CN102260708A - 硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体、构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体、构建方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明在植物双元表达载体pCA1300-Ubi的PstI和SacI酶切位点之间插入由基因Rs-AFP1和pMD18T载体构建的重组质粒，获得硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体，然后通过农杆菌介导法转化水稻并获得相应的转基因植株。对鉴定为阳性的转基因植株提取总蛋白液进行稻瘟病菌体外的抗性鉴定、田间自然发病情况下的抗病性观察以及对转基因植株进行室内苗期稻瘟病菌接种性鉴定，为进一步获得并提高水稻抗稻瘟病的能力，解决我国的粮食、资源和环境等问题具有积极的指导作用。

Description

硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体、构建方法及应用

技术领域

本发明涉及硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物表达载体、构建方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

硫堇蛋白(Thionins)是一类广泛存在于植物中的小分子(约5KD)生物活性肽，其家族成员较多，序列中富含半胱氨酸，可抑制消化酶的活性，并可通过与膜蛋白及脂质分子相互作用来抵抗及杀灭细菌及真菌等病原微生物的碱性蛋白。谷类单子叶植物及双子叶植物中均存在这类小分子肽，目前已从15种植物物种中分离出100多种硫堇蛋白。根据在植物中的进化关系，硫堇蛋白可分为α、β及γ类，其中α与β硫堇蛋白在空间结构上比较接近，而γ类硫堇蛋白因在构象与功能上与哺乳动物、昆虫防御素的空间构象及生物学功能相似，因此也可称其为植物防御素。Terras等研究发现，从十字花科植物中分离到的若干种植物防御素，如：Rs-AFP2、Dm-AFP1(大丽花属(Dahlia merckii)的抗病菌抵御素基因)等对几种植物致病真菌如B.cinema、A.brassicicola、F.culmorum的菌丝生长具有抑制作用，且已有研究表明，将外源编码硫堇蛋白的基因利用基因工程的方法转化入宿主植物中使之过表达，可改善并提高宿主植物的系统抗病能力。例如，在烟草中高水平表达一个从大麦中分离的硫堇蛋白类hordothionin基因提高了转基因烟草对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性；Iwai等在水稻中过表达一个从燕麦中分离到的细胞壁结合硫堇蛋白基因，显著提高了转基因水稻对多种细菌病害的抗性。1992年，Terras等从萝卜(Raphanus Sativus)种子中分离了一类6KD富含半胱氨酸的抗真菌蛋白，研究发现它主要由Rs-AFP1和Rs-AFP2两部分组成，二者含量几乎相等，它们主要通过引起菌丝过度分枝或抑制菌丝顶端生长，对植物的病原真菌发挥广谱抗性，且对细菌和人体培养细胞没有影响。表达模式研究显示，Rs-AFPs主要存在于萌发萝卜种子的子叶、胚轴和胚乳外层细胞的细胞壁中，且较其它类蛋白优先起作用，通过同化学杀真菌剂类似的作用机制，对作物种子及植物体所携带或感染的病原真菌进行抑制或杀灭。Terras还把Rs-AFP2划分为15个肽段进行研究，结果表明，肽段的第6、7、8、9组成了该基因的Cys27到Cys47区域，对许多真菌物种都表现出了抗真菌活性，并对阳离子有很强的敏感性。其中Tyr38对抗真菌活性影响起很大的作用。由于这种抗病相关特征结构域的存在，使硫堇蛋白基因Rs-AFPs在抗真菌性病害育种中，具有较好的应用性，在烟草、小麦、水稻、棉花等转基因抗病性育种方面均有报道。胡新文等(1996)在国内克隆到Rs-AFP1和Rs-AFP2基因，并将其插入pET-22b(+)，构建了表达载体，导入E.coli，用转化菌与对照菌裂解提取液对芭蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)进行抑菌试验，发现前者具有强的抗真菌活性。1999年，中科院上海植生所的转萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP1基因棉花在河南、北京已被批准进行中间试验。周向军等(2000)把切除了信号肽的Rs-AFP1基因与pET32b(+)融合表达，该蛋白对大丽轮枝菌(Verticillium dahlia kleb.)有抑菌作用。

水稻稻瘟病(Rice blast disease，RBD)是一种世界性的、毁灭性的真菌病害，又名稻热病，其病原菌为稻梨孢菌，通过侵染水稻引起稻瘟病，该病是危害我国水稻产区的最严重的三大水稻病害之一。20世纪90年代以来，我国稻瘟病年发生面积均在380万公顷以上，损失稻谷高达数亿公斤，每年因稻瘟病损失的稻谷大约可以满足6000万人口的粮食需求。由此可见，稻瘟病的流行严重威胁到水稻的高产和稳产。植物基因工程的兴起为病害的控制提供了更广泛的选择余地。利用该技术可向现有栽培品种中导入外源抗病基因而不受种属限制，拓展了可利用基因的来源，这无疑为作物抗病育种工作开辟了一条崭新而有效的途径。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体、构建方法及农杆菌介导获得转基因抗稻瘟病水稻菌株的方法。

本发明的硫堇蛋白类基因Rs-AFP1，它具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

编码具有抗真菌能力的硫堇蛋白类抗菌肽，Rs-AFP1基因编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。

本发明提供含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的以Bar基因为选择标记、以玉米泛素Ubi为启动子的植物双元表达载体；所述植物双元表达载体为pCA1300-Ubi-Rs-AFP1，它是在植物双元表达载体pCA1300-Ubi的Pst I和Sac I酶切位点之间插入由基因Rs-AFP1(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和pMD18T载体构建的重组质粒pMD18T-Rs-AFP1。

所述植物双元表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1的构建方法为：

(1)以水发的小萝卜幼苗为材料，Trizol法提取其总RNA，反转录后获得第一链cDNA；以反转录后获得的第一链cDNA为模板，根据NCBI上检索到的已登录的Rs-AFP1基因的序列设计特异性引物，进行PCR扩增，克隆得到了大小为243bp的Rs-AFP1基因；1％的琼脂糖凝胶检测PCR产物；

所述特异性引物为：

RsAFP1-1：5’-ATGGCTAAGTTTGCGTCC-3’(SEQ ID NO.3)

RsAFP1-2：5’-TTAACAAGGAAAGTAGCAGATAC-3’(SEQ ID NO.4)

(2)回收PCR产物；将回收的片段用T4连接酶连接至pMD18T载体中，构建成克隆载体；然后将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；阳性克隆进行PCR检测后经质粒提取和质粒酶切检测，获得重组质粒pMD18T-Rs-AFP1；

(3)用Pst I和Sac I双酶切重组质粒pMD18T-Rs-AFP1，同时用这两个酶双酶切以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的植物双元表达载体pCA1300-Ubi；酶切产物分别进行电泳后会后，T4连接酶连接，构建成植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1；然后将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；阳性克隆进行PCR检测后经质粒提取和质粒酶切检测得到植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1。

本发明将上述植物双元表达载体转化农杆菌，农杆菌介导转化黄淮区主栽品种“圣稻13”，通过目的基因Rs-AFP1的过量表达，达到获得并提高对稻瘟病菌的抗性的转基因抗稻瘟病水稻菌株。

农杆菌介导获得转基因抗稻瘟病水稻菌株的方法为：

(1)种植水稻诱导与继代培养

取水稻种子消毒后平铺在无菌滤纸上，晾干后置成熟胚于诱导培养基中，在28℃光照培养箱，培养4周；4周后用镊子挑取自然分裂的健康的胚性愈伤组织，置入继代培养基中，在28℃光照培养箱中继代培养1-2周；继代2-3次，获得成熟的愈伤组织；

(2)预培养

选取相对紧凑干燥的愈伤颗粒进行预培养，28℃暗培养4天，备用；

(3)农杆菌培养

愈伤组织预培养2天后，将已转化植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1的农杆菌菌液接于YEP培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD₆₀₀为0.8-1.0，备用；

(4)侵染及共培养

取培养好的菌液制成悬浮液；将长到一定大小的预培养的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液中侵染30min；然后取出沥干后将愈伤组织转移至共培养基上，19-20℃暗培养3d；

(5)愈伤组织的抗性筛选

将愈伤组织取出，经清洗、沥干后，将晾干的愈伤组织进行3次抗性筛选；

(6)抗性愈伤组织的诱导分化和生根

进行三次抗性筛选之后，挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入预分化培养基中，28℃暗培养5-7天，再转移至分化培养基中，放入多功能气候箱中，等待分化成苗；待苗长至1cm，放入生根培养基中壮苗；

(7)转基因苗的锻炼和移栽

将苗根部和茎叶分化得较完好的培养皿挑出，加入无菌水，炼苗3-4天，然后洗净根部培养基，移至栽培缸，于温室中培养。

本发明的有益效果是：本发明以水发的小萝卜幼苗为材料，提取其总RNA，反转录后获得第一链cDNA，以根据NCBI上检索到的已登录的Rs-AFP1基因的序列设计特异性引物，进行PCR扩增，克隆得到了Rs-AFP1基因，将此基因构建入经改造的以Bar基因为选择标记、以玉米泛素Ubi为启动子的双元表达载体中，通过农杆菌介导法将该基因转化水稻并获得相应的转基因植株，对鉴定为阳性的转基因植株提取总蛋白液进行稻瘟病菌体外的抗性鉴定、田间自然发病情况下的抗病性观察以及对转基因植株进行室内苗期稻瘟病菌接种性鉴定，为进一步获得并提高水稻抗稻瘟病的能力，解决我国的粮食、资源和环境等问题具有积极的指导作用；同时还可为培育出具有较好地稻瘟病抗性能力的水稻新品种提供候选基因及理论指导、为进一步创新水稻抗稻瘟病新品种打下基础。

附图说明

图1：RT-PCR获得硫堇蛋白类基因的电泳结果；图中M：2kb Plus DNA Marker；1：RT-PCR产物；

图2：植物中间载体pMD18T-Rs-AFP1示意图；

图3：植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1示意图；

图4：通过PCR分子检测法，对转Rs-AFP1基因水稻的鉴定，其中CK+为阳性对照，CK-为阴性对照，泳道1、4、6、7、10、13为PCR产物，其对应株系为阳性转基因植株；

图5：利用Basta涂抹法，对获得的转基因水稻进行鉴定，其中WT为对照，1代表假阳性转基因植株，2代表阳性转基因植株。

图6：转基因植株在田间自然发病情况下，与野生型植株发病情况的对比观察；其中A为野生型植株在田间发病情况，B为转基因植株在田间发病情况。

图7：对鉴定为阳性的转基因植株提取总蛋白进行对稻瘟病的体外抑菌性鉴定，其中Kan为阳性对照，H₂O和野生型水稻总蛋白提取液均为阴性对照，D、E、F、G、H分别为阳性转化株系1、4、6、7、10的总蛋白提取液体外抑菌性情况。注：A：Kan；B：H₂O；C：野生型水稻总蛋白；D：转Rs-AFP1基因阳性植株1的总蛋白；E：转Rs-AFP1基因阳性植株4的总蛋白；F：转Rs-AFP1基因阳性植株6的总蛋白；G：转Rs-AFP1基因阳性植株7的总蛋白；H：转Rs-AFP1基因阳性植株10的总蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述，以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。

实施例1：萝卜中Rs-AFP1基因的克隆

根据NCBI中已登录的Rs-AFP1基因的核苷酸序列，设计特异性引物。以水发长至3-5cm的小萝卜幼苗为材料，提取其总RNA。

1.Trizol法提取植物总RNA

1)称取50-100mg萌发的小萝卜幼苗放于研钵中，液氮研磨均匀至粉末状，将其转入离心管中，加入1ml Trizol试剂，剧烈振荡15s；

2)4℃，12000rpm离心10min；

3)取上清，室温放置5min，加入0.2ml氯仿用力摇晃试管15s，于30℃水浴锅中放置2-3min；

4)4℃，12000rpm离心15min；

5)取上清，加入0.5ml于-20℃预冷的异丙醇，室温放置10min；

6)4℃，12000rpm离心10min，于管底形成胶状沉淀；

7)弃上清，于沉淀中加入100μl灭菌的DEPC水，及等体积(100μl)的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)进行抽提5min。4℃下12000rpm离心15min；

8)取上清，加入1/10体积的NaAC和2倍体积的无水乙醇，沉淀1h。沉淀后，4℃下12000rpm离心15min；

9)弃上清，用1ml 75％乙醇洗涤沉淀，漩涡振荡，4℃下7500rpm离心5min；

10)弃上清，在超净台上吹干沉淀5-10min(不要吹得太干，否则不好溶解)，加入0.1％DEPC水溶解沉淀，即为RNA，取2ul进行琼脂糖凝胶电泳，其余置于-80℃保存备用。

2.以RNA为模板，反转录获得第一链cDNA

用于RNA反转录的试剂盒为TaKaRa PrimeScript^TM 1^st Strand cDNA Synthesis Kit (Code：D6110A)。

第一链cDNA合成的步骤为：

1)Oligo dT Primer(50uM)1ul、dNTP Mixture 1ul、Total RNA 5ul、RNase free dH₂O 3ul，共10ul的反应体系置于65℃，5min变性；

2)冰上急冷退火；

3)反应体系中加入5×PrimeScript^TM Buffer 4ul、RNase Inhibitor 0.5ul、PrimeScript^TMRNase 1ul、RNase Free dH₂O 4.5ul，使反应总体系为20ul；

4)42℃60min，70℃15min进行反转录，获得第一链cDNA。

3.PCR克隆获得Rs-AFP1基因

以反转录后获得第一链cDNA为模板，根据NCBI上检索到的已登录的Rs-AFP1基因的序列设计特异性引物，进行PCR扩增，克隆得到了大小为243bp的Rs-AFP1基因。

(1)引物序列为：RsAFP1-1：5’-ATGGCTAAGTTTGCGTCC-3’

RsAFP1-2：5’-TTAACAAGGAAAG TAGCAGATAC-3’

(2)PCR反应体系为(25μL)：10×PCR buffer 2.5μL、2.5mmol L^-1dNTPs 1μL、10μmol L^-1上、下游引物各0.5μL、单链cDNA2μL、Ex Taq DNAPolymerase 0.3μL、ddH₂O 18.2μL；

PCR反应程序为94℃解链10min；之后94℃45s，56℃30s，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。1％的琼脂糖凝胶检测PCR产物(如图1)。

4.Rs-AFP1基因的生物信息学分析

克隆的到的Rs-AFP1基因为一完整的开放阅读框，大小为243bp，共编码80个氨基酸，N端的29个氨基酸为信号肽，其余51个氨基酸为成熟肽，信号肽能将成熟的蛋白质分泌并定位于细胞外。根据Rs-AFP1编码的氨基酸序列中半胱氨酸和甘氨酸的排列方式，推测Rs-AFP1具有一个由半胱氨酸起稳定作用的α螺旋构型，这个构型是CXXC、GXC和CXC序列出现的特征(X为任意氨基酸)。

实施例2：植物克隆载体pMD18T-Rs-AFP1构建

1、将实施例1中PCR产物电泳后用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行回收，试剂盒进行回收如下：

(1)将凝胶放在紫外灯下用干净的刀片将条带切下，装入灭菌的离心管中，称取胶的重量，每个管中胶的重量不能超过300mg；

(2)按100mg胶加700μl溶胶液的比例，室温溶胶(或55℃溶胶)，其间偶尔摇动；装柱，9000rpm，离心30s；去掉废液；

(3)500μl漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm离心30s。重复漂洗一次。倒掉废液以后，再于12000rpm离心2min；

(4)将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加入合适体积的洗脱缓冲液(Eloution buffer，通常用30μl-50μl)，室温放置2-5min，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

2、将回收的片段用T4连接酶连接至pMD18T载体中，构建成克隆载体pMD18T-Rs-AFP1(如图2)。

连接体系如下：

a、回收的DNA片段7μl

b、pMD18T载体1μl

c、T4DNA连接酶1μl

d、T4DNA连接酶buffer  1μl

将上述a、b、c、d反应物混匀，16℃反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5α。

3、大肠杆菌感受态细胞的制备

(1)挑取E.coil DH5α单菌落接种到5ml的LB液体培养基，于37℃，250rpm震荡培养过夜。

(2)次日将此菌液以1％的接种量转移至100ml的LB液体培养基中，继续培养至吸光度(OD)₆₀₀＝0.4。

(3)将此菌液冰浴10min，在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(4)重悬于10ml预冷的0.1mol/L的CaCl₂中，冰浴10min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(5)重悬于2ml(含15％甘油)的预冷的0.1mol/L的CaCl₂中，分装成100μl/管，-70℃保存备用。

4、转化

(1)从-70℃冰箱取出感受态细胞置于冰上溶解。

(2)将Rs-AFP1与载体pMD18T的连接产物5μl加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。

(3)42℃热激90s，在此过程中不要晃动离心管。

(4)热激完毕后立即取出放于冰上2min。

(5)加入800μl的LB液体培养基，37℃，200rpm孵育1h。

(6)将菌液涂布在氨苄(Amp)抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。

(7)将平板放入4℃保存。

5、阳性克隆的菌液PCR检测

(1)从转化的平板上挑取白色菌落接种到LB液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养3-4h。

(2)PCR反应体系：Taq酶缓冲液(含有Mg²⁺)2.5μl，dNTP(2.5mM)1μl，RsAFP1-1(F)引物、RsAFP1-2(R)引物(10μM)各1μl，菌液2μl，Taq酶(博大泰克公司产)0.3μl，加灭菌双蒸水至25μl。

(3)PCR反应程序：98℃10min，94℃45s，55℃45s，72℃45s，30循环，72℃10min，4℃保存。取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一250bp左右的条带。

6、质粒的提取

(1)将菌液PCR阳性的菌液于37℃，250rpm震荡培养过夜。

(2)将菌液转移到离心管中，室温8000rpm离心2min，收集菌体。

(3)倒取上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出。

(4)加入100μl预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶液I配方为：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)。

(5)加入200μl新鲜配制的溶液II，快速颠倒混匀10次，冰浴5min，其中所述溶液II配方为：0.2mol/LNaOH、1％SDS。

(6)加入150μl预冷的溶液III，温和地颠倒10次，冰浴5min，4℃12000rpm离心10min，其中所述溶液III配方为：5mol/L乙酸钾60ml、3mol/L冰乙酸11.5ml、H₂O 28.5ml、pH 5.2。

(7)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)，反复混匀，4℃12000rpm离心10min。

(8)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，反复混匀，4℃12000rpm离心10min。

(9)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇，混匀后-20℃沉淀1h，4℃12000rpm离心10min。

(10)倒掉上清，加入500μl 70％的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥。

(11)加入30ul的RTE溶液(由RNaseA和ddH₂O以1∶50比例配制而成)，37℃消化0.5h。

7、质粒的酶切检测

(1)Pst I和Sac I对质粒进行双酶切体系(20μl)：

(2)37℃酶切2h，取10μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一条大小为250bp左右的条带。

8、序列测定

以上步骤中获得的阳性克隆pMD18T-Rs-AFP1由山东省农科院高新技术研究中心测序。实施例3：植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1构建

1、用Pst I和Sac I双酶切鉴定好的重组质粒pMD18T-Rs-AFP1，同时用这两个酶双酶切以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的植物双元表达载体pCA1300-Ubi。37℃酶切2h，酶切体系同实施例2中的7。

2、酶切产物分别进行电泳，电泳后用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行回收，回收步骤同实施例2中的1。

3、将两个回收片段用T4连接酶连接，构建成植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1(如图3)，连接体系同实施例2中的2。

5、大肠杆菌感受态细胞的制备，步骤同实施例2中的3。

6、转化大肠杆菌DH5α，步骤同实施例2中的4。

7、阳性克隆的菌液PCR检测，步骤同实施例2中的5。

8、质粒的提取，步骤同实施例2中的6。

9、质粒的酶切检测

用Pst I和Sac I对质粒进行双酶切鉴定，体系及步骤同实施例2中的7。

实施例4：植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1转化农杆菌

1、农杆菌感受态细胞的制备

(1)挑取单菌落(EHA105)接种到3ml的YEB液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.5。

(2)吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min。

(3)5000rpm离心30S，弃去上清液。

(4)沉淀用1.5ml 0.5M NaCl悬浮，冰浴20min。

(5)5000rpm离心30S，弃去上清液。

(6)每管用100μl 20mM CaCl₂悬浮，用于转化，-70℃保存备用。

2、DNA直接转化农杆菌

(1)50μl农杆菌感受态细胞中分别加入植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1的质粒DNA0.1-1μg(5-10μl)，之后冰浴30min。

(2)放入液氮中5min(或1min)然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min。

(3)取出离心管，加入0.5ml的YEB，于28℃，220rpm震荡培养3至5小时。

(4)取出菌液于含有卡那和利福平的YEB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养，2-3天菌落可见。

3、重组农杆菌鉴定

(1)挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。

(2)菌液PCR鉴定步骤同实施例2中的5。

实施例5：农杆菌介导转化黄淮区主栽品种“圣稻13”

(1)种植水稻、诱导与继代培养

取水稻成熟种子，人工脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入75％乙醇消毒3-4mins；倒去乙醇，用无菌水冲洗2次，之后加入100ml 30％次氯酸钠溶液，浸泡30mins；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡20min。种子平铺在无菌滤纸上，晾干后置成熟胚于诱导培养基(培养基成分见表1)中，每皿12-14颗，平均分布；操作完毕用封口膜封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养4周；在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的健康的胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)，置入继代培养基(培养基成分见表2)中，在28℃光照培养箱中继代培养1-2周。继代2-3次，获得成熟的愈伤组织。

(2)预培养

选取相对紧凑干燥的愈伤颗粒进行预培养，28℃暗培养4天，备用。

(3)农杆菌培养

愈伤组织预培养2天后，将已转化成功的农杆菌(LBA4404)菌液100μl接于4ml YEP(含50mg/l Rif(利福平)和50mg/l Str(链霉素))培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD₆₀₀为0.8-1.0，备用。

(4)侵染及共培养

取培养好的菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心1min，去上清。用含200μmol/L As(乙酰丁香酮)的30ml AAM感菌液(成分见表7)制成悬浮液。将长到直径约为3-5mm大小的预培养的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液中侵染30mins，愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可。将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40mins，随后将愈伤组织转移至共培养基(培养基成分见表3)上，19-20℃暗培养3d。

(5)愈伤组织的抗性筛选

将愈伤组织取出，在50ml的三角瓶中用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡，以保证除净愈伤组织表面残留的农杆菌菌液，再用含400ppm Cn(羧苄青霉素)的无菌水浸泡1h，最后置于无菌滤纸上沥干2h。将晾干的愈伤转入含10mg/mL Basta(除草剂)和400ppm Cn的选择培养基(培养基成分见表4)上进行第一轮筛选，28℃，光照培养箱中培养2-3周；将长有抗性愈伤的初始愈伤再进行第二、三次抗性筛选，逐级递减抗筛培养基中Cn的浓度(即由400ppm到300ppm再到200ppm)，Basta的浓度不变。

(6)抗性愈伤组织的诱导分化和生根

进行三次抗性筛选之后，挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入预分化培养基(培养基成分见表5(与分化培养基成分一致))中，28℃暗培养5-7天，再转移至分化培养基(培养基成分见表5)中，放入多功能气候箱中，等待分化成苗。待苗长至1cm，放入生根培养基(培养基成分见表6)中壮苗。

(7)转基因苗的锻炼和移栽

转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月。将苗根部和茎叶分化得较完好的培养皿挑出，加入适量无菌水，炼苗3-4天，然后洗净根部培养基，移至栽培缸，于温室中培养。

表1水稻成熟胚愈伤组织诱导培养基(每升含量)

表2水稻成熟胚愈伤组织继代培养基(每升含量)

表3水稻共培养培养基(每升含量)

表4选择培养基(每升含量)

表5水稻分化培养基配方(每升含量)

表6水稻生根培养基配方(每升含量)

表7悬浮农杆菌感染愈伤组织团的培养基配方(AAM感菌液)每升含量

实施例6：转基因水稻植株的鉴定

1、植物DNA的简易提取

1)取2cm长植物叶片放入1.5ml EP管中，加入200μl TPS(100mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA(pH 8.0)、1M KCl)抽提液，用1ml枪头将叶片捣碎。

2)75℃，20min水浴。

3)12000rpm，10min。

4)取120μl上清，于0.5ml EP管，加入等体积异丙醇，冰上15min，12000rpm离心10min。

5)弃上清，取沉淀，加120μl 70％乙醇，12000rpm，5min。

6)弃上清，沉淀干燥，加入20μl水。

2、以上述简易法提取的植物DNA为模板，以实施例1中的3中的RT-PCR引物RsAFP1-1和RsAFP1-2进行PCR，扩增出大小约为250bp特异条带的为转基因株系(如图4所示)。

3、因植物表达载体中以bar基因为选择标记基因，故对转基因株系的叶片进行Basta涂抹鉴定，根据涂抹处的叶片是否黄枯来确定阳性转基因株系(如图5所示)。PCR分子鉴定的结果与Basta涂抹鉴定的结果是相一致的。

实施例7：阳性转基因水稻的抗病性鉴定

1、田间自然发病情况下的感病情况观察

转基因植株移栽至大田后，在田间自然发病情况下，观察转化植株与野生型植株的发病情况。我们发现，实验田中野生型的水稻大量感染了稻瘟病而表现出叶瘟症状，而相同生长条件下的阳性转化株系均未感病，生长状态良好(如图6所示)。

2、转基因株系总蛋白提取液对稻瘟病的体外抑菌性鉴定

(1)转化植物总蛋白的提取

1)分别取0.2-0.4g转基因及野生型植物材料，用液氮冻存；

2)加入50mmol/L的Tris-HCl以及2ml buffer(内含2mmol/L的DTT，1mmol/L的PMSF和1％的PVPP，PH为7.2)；

3)冰浴，充分研磨成匀浆；

4)4℃，15000r/min，离心30min；

5)吸取上清即为蛋白液。

将提取的蛋白液分别取适量于蛋白分析仪上测其浓度。

(2)稻瘟病菌的培养

供试稻瘟病菌在PDA培养基上于30℃培养箱中培养一周后，在超净工作台上用无菌水洗去培养基上的菌丝及孢子，加入到25ml的液体PDA培养基中，在30℃振荡培养箱中培养2天，待菌液中出现绿色孢子即可。

(3)体外抑菌性鉴定

在超净工作台中，把培养好的稻瘟病菌菌液用涂布棒均匀涂抹在固体PDA培养基上，同时用灭过菌的圆形滤纸片沾取足量的上步提取的植物蛋白提取液点在涂抹病菌菌液的培养基上，封口膜封口后置于30℃培养箱中培养。期间不断观察培养基中滤纸片周围抑菌情况并拍照记录。结果表明，Kan作为阳性对照对稻瘟病菌具有较强的抑制作用，CK和H₂O作为阴性对照对稻瘟病菌基本无抑制作用，5个阳性转化株系的植物蛋白提取液对稻瘟病菌具有一定程度上的抑制作用(如图7所示)。

3、转基因植株室内稻瘟病菌抗种性鉴定

选用的稻瘟病抗性鉴定的供试菌株为江苏省稻瘟病菌代表菌株：ZB₁₇、ZC₇、ZD₇、ZE₃、ZF₁、ZG₁。将供试菌株移植至PDA培养基上，30℃培养箱中培养，待稻瘟病菌产生孢子后，在超净工作台中用无菌水将孢子洗下，配成10×10倍显微镜下每视野40-50个孢子浓度的悬浮液，每小种等比例混合后供接种备用。

稻瘟病抗性鉴定采用苗期喷雾法接种，将各阳性转化植株的T₀代以及野生型“圣稻13”种子用抗菌素402浸泡3天后，用清水冲洗催芽1-2天，播于一次性实验杯，每品种(系)播15-20粒，两次重复。在水稻秧苗3叶1心期时，用预先配制好的孢子悬浮液喷雾接种，在遮荫棚内保湿7天后，按国际统一标准，检查发病情况，分级记载。

稻瘟病分级标准：

0级    没有症状        (免疫)

1级    很小的褐色小点  (高抗)

2级    直径为1毫米的褐色病斑                            (抗病)

3级    直径为2-3毫米的带椭圆形的病斑，中央灰色，边缘褐色(中抗)

4级    长1-2厘米的椭圆形病斑，中央灰色，边缘褐色        (感病)

5级    形成长而宽的大椭圆形病斑，病斑发展到后期或条件不适宜时时，边缘褐色(高感)。

观察结果表明，对照组野生型“圣稻13”及转Rs-AFP1基因的第10株系表现为稻瘟病菌的高感性状，病斑数量多且大，其余转基因株系均表现对稻瘟病菌具有的一定的免疫及抗病性(如表8所示)。

表8对鉴定为阳性的转基因植株进行室内苗期稻瘟病菌接种性鉴定结果

品种名称	感病级别	品种名称	感病级别
				Shengdao 13	5	RS-afP1-6	0
RS-afP1-1	0	RS-afP1-7	0
				RS-afP1-4	0	RS-afP1-10	5

Claims (4)

1.硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体，其特征是，它为pCA1300-Ubi-Rs-AFP1，它是在植物双元表达载体pCA1300-Ubi的PstI和SacI酶切位点之间插入由基因Rs-AFP1和pMD18T载体构建的重组质粒pMD18T-Rs-AFP1。

2.权利要求1所述的硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体的构建方法，其特征是，

(1)以水发的小萝卜幼苗为材料，Trizol法提取其总RNA，反转录后获得第一链cDNA；以反转录后获得的第一链cDNA为模板，根据特异性引物进行PCR扩增，克隆得到了大小为243bp的Rs-AFP1基因；1％的琼脂糖凝胶检测PCR产物；

所述特异性引物为：

RsAFP 1-1：5’-ATGGCTAAGTTTGCGTCC-3’

RsAFP 1-2：5’-TTAACAAGGAAAGTAGCAGATAC-3’

(2)回收PCR产物；将回收的片段用T4连接酶连接至pMD18T载体中，构建成克隆载体；然后将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；阳性克隆进行PCR检测后经质粒提取和质粒酶切检测，获得重组质粒pMD18T-Rs-AFP1；

(3)用Pst I和Sac I双酶切重组质粒pMD18T-Rs-AFP1，同时用这两个酶双酶切以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的植物双元表达载体pCA1300-Ubi；酶切产物分别进行电泳后会后，T4连接酶连接，构建成植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1；然后将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α；阳性克隆进行PCR检测后经质粒提取和质粒酶切检测得到植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1。

3.权利要求1所述的硫堇蛋白类基因Rs-AFP1植物双元表达载体在制备转基因抗稻瘟病水稻菌株方面的应用。

4.农杆菌介导获得转基因抗稻瘟病水稻菌株的方法，其特征是，

(1)种植水稻诱导与继代培养

取水稻种子消毒后平铺在无菌滤纸上，晾干后置成熟胚于诱导培养基中，在28℃光照培养箱，培养4周；4周后用镊子挑取自然分裂的健康的胚性愈伤组织，置入继代培养基中，在28℃光照培养箱中继代培养1-2周；继代2-3次，获得成熟的愈伤组织；

(2)预培养

选取相对紧凑干燥的愈伤颗粒进行预培养，28℃暗培养4天，备用；

(3)农杆菌培养

愈伤组织预培养2天后，将已转化植物表达载体pCA1300-Ubi-Rs-AFP1的农杆菌菌液接于YEP培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD₆₀₀为0.8-1.0，备用；

(4)侵染及共培养

取培养好的菌液制成悬浮液；将长到一定大小的预培养的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液中侵染30min；然后取出沥干后将愈伤组织转移至共培养基上，19-20℃暗培养3d；

(5)愈伤组织的抗性筛选

将愈伤组织取出，经清洗、沥干后，将晾干的愈伤组织进行3次抗性筛选；

(6)抗性愈伤组织的诱导分化和生根

进行三次抗性筛选之后，挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入预分化培养基中，28℃暗培养5-7天，再转移至分化培养基中，放入多功能气候箱中，等待分化成苗；待苗长至1cm，放入生根培养基中壮苗；

(7)转基因苗的锻炼和移栽

将苗根部和茎叶分化得较完好的培养皿挑出，加入无菌水，炼苗3-4天，然后洗净根部培养基，移至栽培缸，于温室中培养。

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