CN102250993A - 一种利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，该方法通过优化培养基组分，添加无机盐及小分子活性物质氨基酸，对链霉菌的代谢网络进行扰动，强化目标产物生成途径，促进了产物的生成。同时对发酵工艺进行改造，采用补料培养的方法，对培养工艺进行优化。本发明提供的安来霉素发酵优化方法，主要通过优化培养基组分，并通过补料工艺的优化，大幅提高了安来霉素发酵效价，提高了设备和原料的利用率。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，属于农业生物技术、工业生物技术、发酵工程领域。
技术背景
饲用抗生素能促进畜禽生长、预防疾病发生，极大地提高了畜牧业经济效益，许多国家的畜禽业都长期应用抗生素添加剂。然而，长期、广泛、不加选择地使用抗生素饲料给细菌性疾病的控制和治疗带来了极大的麻烦和困难。细菌耐药性和药物残留等问题日益突出，也给人类的健康带来潜在的威胁。目前这些情况已经引起世界各国政府及业内人士的高度重视。2006年，欧盟全面禁止了抗生素饲料添加剂的应用。我国是畜禽生产大国，但由于药物残留超标等问题，出口量仅占生产量的0.9％～1.2％。在全球经济一体化的时代，要提高我国畜禽产品的国际竞争力，抗生素安全问题及对策研究已经迫在眉睫。只有对抗生素进行全面的认识及合理的应用，才能充分发挥其有利作用并避免对人类健康造成危害。当务之急便是针对微生物的耐药性，研究并开发广谱、高效、安全的新型饲料添加剂，这不仅能带来显著的经济效益，还具有极其重要的社会意义。
安来霉素就是一种广谱、高效、安全的新型抗生素饲料添加剂，对主要的革兰氏阳性菌均具有强大杀菌作用；在需氧和厌氧条件下在肠道内不被降解，保持原有的抗菌活性；最重要的是安来霉素与临床上其他抗生素之间无交叉耐药性，且细菌的耐药性产生非常缓慢，且耐药性不稳定、易丢失；口服不被肠道吸收，不会产生药物残留问题。
安来霉素作为一种动物专用抗生素，既可以满足人们对农产品安全性的要求，又可显著降低农场品加工过程中的生产成。因此，专家预测，安来霉素还会在一段相当长的时间内充当促生长剂的主角。
纵观国内外发展，国内目前尚无发酵法生产安来霉素的报导，虽然，日本武田公司实现了安来霉素的工业化生产，但报导的最高产量仅为4530mg/L。因此，研究和开发安来霉素的高效生产技术成为当前打破国外企业对安来霉素市场垄断的关键。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供一种利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺。
本发明提供一种利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，主要通过培养基优化及补料工艺的优化，提高安来霉素发酵效价，提高发酵设备及原料的利用率；其步骤如下：(1)将链霉菌接种到到发酵培养基中，发酵培养基中各组分浓度为：葡萄糖20g/L～50g/L、淀粉5g/L～20g/L、玉米浆10g/L～30g/L、酵母膏1g/L～5g/L、黄豆饼粉5g/L～20g/L、氯化钠5g/L～10g/L、碳酸钙15～20g/L、氯化铵5～10g/L、磷酸二氢钾2～5g/L、硫酸铵3g/L～5g/L、无机盐离子0.4g/L～0.8g/L、氨基酸0.2mg/L-0.6mg/L；(2)采用补料培养的方法进行培养，发酵进行到70～78小时，向发酵体系流加葡萄糖溶液，使发酵液中碳源浓度保持在60g/L～100g/L，控制发酵液pH值，发酵周期为6-9天。
优选所述的无机盐为MgSO4，CuSO4或FeSO4；所述的氨基酸为半胱氨酸、精氨酸或丝氨酸。
优选所述流加的葡萄糖溶液的浓度为50g/L～150g/L。优选流加葡萄糖溶液时，用碳酸钙或氢氧化钠调节pH；使发酵液的pH保持在6.5～7.5；
上述链霉菌Streptomyces sp.，参据的微生物(株)：NJWGY3665是由本实验室从南京工业大学江浦校区的土壤中，初筛得到47株能抑制枯草芽孢杆菌生长的放线菌；经摇瓶复筛，用HPLC(高效液相色谱)检测获得一株安来霉素产生菌，通过生理生化特性实验和16S rDNA序列相似性分析，分类鉴定命名为链霉菌，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.2410，保藏日期是：2008年3月21日。以此菌种作为生产菌株。
CGMCC No.2410菌株具有下述性质：
1、形态特征：
菌株在高氏一号培养基上生长中度，气生菌丝生长中度，孢子丝呈波曲状，孢子成链状排列，在电子显微镜下孢子成椭圆形。
2、培养特征：
28℃培养7-14天，观察菌株在下列各种培养基上的特征。
表1CGMCC No.2410菌株的培养特征
3、生理生化性质：
表2CGMCC No.2410与 S.fungicidicus NO.B5477菌株的生理生化性质比较
+++：富集生长；++：适度生长；+：生长；-：不生长
4、16S rDNA序列分析
用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用链霉菌通用引物进行16Sr DNA扩增，PCR产物经检测、纯化后交由TAKARA公司进行测序。所测的16S rDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较得知，菌株Streptomyces sp.NJWGY3665(CGMCC No.2410)属于链霉菌属。
测得16S rDNA大部分序列1650bp，具体如下：
5’-ATTGAGTTTATCCTGGCTCAGGGTTTCTTCGGTACGCTGAGTCGAAACACCCACTTCGACGATATAGTTGCGGCTGGATCACCTCCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGTGCGGCTAGATCACCTCCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCCGCCTGGGCATCCAGGCGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGGTGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATCGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGAGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCACAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGAAACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTAAT-3’
有益效果：
本发明提供的安来霉素发酵优化工艺，主要通过优化培养基组分，及发酵工艺进行优化，采用补料培养的方法，大幅提高了安来霉素的发酵效价，超过了目前文献报道的最高水平，同时较本实验室公开的“发酵法生产多肽类抗生素安来霉素的方法”(授权号：CN 101245362 B)中最高效价6630mg/L，也有了显著的提高。采用本发明能充分利用了发酵设备及发酵原料，降低了成本，且本发明提供的方法过程简单，具有良好的推广性，能带来巨大的经济及社会效益。
保藏信息
上述链霉菌Streptomyces sp.，参据的微生物(株)：NJWGY3665是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.2410，保藏日期是：2008年3月21日。
具体实施方法
下面对本发明的实施案例作详细说明，本实施案例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
实施例1
所使用的微生物为链霉菌为Streptomyces sp.NJWGY3665。将链霉菌接种到到发酵培养基中，发酵培养基中各组分浓度为：葡萄糖35g/L、淀粉20g/L、玉米浆15g/L、酵母膏1g/L、黄豆饼粉15g/L、氯化钠5g/L、碳酸钙15g/L、氯化铵5g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸铵3g/L、MgSO4 0.5g/L、半胱氨酸0.2mg/L；采用补料培养的方法进行培养，发酵进行到70小时，向发酵体系流加浓度为60g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中碳源浓度保持在60g/L，流加葡萄糖溶液时，利用碳酸钙调节pH，使发酵液的pH保持在6.5，发酵周期为8天。检测安来霉素效价为10621mg/L。较本实验室公开的“发酵法生产多肽类抗生素安来霉素的方法”(授权号：CN 101245362 B)中最高效价6630mg/L，采用本发明的安来霉素发酵效价提高了1.60倍。
实施例2
所使用的微生物为链霉菌为Streptomyces sp.NJWGY3665。将链霉菌接种到到发酵培养基中，发酵培养基中各组分浓度为：葡萄糖25g/L、淀粉5g/L、玉米浆10g/L、酵母膏5g/L、黄豆饼粉20g/L、氯化钠8g/L、碳酸钙20g/L、氯化铵8g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵3g/L、CuSO4 0.4g/L、精氨酸0.4mg/L；采用补料培养的方法进行培养，发酵进行到78小时，向发酵体系流加浓度为140g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中碳源浓度保持在85g/L，流加葡萄糖溶液时，利用碳酸钙调节pH，使发酵液的pH保持在7.5，发酵周期为6天。检测安来霉素效价为9217mg/L。较本实验室公开的“发酵法生产多肽类抗生素安来霉素的方法”(授权号：CN 101245362B)中最高效价6630mg/L，采用本发明的安来霉素发酵效价提高了1.39倍。
实施例3
所使用的微生物为链霉菌为Streptomyces sp.NJWGY3665。将链霉菌接种到到发酵培养基中，发酵培养基中各组分浓度为：葡萄糖50g/L、淀粉15g/L、玉米浆25g/L、酵母膏4g/L、黄豆饼粉8g/L、氯化钠10g/L、碳酸钙17g/L、氯化铵10g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸铵5g/L、FeSO4 0.8g/L、精氨酸0.6mg/L；采用补料培养的方法进行培养，发酵进行到75小时，向发酵体系流加浓度为120g/L的葡萄糖溶液，使发酵液中碳源浓度保持在100g/L，流加葡萄糖溶液时，利用氢氧化钠调节pH，使发酵液的pH保持在7，发酵周期为9天。检测安来霉素效价为13078mg/L。较本实验室公开的“发酵法生产多肽类抗生素安来霉素的方法”(授权号：CN 101245362 B)中最高效价6630mg/L，采用本发明的安来霉素发酵效价提高了1.97倍。
Claims (7)
1.一种利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，其具体步骤如下：(1)将链霉菌接种到到发酵培养基中，发酵培养基中各组分浓度为：葡萄糖20g/L～50g/L、淀粉5g/L～20g/L、玉米浆10g/L～30g/L、酵母膏1g/L～5g/L、黄豆饼粉5g/L～20g/L、氯化钠5g/L～10g/L、碳酸钙15～20g/L、氯化铵5～10g/L、磷酸二氢钾2～5g/L、硫酸铵3g/L～5g/L、无机盐离子0.4g/L～0.8g/L、氨基酸0.2mg/L-0.6mg/L；(2)采用补料培养的方法进行培养，发酵进行到70～78小时，向发酵体系流加葡萄糖溶液，使发酵液中碳源浓度保持在60g/L～100g/L，控制发酵液pH值，发酵周期为6-9天。
2.根据权力要求1所述的利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，其特征在于所述的无机盐为MgSO4，CuSO4或FeSO4。
3.根据权力要求1所述的利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，其特征在于所述的氨基酸为半胱氨酸、精氨酸或丝氨酸。
4.根据权力要求1所述的利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，其特征在于：所述流加的葡萄糖溶液的浓度为50g/L～150g/L。
5.根据权力要求1所述的利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，其特征在于：流加葡萄糖溶液时，用碳酸钙或氢氧化钠调节pH；调节pH保持在6.5～7.5。
6.根据权力要求1所述的利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，其特征在于。
7.根据权力要求1所述的利用链霉菌发酵生产安来霉素的优化工艺，其特征在于：所述的链霉菌，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名是Streptomycessp.，参据的微生物：NJWGY3665，保藏日期是2008年3月21日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.2410。
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