420μL二甲基亚砜，振荡10分钟，每孔吸取150μL至96孔板，用酶联免疫检测仪检测其在490nm波长处的吸光度值OD(测得的吸光度值OD与细胞增殖数成正比)，每个时间点每组平行测定5孔计算均数和标准差。按下式计算相对增殖率RGR并评价材料的细胞毒性：
RGR＝ODtest/ODcontast×100％
式中RGR为细胞毒性实验相对增殖率(％)；ODtest为试验组吸光值；ODcontast为阴性对照组吸光值。表1是不同的RGR所对应的细胞毒性等级。
表1 相对增值率与细胞毒性分级的关系
| RGR | ≥100 | 75-99 | 50-74 | 25-49 | 1-24 | 0 |
| 细胞毒性分级 | 0 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ | Ⅴ |
采用骨肉瘤细胞对实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石多孔支架材料进行毒性评价，实验结果可以客观反映材料的细胞毒性，结果如表2所示。
表2 壳聚糖/羟基磷灰石的细胞毒性
由表2可见，壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的毒性反应分级都呈0级或Ⅰ级，根据GB/T 16886.5-2003，0级和Ⅰ级表示无细胞毒性，说明本发明制备的壳聚糖/羟基磷灰石多孔支架无体外细胞毒性，具有良好的生物相容性。
2、多孔支架的体内活性实验
取SD大鼠9只，随机分为3组每组3只，用质量分数为5％的戊巴比妥钠水溶液按30mg/kg体重腹腔麻醉大鼠，固定大鼠，选取脊背两侧为植入部位，剪去表面绒毛，消毒，在其脊柱两侧各剪开1个长约1.5cm的小切口，一组大鼠皮下植入实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料、一组大鼠皮下植入实施例2制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料，缝合皮肤，剩下一组不植入任何材料作为空白对照，只是按实验组方法进行常规的手术操作。将三组大鼠置于通风条件下，所有动物均可以自由饮水和饮食。三组中的三只大鼠分别在7天、14天和28天时通过注射致死剂量的戊巴比妥钠处死动物。仔细切取与支架材料相连的1cm内的肌肉组织，迅速用液氮冷冻，用ELSA试剂盒测定支架材料植入部位的临近肌肉组织的白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10和肿瘤坏死因子TNF-α的含量，动态定量研究支架植入后体内生物相容性。
(1)SD大鼠白细胞介素1β的测定
本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法。将标准品(白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α)、待测样品(所取肌肉组织匀浆后的组织液)分别加入到预先包被大鼠白细胞介素1β单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物3，4，5-三甲氧基苯甲醛，底物在辣根过氧化物酶催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中大鼠白细胞介素1β浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和待测样品的OD值，计算样本中大鼠白细胞介素1β的含量。所有数据用spss17.0统计软件进行统计处理，采用单因素方差检验进行差异性分析，其中差异为P＜0.05，差异显著为P＜0.01。
经测试，白细胞介素1β的标准曲线方程为：y＝27.106x-5.1807，相关系数R2＝0.9973。表3是三组大鼠在术后7、14、28天时所取肌肉组织中白细胞介素1β的含量。
表3 白细胞介素1β含量(pg/mL)
| 样品 | 7天 | 14天 | 28天 |
| 空白对照 | 27.40±0.58 | 23.71±0.28 | 18.86±0.45 |
| 实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 29.13±0.14 | 24.65±0.36 | 18.83±0.76 |
| 实施例2制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 23.36±0.54 | 22.55±0.12 | 20.31±0.99 |
由表3可见，三组大鼠肌肉组织中的白细胞介素1β的含量无差异(P＞0.05)，并且随着植入时间的延长，三组大鼠肌肉组织中的白细胞介素1β含量逐渐变小，说明本发明制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架的植入不会引起白细胞介素1β含量的明显变化。
(2)SD大鼠白细胞介素6的测定
SD大鼠白细胞介素6的测定方法与试验(1)中白细胞介素1β的测定方法相同。经测试，白细胞介素6的标准曲线方程为：y＝84.773x-19.726，相关系数R2＝0.996。表4是三组大鼠在术后7、14、28天时所取肌肉组织中白细胞介素6的含量。
表4 白细胞介素6含量(pg/mL)
| 样品 | 7天 | 14天 | 28天 |
| 空白对照 | 140.86±1.71 | 120.31±4.02 | 100.48±3.13 |
| 实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 145.09±1.56 | 122.84±3.12 | 102.28±2.56 |
| 实施例2制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 116.27±9.22 | 106.02±14.32 | 100.63±3.16 |
由表4可见，三组大鼠肌肉组织中的白细胞介素6的含量无差异(P＞0.05)，并且随着植入时间的延长，三组大鼠肌肉组织中的白细胞介素6含量逐渐变小，说明本发明制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架的植入也不会引起白细胞介素6含量的明显变化。
(3)SD大鼠白细胞介素10的测定
SD大鼠白细胞介素10的测定方法与试验(1)中白细胞介素1β的测定方法相同。经测试，白细胞介素10的标准曲线方程为：y＝44.794x-9.258，相关系数R2＝0.9965。
实验和计算结果见表5，表5是三组大鼠在术后7、14、28天时所取肌肉组织中白细胞介素10的含量。
表5 白细胞介素10含量(pg/mL)
| 样品 | 7天 | 14天 | 28天 |
| 空白对照 | 30.64±1.65 | 36.75±0.35 | 60.26±0.32 |
| 实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 33.22±0.70 | 48.94±0.57 | 57.86±0.63 |
| 实施例2制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 50.13±8.77 | 56.34±0.08 | 59.31±0.76 |
由表5可见，三组大鼠肌肉组织中的白细胞介素10的含量无差异(P＞0.05)，说明本发明制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架的植入也不会引起白细胞介素10含量的明显变化。但是随着植入时间的延长，三组大鼠肌肉组织中的白细胞介素10含量逐渐变大，说明随着支架材料植入时间的延长，产生细胞介素10的炎性浸润有所加剧。
(4)SD大鼠肿瘤坏死因子α的测定
SD大鼠肿瘤坏死因子α的测定方法与试验(1)中白细胞介素1β的测定方法相同。经测试，肿瘤坏死因子α的标准曲线方程为：y＝192.72x-31.476，相关系数R2＝0.9984。
实验和计算结果见表6，表6是三组大鼠在术后7、14、28天时所取肌肉组织中肿瘤坏死因子α的含量。
表6 肿瘤坏死因子含量(pg/mL)
| 样品 | 7天 | 14天 | 28天 |
| 空白对照 | 176.51±14.11 | 160.63±12.55 | 132.42±7.58 |
| 实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 193.86±10.63 | 173.62±3.63 | 137.97±4.50 |
| 实施例2制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 170.25±12.58 | 155.79±16.32 | 133.63±2.18 |
由表6可见，三组大鼠肌肉组织中的肿瘤坏死因子α的含量无差异(P＞0.05)，并且随着植入时间的延长，三组大鼠肌肉组织中的肿瘤坏死因子α含量逐渐变小，说明本发明制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架的植入也不会引起肿瘤坏死因子α含量的明显变化。
(5)SD大鼠血常规白细胞总数测定
分别在术后第7、14、21、28天的时候对三组SD大鼠进行鼠尾取血，在全血模式下进行血常规分析，测其白细胞总数，测试结果见表7。
表7 白细胞总数
| 样品 | 7天 | 14天 | 21天 | 28天 |
| 空白对照 | 6.6×109 | 13.9×109 | 11.4×109 | 5.5×109 |
| 实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 12.5×109 | 10.9×109 | 9.3×109 | 7.5×109 |
| 实施例2制备的壳聚糖/羟基磷灰石 | 8.3×109 | 19.3×109 | 12.5×109 | 9.8×109 |
由表7可见，支架材料的植入会引起血液中白细胞数量的变化，随着植入时间的延长，血液中白细胞数量增加，在支架材料的植入14天后炎性逐渐消失，白细胞数量逐渐恢复正常值，说明支架材料的植入会引起大鼠微弱的炎性反应，但是这是机体免疫可以克服的。
(6)SD大鼠组织HE染色观察
取植入实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架7、14、21天后植入部位临近肌肉组织(试验组)和空白组的肌肉组织，用福尔马林浸泡7天，经过组织脱水、脱色、脱蜡，组织包埋、组织切片，作HE染色，显微镜下观察组织病理改变。图3～5依次是空白组术后7、14、21天肌肉组织HE染色图。图6～8依次是试验组术后7、14、21天植入部位临近肌肉组织HE染色图。
由图3～8可见，空白组和试验组的肌肉细胞均排列规则，胞质和胞核清晰可见，肌肉细胞形态及排列方式并未出现显著差异，术后7、14、28天都未出现明显的炎性细胞浸润现象，即本发明壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的植入并没有对植入部位肌肉组织带来强烈的炎性反应，说明支架材料无毒且具有一定的生物亲和性。
图9～11依次是空白组术后7、14、21天撕裂肌肉组织HE染色图。图12～14依次是试验组术后7、14、21天植入部位撕裂肌肉组织HE染色图。由图可见，空白组和试验组撕裂部位肌肉组织中有少量胞核与其他肌肉细胞形态不同的细胞出现，在肌纤维中有少量长条状的胞核，空白组和试验组术后7、14、28天撕裂肌肉组织并未发现明显的差异，炎性细胞数量很少，说明并没有强烈的炎性反应发生。长条状的细胞为纤维细胞，它的出现表征着创伤的肌肉组织正在恢复。
由上述试验可见，SD大鼠植入支架材料部位肌肉组织中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量变化结合统计学分析得出壳聚糖/羟基磷灰石多孔支架材料的植入不会使肌肉组织产生明显的炎性反应，通过对血液中白细胞数目的测定以及HE组织染色观察，进一步验证了支架材料具有良好的体内生物相容性。
Claims (6)
1.一种壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于由下述步骤组成：
(1)溶解壳聚糖和羟基磷灰石
以20g/L的乙酸水溶液为溶剂溶解壳聚糖、羟基磷灰石，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比为1∶0.05～0.3，搅拌4～8小时，离心去气泡，得到壳聚糖与羟基磷灰石的混合液；
(2)制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料
以粒径为100～150μm的SiO2微球为致孔剂，将SiO2微球加入带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SiO2微球，SiO2微球的加入量为注射器容积的0.125～0.25，加入步骤(1)得到的壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量为SiO2微球体积的0.5～1，推动注射器的活塞柄，使混合液流过紧密排列的SiO2微球，将注射器置于真空干燥箱中干燥，从注射器中取出粘结块，用刀切去粘结块上、下表面层，将切去上、下表面层的粘结块置于0.05g/mL的NaOH水溶液中煮沸2～4小时，用水冲洗至中性，在冰箱中-5～-50℃预冻12～24小时，冷冻干燥，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于在溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤(1)中，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比为1∶0.1～0.2。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于：在溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤(1)中，壳聚糖与羟基磷灰石按质量比为1∶0.2。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于：在制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤(2)中，SiO2微球的加入量为注射器容积的0.25，壳聚糖与羟基磷灰石的混合液的加入量与SiO2微球的体积相同。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于：在制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤(2)中，将切去上、下表面层的粘结块置于0.05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小时。
6.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于：在制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤(2)中，所述的预冻是在冰箱中-20℃预冻24小时。
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