CN102266358A

CN102266358A - 一种鲍氏层孔菌子实体总黄酮及其制备方法

Info

Publication number: CN102266358A
Application number: CN 201110241866
Authority: CN
Inventors: 杨焱; 刘艳芳; 王晨光; 王钦博; 唐庆九; 张劲松; 汪文瀚; 周帅
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-08-22
Filing date: 2011-08-22
Publication date: 2011-12-07

Abstract

本发明公开了一种鲍氏层孔菌子实体总黄酮，其是通过用70-95％的乙醇提取，挥去乙醇的浓缩液放置于4℃冷库中，静置过夜，析出的沉淀部分取出后冷冻干燥制备得到。制备得到的总黄酮具有很强的对超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢自由基、DPPH自由基的清除作用，因而可用于制备抗辐射、抗氧化、抗衰老的保健产品或药品，还可用于心脑血管疾病的预防及治疗等，应用前景广泛。

Description

一种鲍氏层孔菌子实体总黄酮及其制备方法

技术领域：

本发明涉及药用真菌提取领域，具体地说涉及一种鲍氏层孔菌子实体总黄酮及其制备方法。

背景资料：

鲍氏层孔菌(Phellinus baummii Pilat)，隶属担子菌亚门(Basidiomyeotina)，层菌纲(Hymenomycetes)、多孔菌目(polyporales)、锈革孔菌科(Hymenochaetacae)，木层孔菌属(Phellinus)，俗名桑黄，是继灵芝之后又一具有较高生物活性的药用真菌，韩国市场非常热销，也受到国内食用菌栽培农户的极大关注。但由于桑黄与灵芝一样不能作为餐桌食品食用，促进其栽培发展和产业化进程必须要开发出相应的功能性食品或药品。上海市农科院食用菌研究所在“桑黄的人工驯化及生物活性物质的开发利用”项目研究中发现，鲍氏层孔菌子实体中含有大量的黄酮类物质，这类物质具有较好的抗氧化、修复神经细胞PC12氧化损伤的作用；而在其它食药用真菌中少有黄酮类化合物的报道。国内外目前尚无对鲍氏层孔菌子实体黄酮的开发利用报道，市场上也未见有相关产品。

抗氧化活性是诸多生物活性中最重要的活性之一，酶和非酶的抗氧化物质在保护机体免受氧化应激损伤方面起着至关重要的作用。随着人们生活方式、饮食结构以及外界环境的变化，心血管、肿瘤等疾病已经呈现出逐年上升的趋势。心血管疾病在发展中国家被列为五大致死的首要因素，而在发达国家中，则成为导致死亡的最主要因素。常见的心血管疾病大都与氧化应激有着紧密的联系。因此，清除体内自由基的抗氧化反应对人类的生活健康有着重要的意义。

对于黄酮类化合物的提取分离，已有很多相关的文献报道，但制备纯度高的黄酮类物质通常也只限于实验室水平。在实验室分离制备较高纯度的黄酮类物质通常需要采用多种分离材料，如大孔树脂、聚酰胺、硅胶等，可获得较高纯度或单一的黄酮化合物。

但是，如果将上述生产方法应用于工业化生产过程，则使用诸多的分离材料不仅成本高，操作繁琐，而且还会有很多填料的残留(如大孔吸附树脂)难以去除，制备的产品也存在安全性的问题。因此，在工业化制备过程中要避免使用较多的分离材料，还需要开发出能大量制备鲍氏层孔菌子实体较高纯度总黄酮的工艺技术。

发明内容：

本发明首先提供了一种鲍氏层孔菌子实体总黄酮，其是通过如下方法制备得到的：

用70-95％的乙醇提取。

优选的为：

用70-95％的乙醇60-80℃加热回流提取的方法得到。

具体的为：用70-95％的乙醇60-80℃加热回流提取，提取液除去乙醇后，再加水浓缩，浓缩液放置于4℃冷库中，静置过夜，抽去上清液；析出的沉淀部分取出后冷冻干燥得到

进一步优选的乙醇浓度为80％，优选的加热回流温度为70℃。

本发明还提供了一种制备上述鲍氏层孔菌子实体总黄酮的方法，该方法为：

用70-95％的乙醇提取。

优选的方法为：

用70-95％的乙醇60-80℃加热回流提取。

具体地说该方法为：

用70-95％的乙醇60-80℃加热回流提取，提取液除去乙醇后，再加水浓缩，浓缩液放置于4℃冷库中，静置过夜，抽去上清液；析出的沉淀部分取出后冷冻干燥得到。

进一步优选的乙醇浓度为80％，优选的加热回流温度为70℃。静置过夜的温度为4℃。

具体的制备方法见附图1。

具体的步骤为：

将鲍氏层孔菌子实体粉碎，用70-95％的食用级乙醇室温下浸泡1小时，料液比1∶12(重量公斤比体积升)，60-80℃加热回流提取2小时，过滤，储存滤液；残渣再用80％乙醇60-80℃热回流提取1小时，料液比1∶6(重量公斤比体积升)，过滤，合并两次提取滤液；于40℃下减压浓缩，待蒸去大部分乙醇后，再加50L水继续减压浓缩，浓缩至比重0.96-0.97(50℃热测)，放出浓缩液；浓缩液放置于4℃冷库中，静置过夜，抽去上清液；析出的沉淀部分取出后冷冻干燥，得到鲍氏层孔菌子实体总黄酮提取物。

本发明的创新之处：

1、本发明开发的鲍氏层孔菌子实体总黄酮，其制备工艺流程简单，制备得到的桑黄总黄酮含量达70％以上；得率达到5％以上。

2、制备得到的黄酮具有很强的对超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢自由基、DPPH自由基的清除作用，因而可用于制备抗辐射、抗氧化、抗衰老的保健产品或药品，还可用于心脑血管疾病的预防及治疗等，应用前景广泛。

附图说明

图1：鲍氏层孔菌子实体总黄酮制备方法路线图

图2：实施例1的鲍氏层孔菌子实体总黄酮对超氧阴离子的清除作用

图3：实施例1的鲍氏层孔菌子实体总黄酮对羟基自由基的清除作用

图4：实施例1的鲍氏层孔菌子实体总黄酮对过氧化氢自由基的清除作用

图5：实施例1的鲍氏层孔菌子实体总黄酮对DPPH自由基的清除作用

图6：实施例1的鲍氏层孔菌子实体总黄酮还原力测定实验

具体实施方式：

下面的实施例中所用的鲍氏层孔菌子实体菌种(Phellinus baummiiPilat)来自中国微生物菌种保藏中心上海食用菌分中心，编号为：Phellinusbaumii Pilat 3249。

实施例1：

1、鲍氏层孔菌子实体去杂质清洗：将鲍氏层孔菌子实体原料加水清洗，去除杂质后晒干，再用粉碎机粉碎成小块状备用。

2、乙醇热回流提取及浓缩：称取上述粉碎后的子实体50kg，加入80％食用级乙醇600L，室温下浸泡1h，再70℃加热回流提取2h，过滤，储存滤液；残渣中再加入300L 80％乙醇，70℃热回流提取1h，过滤，合并两次提取滤液；于40℃下减压浓缩，待蒸去大部分乙醇后，再加50L水继续减压浓缩，浓缩至比重为0.96(50℃条件下测定)，放出浓缩液。

3、浓缩液冷藏静置：将上述浓缩液置于桶中，放于4℃冷库中，静置过夜，抽去上清液。

4、干燥：析出的沉淀部分取出后冷冻干燥，得到鲍氏层孔菌总黄酮提取物2.6kg。

经化学比色法测定，制备得到的鲍氏层孔菌总黄酮提取物中黄酮含量达到73.5％。

实施例2：

2、乙醇热回流提取及浓缩：称取上述粉碎后的子实体50kg，加入80％食用级乙醇600L，室温下浸泡1h，再70℃加热回流提取2h，过滤，储存滤液；残渣中再加入300L 80％乙醇，70℃热回流提取1h，过滤，合并两次提取滤液；于40℃下减压浓缩，待蒸去大部分乙醇后，再加50L水继续减压浓缩，浓缩至比重为0.97(50℃条件下测定)，放出浓缩液。

4、干燥：析出的沉淀部分取出后冷冻干燥，得到鲍氏层孔菌总黄酮提取物2.8kg。

经化学比色法测定，制备得到的鲍氏层孔菌总黄酮提取物中黄酮含量达到71.8％。

实施例3

将实施例1中得到的总黄酮应用于如下实验：

1.清除超氧阴离子实验

采用化学发光法，Clarity PC化学发光仪进行测定。用70％乙醇将中试黄酮样品配制成不同浓度(20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)。使用鲁米诺-邻苯三酚-CBS体系的化学发光法，用70％乙醇作为空白，分别取10μL样品液和空白液加入96孔板，由泵1注入10μL6.25×10^-4mol/L邻苯三酚溶液，再由泵2注入150μL鲁米诺-CBS溶液(pH10.2)，在20℃启动发光反应，每0.6s记录一次发光值，连续记录30s。

超氧阴离子的清除率计算公式如下：

结果(附图2)表明，随着浓度的增加，实施例1的总黄酮对超氧阴离子的清除率增加，具有剂量依赖性。在500μg/mL时清除率可达50％以上。

2.清除羟基自由基实验

采用化学发光法，Clarity PC化学发光仪进行测定。用70％乙醇将中试黄酮样品配制成不同浓度(1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)。先于96孔板中加入10μL 1mmol/LCuCl和10μL 1mmol/L邻菲罗啉，再加入10μL不同浓度的样品液，以70％乙醇作为空白。由泵1注入10μL 6％H₂O₂，再由泵2注入150μL鲁米诺-CBS溶液(pH8.5)，在20℃启动发光反应，每0.6s记录一次发光值，连续记录30s。羟基自由基清除率公式同超氧阴离子清除率计算公式。

结果(附图3)表明，随着浓度的增加，实施例1的总黄酮对羟基自由基的清除率增加，具有剂量依赖性。在10μg/mL时清除率可达50％以上。说明实施例1的总黄酮有较强的清除羟基自由基的作用。

3.清除H₂O₂自由基实验

采用化学发光法，Clarity PC化学发光仪进行测定。用70％乙醇将中试黄酮样品配制成不同浓度(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)，以70％乙醇作为空白。分别取5μL样品液和空白液加入96孔板，由泵1注入150μL鲁米诺-CBS溶液(pH9.5)，再由泵2注入10μL 6％H₂O₂，在20℃启动发光反应，每0.6s记录一次发光值，连续记录30s。过氧化氢自由基清除率公式同超氧阴离子清除率计算公式。

结果(附图4)表明，随着浓度的增加，实施例1的鲍氏层孔菌总黄酮对过氧化氢自由基的清除率增加，具有剂量依赖性。在100μg/mL时清除率可达50％以上，对过氧化氢自由基有较好的清除作用。

4.清除DPPH自由基实验

取6×10^-4mol/L DPPH的储备液100μL加900μL70％乙醇，稀释成6×10^-5mol/L DPPH工作液。用70％乙醇将中试黄酮样品配制成不同浓度(1μg/mL、20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)。分别取100μL不同浓度的样品液加入1mL DPPH工作液中，混匀，静置20min后于517nm处测定吸光值，以70％乙醇作为空白。对DPPH自由基清除率计算如下：

结果(附图5)表明，随着浓度的增加，实施例1的鲍氏层孔菌总黄酮对DPPH自由基的清除率增加，在达到一定值时基本趋于稳定值。在低浓度时增加的较快，在100μg/mL时清除率可达50％以上。

5.还原力测定

用70％乙醇将中试黄酮样品配制成不同浓度(1μg/mL、5μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，以70％乙醇作为空白对照。分别取不同浓度样品液500μL于试管中，依次加入500μL 0.2mol/L PBS(pH6.6)、500μL 1％铁氰化钾后于50℃水浴20min。急速冷却后加入500μL 10％三氯乙酸，3000g离心10min取上清500μL，加入400μL蒸馏水和100μL氯化铁，充分摇匀，静置10min，于700nm处测吸光值。700nm吸光值反映普鲁士蓝的生成量，吸光度值越大，样品还原力值愈强，表示抗氧化效果愈佳。

从实验结果(附图6)来看，实施例1的鲍氏层孔菌总黄酮的吸光值随浓度的升高而变大，基本呈线性相关，说明鲍氏层孔菌总黄酮具有还原力，并存在浓度依赖性。

Claims

1.一种鲍氏层孔菌子实体总黄酮，其特征在于其是通过如下方法制备得到的：

用70-95％的乙醇提取。

2.根据权利要求1所述的鲍氏层孔菌子实体总黄酮，其特征在于所述的方法为：

用70-95％的乙醇60-80℃加热回流提取。

3.根据权利要求1或2所述的鲍氏层孔菌子实体总黄酮，其特征在于所述的乙醇为80％，所述的加热回流温度为70℃。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述鲍氏层孔菌子实体总黄酮的方法，其特征在于该方法为：

用70-95％的乙醇提取。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于该方法为：

用70-95％的乙醇60-80℃加热回流提取。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于该方法为：

用70-95％的乙醇60-80℃加热回流提取，提取液除去乙醇后，冷静置过夜，除去上清液后，沉淀进行冷冻干燥得到。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的乙醇为80％，所述的加热回流温度为70℃。