CN102260671A

CN102260671A - 五色荧光矩阵标准物及其制备方法与专用引物组合物

Info

Publication number: CN102260671A
Application number: CN 201110201443
Authority: CN
Inventors: 叶健; 赵兴春
Original assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date: 2011-07-18
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2031-07-18
Also published as: CN102260671B

Abstract

本发明公开了一种五色荧光矩阵标准物及其制备方法与专用引物组合物。本发明提供的引物组合物由不同颜色荧光染料标记过的如下5对引物组成：由序列表中序列6所示的DNA和序列表中序列7所示的DNA组成的引物对1，由序列表中序列8所示的DNA和序列表中序列9所示的DNA组成的引物对2，由序列表中序列10所示的DNA和序列表中序列11所示的DNA组成的引物对3，由序列表中序列12所示的DNA和序列表中序列13所示的DNA组成的引物对4，由序列表中序列14所示的DNA和序列表中序列15所示的DNA组成的引物对5。上述5对引物制备得到的五色荧光标准物与传统的四色荧光矩阵标准物质相比，能够在一个反应体系内同时获得含有五种荧光产物的荧光标准物。

Description

五色荧光矩阵标准物及其制备方法与专用引物组合物

技术领域

本发明属于法医遗传学及生物技术领域，涉及一种五色荧光矩阵标准物质及其制备方法。

背景技术

近年来，随着毛细管电泳技术、荧光复合扩增技术及多荧光检测技术的应用，基因分型技术发展迅速，特别是在法医学DNA检验领域得到了广泛的应用。目前，基因分型技术主要是通过毛细管电泳设备及荧光检测设备分析不同荧光标记的待测DNA片段的分子量，从而实现分型的目的。多种荧光分子标记技术使得DNA检测的效率得到极大的提高，甚至可实现相同分子量DNA片段的区分。然而，利用这类仪器分析分子量时需要一个荧光矩阵标准物质来进行不同荧光的划分，也就是荧光矩阵标准物质(Matrix Standard)。

目前，在国内DNA检测实验室最常见的检测设备主要是ABI

310、3100、3100-Avant、3130和3130xl型遗传分析仪，内置不同的检测模式，不同的检测模式对应不同的荧光染料组合。常用的荧光染料及其组合有：四色组合5-FAM、JOE、NED、ROX(AB公司)，FL、JOE、TAMRA、CXR(Promega公司)；五色组合6-FAM、VIC、NED、PET、LIZ(AB公司)。各组合不同颜色会互相重叠干扰。通过制备荧光标志物，在遗传分析仪上生成正确的Matrix文件给予荧光信号收集和分析时的荧光识别，随之检测信号经过软件处理，计算互相重叠的不同颜色的光谱，并且各颜色通道之间互不干扰，对评估多色荧光系统是非常关键的。不同的荧光标记就必须建立不同的荧光标准物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种扩增五色荧光矩阵标准物质的引物组合物。

本发明提供的引物组合物由不同颜色荧光染料标记过的如下5对引物组成：由序列表中序列6所示的DNA和序列表中序列7所示的DNA组成的引物对1，由序列表中序列8所示的DNA和序列表中序列9所示的DNA组成的引物对2，由序列表中序列10所示的DNA和序列表中序列11所示的DNA组成的引物对3，由序列表中序列12所示的DNA和序列表中序列13所示的DNA组成的引物对4，由序列表中序列14所示的DNA和序列表中序列15所示的DNA组成的引物对5。

所述引物组合物中，每对引物对中的两条引物之间的摩尔比为1∶1；

所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5的摩尔比为如下1)或2)：

1)(0.3-0.5)∶(0.1-0.3)∶(0.5-0.7)∶(0.2-0.4)∶(0.2-0.4)；优选摩尔比为0.4∶0.2∶0.6∶0.3∶0.3；

2)0.4∶0.2∶0.6∶0.3∶0.3。

上述不同颜色荧光染料在每对引物的5’端进行标记；不同颜色荧光染料优选为红色、橙色、黄色、绿色或蓝色荧光染料，更优选是FAM、HEX、TAMAR、TET或ROX。

所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5整体包装或均单独包装。

本发明的另一目的在于提供一种制备五色荧光矩阵标准物质的方法。

所述方法包括如下步骤：

用任一上述的引物组合物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5在PCR体系中一次扩增出序列表中序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示的5个DNA片段，得到五色荧光矩阵标准物质。

上述PCR体系中的模板是9947A DNA。

上述PCR体系中扩增条件是：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后60℃延伸60min。

上述的方法制备得到的五色荧光矩阵标准物质属于本发明的保护范围之内。

上述的荧光矩阵标准物质在毛细管电泳的荧光校准中的应用也属于本发明的保护范围之内。

与传统的四色荧光矩阵标准物质相比，本发明提供的荧光矩阵标准物质制备方法能够在一个反应体系内同时获得含有五种荧光产物的荧光标准物，无需进行单色荧光标准物质的混合和调配即可直接应用于荧光校正。该方法极大的简化了荧光标准物的制备工艺流程，避免了复杂繁琐的操作。

附图说明

图1为实施例1引物对1扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。

图2为实施例1引物对2扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。

图3为实施例1引物对3扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。

图4为实施例1引物对4扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。

图5为实施例4引物对5扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。

图6为实施例4五色荧光标准物的毛细管电泳检测结果。

图7为实施例5中四色荧光矩阵标准物的上机结果。

图8为实施例5中五色荧光矩阵标准物的上机结果。

图9为四色荧光矩阵标准物STR检测结果(红色内标，ROX标记)。

图10为五色荧光矩阵标准品进行荧光校准后形成的DNA样本的STR分型图谱(橙色内标，TET标记)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明中荧光矩阵标准物与荧光标准物、荧光标准品的含义等同。

实施例1、单引物扩增荧光矩阵标准品

1、引物的设计与合成

设计如下的4对引物，并在引物的5’端分别标记不同的荧光分子。

引物对1(D21S11)HEX标记：

上游：CCCCAAGtgaattgccttct(序列6)

下游：AGTCAATGTTCTCCAGAGACagac(序列7)

引物对2(D5S818)ROX：

上游：5′-GGGTGATTTTCCTCTTTGGT-3′(序列8)

下游：5′-TGATTCCAATCATAGCCACA-3′(序列9)

引物对3(D8S1179)FAM：

上游：TTGC AACTT ATATG TATTT TTGTA TTTCA TG(序列10)

下游：ACCAAATTGT GTTCATGAGTATAGT TTC(序列11)

引物对4(D13S317)TMR：

上游：5′-CAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA-3′(序列12)

下游：5′-GGCAGCCCAAAAAGACAGA-3′(序列13)

2、PCR反应体系的建立

PCR反应体系和反应条件如下：

PCR反应体系如下：

以9947A DNA(美国PROMEGA公司，货号：DD1001)为模板，分别以上面步骤1中的4对DNA序列为引物进行扩增，得到4种扩增产物。将这4种单引物扩增产物分别进行毛细管电泳检测，结果分别如图1-图4所示，表明引物特异性好，荧光标记正确。

实施例2、四色荧光标准物复合扩增体系的建立

将实施例1中的4个引物对在一个PCR体系中扩增，复合扩增反应体系如下：

本实施例中的4个引物(引物对1、引物对2、引物对3和引物对4)在PCR体系中的终浓度分别为0.1uM，0.2uM，0.6uM，0.3uM，模板为实施例1中的模板。

PCR热循环参数：

扩增后产物进行毛细管电泳荧光检测并经测序，结果表明复合扩增出4个DNA片段，核苷酸序列分别如序列表中序列1-4所示。

实施例3、PCR产物的纯化与保存

复合扩增PCR体系除了含有我们所需的PCR产物外，还混有盐离子、酶等杂质。这些杂质在体系中会影响后续的Matrix文件生成及荧光校正通过率。因此采用Qiagen公司的QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化，得到四色荧光标准物。

主要操作方法如下：

1、将50μL复合扩增产物转移至一新离心管中。

2、加入5倍体积的PB缓冲液加入上述离心管中，并震荡混合。

3、如果PH指示剂I已被加入到PB缓冲液中，混合物的颜色应为黄色。

4、将QIAquick离心柱安装在2ml管中。

5、进行DNA结合，将上述样本加入QIAquick离心柱，离心13000rpm/min 30-60秒。

6、弃去收集管，将QIAquick离心柱转移至新2ml收集管中。

7、DNA洗涤，在QIAquick离心柱中加入750μL PE缓冲液，13000rpm/min离心30-60秒。

8、弃去收集管中液体，将QIAquick离心柱重新置于收集管中，离心1min。

9、弃去收集管，将QIAquick离心柱置于一新1.5ml离心管中。

10、DNA洗脱，在QIAquick离心柱中心加入50μL EB洗脱液，静置1min，13000rpm/min离心30-60秒。

11、-20℃储存备用。

实施例4、五色荧光标准物的制备

一、五色荧光标准物引物的制备

以细胞株(9947a)(美国PROMEGA公司，货号：DD1001)基因组DNA作为模板，以引物对5(5’端进行TET标记)进行PCR扩增

引物对5：

上游：5’-CCCTG GGCTC TGTAAAGAA(序列14)

下游：5’ATCAGAGCTTAAACT GGGAA GCTG(序列15)

将产物进行毛细管电泳检测，结果如图5所示，表明引物特异性好，荧光标记正确。将产物进行测序，结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

二、五色荧光标准物复合扩增体系的建立

将实施例1中的4个引物对(引物对1-4)以及本实施例的引物对5在一个PCR体系中扩增，复合扩增反应体系如下：

本实施例中的5个引物对(引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5)的每条引物往PCR体系中加入量分别为2μL、1μL、3μL、1.5μL、1.5μL。5个引物对(引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5)在PCR体系中的终浓度分别为0.4uM，0.2uM，0.6uM，0.3uM，0.3uM；模板为实施例1中的模板。

PCR热循环参数：

上述复合扩增形成产物经纯化，即得五色荧光标准物。将五色荧光标准物进行3130xl毛细管电泳检测，结果显示：荧光标准物峰型尖锐，荧光片段完整，无人工产物峰存在。

实施例5、Matrix文件的制作

1、将实施例3、4制备的纯化后的四色荧光标准物、五色荧光标准物准备好

2、将180μLHi-Di甲酰胺和40μL荧光矩阵标准物质混匀。

3、95℃变性5min，冰浴3min。

4、在96孔板的两排(A1-H2)16个孔中各分装10μL

仪器操作(以ABI公司3130xl为例)

(1)启动3130xl Data Collection

(2)新建protocol。点击“NEW”，命名Name(如DNATyper_G5_matrix)

(3)编辑样品表。打开plate Manager，点击NEW，命名Name；

Application：spectral calibration；

Plate Type：96-well

点击：”OK”，出现样品编辑表。Sample name栏根据加样孔编辑样品名，Instrument protocol 1选择步骤2中编辑好的protocol。

(4)电泳。点击Run scheduler，点击plate view，点击find all，找到步骤3中已命名编辑好的样品表，点击放置样品的A或者B盘联接激活按钮点击

开始电泳。

荧光标准品上机结果如图7和图8所示，结果表明该方法制备的四色荧光标准与五色荧光标准物平衡性好，荧光强度适宜，完全满足荧光矫正的需要。

实施例6、STR分型

在实施例5建立Matrix文件后，应用上述荧光矩阵标准物所得到的文件进行DNA样本的检测。所得到的STR分型结果分别如图9和10所示，结果表明：荧光矩阵标准物的五种不同荧光峰的RFU值应＞1000，一般将RFU值控制在1500为宜，五种荧光峰的RFU值应尽量保持均衡，并在50％范围内波动(如上图最高峰为蓝峰，其RFU值为3200左右，那么最低峰橙色峰的RFU值就不能低于1600)，本发明制备的四色荧光矩阵标准物与五色荧光矩阵标准物均符合上述标准。

Claims

1.扩增五色荧光矩阵标准物质的引物组合物，其特征在于：它由不同颜色荧光染料标记过的如下5对引物组成：由序列表中序列6所示的DNA和序列表中序列7所示的DNA组成的引物对1，由序列表中序列8所示的DNA和序列表中序列9所示的DNA组成的引物对2，由序列表中序列10所示的DNA和序列表中序列11所示的DNA组成的引物对3，由序列表中序列12所示的DNA和序列表中序列13所示的DNA组成的引物对4，由序列表中序列14所示的DNA和序列表中序列15所示的DNA组成的引物对5。

2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物中，每对引物对中的两条引物之间的摩尔比为1∶1；

2)0.4∶0.2∶0.6∶0.3∶0.3。

3.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于：不同颜色荧光染料在每对引物的5’端进行标记；不同颜色荧光染料优选为红色、橙色、黄色、绿色或蓝色荧光染料，更优选是FAM、HEX、TAMAR、TET或ROX。

4.如权利要求1-3中任一所述的引物组合物，其特征在于：所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5整体包装或均单独包装。

5.一种制备五色荧光矩阵标准物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

用权利要求1-4中任一所述的引物组合物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5在PCR体系中一次扩增出序列表中序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示的5个DNA片段，得到五色荧光矩阵标准物质。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR体系中的模板是9947A DNA。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述PCR体系中扩增条件是：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后60℃延伸60min。

8.权利要求5-7中任一所述的方法制备得到的五色荧光矩阵标准物质。

9.权利要求8所述的荧光矩阵标准物质在毛细管电泳的荧光校准中的应用。