CN102247528B - 一种具有滋肾宁神作用的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有滋肾宁神作用的药物组合物及其制备方法，本发明药物组合物由熟地黄、山药、金樱子、酸枣仁、首乌藤等十五味药组成，本发明根据各味药材的主要化学成分的理化性质及药理作用，以安神药效为指标对本方的提取工艺进行筛选，并结合化学指标对筛选所得工艺进行优化，考察提取、浓缩及干燥等条件，同时对芍药苷进行了含量测定，通过上述研究，提高了质量标准的控制水平，使产品质量更有保障。

Description

一种具有滋肾宁神作用的药物组合物及其制备方法

发明领域

本发明涉及一种药物组合物，特别涉及一种具有滋肾宁神作用的药物组合物及其制备方法、检测方法。

背景技术

失眠是临床常见而又难治的病症，长时间的失眠严重损害患者身心健康。目前大量使用的苯二氮类等镇静催眠药物在治疗失眠的同时也产生一定的依赖性，而中药制剂的镇静催眠作用具有在起效的同时不产生药物依赖性优点。本发明由熟地黄、山药、金樱子、酸枣仁、首乌藤、女贞子、菟丝子、牛大力、茯苓、珍珠母、白芍、丹参、制何首乌、黄精、五味子、五指毛桃等十六味中药加工制成，具有滋补肝肾，宁心安神的功效，对治疗肝肾亏损，头晕耳鸣，失眠多梦，怔忡健忘，腰酸遗泄，神经衰弱等有显著的疗效。

发明内容

本发明的目的在于公开一种具有滋肾宁神作用的药物组合物，本发明的另一个目的在于公开该组合物的制备方法，还在于公开该组合物的检测方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明药物组合物的原料药组成为：

熟地黄220-260重量份    山药180-210重量份

金樱子180-210重量份    酸枣仁40-60重量份

首乌藤220-260重量份    女贞子140-160重量份

菟丝子140-160重量份    牛大力380-400重量份

茯苓180-210重量份      珍珠母380-400重量份

白芍140-160重量份      丹参180-210重量份

制何首乌140-160重量份  黄精180-210重量份

五味子40-60重量份      五指毛桃380-400重量份；

本发明药物组合物的原料药组成优选为：

熟地黄244重量份   山药196重量份    金樱子196重量份

酸枣仁49重量份    首乌藤244重量份  女贞子147重量份

菟丝子147重量份   牛大力391重量份  茯苓196重量份

珍珠母391重量份    白芍147重量份   丹参196重量份

制何首乌147重量份  黄精196重量份   五味子49重量份

五指毛桃391重量份；

本发明药物组合物的原料药组成优选为：

熟地黄230重量份    山药205重量份    金樱子206重量份

酸枣仁42重量份     首乌藤225重量份  女贞子158重量份

菟丝子155重量份    牛大力385重量份  茯苓182重量份

珍珠母396重量份    白芍156重量份    丹参185重量份

制何首乌142重量份  黄精208重量份    五味子56重量份

五指毛桃382重量份；

本发明药物组合物的原料药组成优选为：

熟地黄250重量份    山药192重量份      金樱子190重量份

酸枣仁54重量份     首乌藤248重量份    女贞子142重量份

菟丝子140重量份    牛大力396重量份    茯苓201重量份

珍珠母386重量份    白芍143重量份      丹参200重量份

制何首乌150重量份  黄精190重量份      五味子46重量份

五指毛桃395重量份；

其中所述的酸枣仁优选炒酸枣仁，菟丝子优选制菟丝子，白芍优选炒白芍，黄精优选制黄精。

取上述原料药，加入常规辅料，按照常规工艺制成颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、口服液体制剂、注射剂等药学上可接受的各种剂型。

本发明药物组合物的制备方法为：

取制何首乌粉碎成粗粉，采用干热灭菌法在温度110-130℃的灭菌条件下，灭菌0.5-1.5小时，备用；取处方中除制何首乌外其余熟地黄等十五味原料药，加水煎煮1-3次，每次加6-10重量倍水，每次煎煮0.5-2.5小时，滤过，合并滤液，滤液于90℃下减压浓缩至60℃测得相对密度为1.18～1.22，浓缩液加85-95％乙醇调节含醇量至80％，静置20-30h，滤过，滤液回收乙醇，于60℃减压浓缩至25℃测得相对密度为1.25～1.30的清膏，将水提醇沉清膏按比例加入制何首乌粗粉，混匀，在65-75℃、-0.09MPa条件下进行真空干燥，即得。

本发明药物组合物的制备方法优选为：

取制何首乌粉碎成粗粉，采用干热灭菌法在温度120℃的灭菌条件下，灭菌1小时，备用；取处方中除制何首乌外其余熟地黄等十五味原料药，加水煎煮2次，每次加8重量倍水，每次煎煮1.5小时，滤过，合并滤液，滤液于90℃下减压浓缩至60℃测得相对密度为1.18～1.22，浓缩液加95％乙醇调节含醇量至80％，静置24h，滤过，滤液回收乙醇，于60℃减压浓缩至25℃测得相对密度为1.25～1.30的清膏，将水提醇沉清膏按比例加入制何首乌粗粉，混匀，在70℃、-0.09MPa条件下进行真空干燥，即得。

本发明药物组合物的检测方法为：

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部正文41页及附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验色谱柱：ODS C18色谱柱(250mm×4.60mm，5μm)；流动相∶乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)；检测波长：230nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；

对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解，摇匀，制成每1ml含芍药苷0.1mg的溶液；

标准曲线的制备取上述对照品溶液依次进样1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl、18μl、20μl测定峰面积。以峰面积积分值(A)对进样量(m)进行回归，得回归方程A＝1387.3m-38.4(r＝0.9998)；表明芍药苷0.1μg～2.0μg进样量范围内与峰面积的线性关系良好；

供试品溶液的制备 精密移取水提液20-30体积份，减压浓缩至干，残渣加40-60％乙醇适量使溶解，并转移至50ml量瓶中，加40-60％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.008-0.12体积份，注入液相色谱仪，测定，即得，每日用制剂量含芍药苷不得少于8-12mg。

本发明药物组合物的检测方法优选为：

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部正文41页及附录VID)测定。

色谱条件与系统适用性试验色谱柱：ODS C18色谱柱(250mm×4.60mm，5μm)；流动相∶乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)；检测波长：230nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；

对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解，摇匀，制成每1ml含芍药苷0.1mg的溶液；

标准曲线的制备 取上述对照品溶液依次进样1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl、18μl、20μl测定峰面积。以峰面积积分值(A)对进样量(m)进行回归，得回归方程A＝1387.3m-38.4(r＝0.9998)；表明芍药苷0.1μg～2.0μg进样量范围内与峰面积的线性关系良好；

供试品溶液的制备 精密移取水提液25体积份，减压浓缩至干，残渣加50％乙醇适量使溶解，并转移至50ml量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.01体积份，注入液相色谱仪，测定，即得，每日用制剂量含芍药苷不得少于9.0mg。

本发明所述的重量份与体积份的关系为克/毫升。本发明药物组合物检测方法可以应用于组合物的各种剂型，如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、分散片、滴丸剂、水丸剂、蜜丸剂、微丸剂、浓缩丸剂、口服液体制剂或注射剂等临床可接受的剂型，由于不同剂型的制剂其中所含的相当生药量是相同的，因此各个剂型在进行检测时，所选用样品量可统一折算为日用制剂量为计量单位，每单位制剂可以为每片、每粒、每支或每丸等。

本发明根据各味药材的主要化学成分的理化性质及药理作用，设计了四种工艺路线，并对不同工艺路线得到的产物的药理活性进行了评价，考察了不同产物对小鼠自发活动的影响、对阈下剂量戊巴比妥钠作用的影响、对阈剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响，初步选择全方水提醇沉的提取工艺；以安神药效为指标对本方的提取工艺进行筛选，并结合化学指标对筛选所得工艺进行优化，考察提取、浓缩及干燥等条件，同时对芍药苷进行了含量测定，通过上述研究，提高了质量标准的控制水平，使产品质量更有保障。

附图说明

图1：颗粒的临界相对湿度CRH求算

图2：滋肾宁神胶囊HPLC专属性图谱

下述实验例和实施例进一步证明但不限于本发明。

实验例1本发明药物组合物提取工艺筛选研究

1实验材料

(1)药品与仪器 滋肾宁神丸(批号：070505)与熟地黄、白芍(炒)等十六味药材均由广东省潮州市宏兴制药厂提供，地西泮片(广东三才医药集团有限公司，生产批号：20080404)，戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：WS20051129)，ZZ-6小鼠自主活动测试仪(成都泰盟科技有限公司)

(2)实验动物 KM种小白鼠，体重18～22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：0031813；0031842；0031870。

2实验方法

(1)滋肾宁神方的不同提取工艺

全方水提：取全方药物680g，加8倍量水浸泡0.5h，加热煎煮2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，滤液浓缩至340mL，即每1ml浓缩液相当于药材量2g，备用。

全方醇提：取全方药物680g，加5倍量70％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩至约340mL，即每1ml浓缩液相当于药材量2g，备用。

全方水提醇沉：取全方药物680g，加8倍量水煎煮2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，浓缩至800mL，放冷后加适量乙醇调整至乙醇浓度约为80％，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇至340mL，即每1mL浓缩液相当于药材量2g，备用。

部分水提部分醇提(以下简称水醇结合)：取全方药物680g，其中首乌藤、女贞子、丹参、制何首乌、五味子和五指毛桃等6味，加5倍量70％乙醇，加热回流2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，回收至无醇味，即得醇提浓缩液；其余十味加8倍量水煎煮2次，每次1h，滤过，合并滤液，浓缩至450mL，即得水提浓缩液；混合水提及醇提浓缩液，摇匀，加热浓缩至340mL，即每1ml浓缩液相当于药材量2g，备用。

(2)小鼠自主活动实验

取KM小鼠132只，18～22g，雌雄各半，随机分为11组，每组12只，分别为空白组、阳性组、水提高剂量组、水提低剂量组、醇提高剂量组、醇提低剂量组、水提醇沉高剂量组、水提醇沉低剂量组、水醇结合高剂量组、水醇结合低剂量组、原剂型组。按体表面积折算等效剂量，各提取物高剂量19.93g·kg^-1相当于人用量的40倍，低剂量4.98g·kg^-1相当于人用量的10倍，原剂型组剂量为19.93g·kg^-1，阳性对照组给予地西泮片，剂量为19mg·kg^-1，空白组给予等体积蒸馏水。小鼠每天灌胃给药1次，连续6d。于末次给药后1h，将小鼠置于小鼠自主活动记录仪中适应5min，记录5min内动物的活动次数。结果以

表示，考察各组样本均数间的差异用t检验。结果见表1。

表1不同工艺滋肾宁神方对小鼠自主活动的影响

注：与空白组比较¹⁾p＜0.05，²⁾p＜0.01

结果表明，滋肾宁神丸原剂型组、滋肾宁神方水提醇沉高、低剂量组与空白组比较，可显著减少小鼠活动次数(p＜0.01或p＜0.05)。提示滋肾宁神方采用水提醇沉工艺能显著减少小鼠自主活动，说明滋肾宁神方采用水提醇沉工艺具有明显镇静作用。

(3)睡眠实验

阈下剂量戊巴比妥钠睡眠实验：小鼠分组和给药同小鼠自主活动试验。于末次给药1h后，每鼠腹腔注射戊巴比妥钠36mg·kg^-1。观察给药后15min内小鼠翻正反射消失达1min为入睡指标，记录各组入睡小鼠的只数，即睡眠数，计算入睡率。考察各组样本率间的差异用χ²检验。结果见表2。

表2不同工艺滋肾宁神方对注射阈下剂量戊巴比妥钠的小鼠入睡率(％)的影响

注：与空白组比较¹⁾p＜0.05，²⁾p＜0.01

结果表明，滋肾宁神方采用不同提取工艺对注射阈下剂量戊巴比妥钠的小鼠入睡率均有一定的影响，以水提醇沉低剂量组入睡率最大。提示滋肾宁神方采用水提醇沉工艺有较强的中枢神经抑制作用，使小鼠入睡动物数增加，说明滋肾宁神方采用水提醇沉工艺对阈下剂量戊巴比妥钠具有较强的协同作用。

阈剂量戊巴比妥钠睡眠实验：小鼠分组和给药同小鼠自主活动试验。于末次给药1h后，每鼠腹腔注射戊巴比妥钠45mg·kg^-1，15min翻正反射消失达30s以上为进入睡眠，以其翻正反射恢复为小鼠的苏醒，其间为睡眠时间，记录各组小鼠的睡眠持续时间。结果以

表示，考察各组样本均数间的差异用t检验。结果见表3。

表3不同工艺滋肾宁神丸对注射阈剂量戊巴比妥钠的小鼠睡眠时间(min)的影响

注：与空白组比较¹⁾p＜0.05，²⁾p＜0.01

结果表明，滋肾宁神丸原剂型组、滋肾宁神方水提低剂量组，水提醇沉高、低剂量组灌胃给药后均能延长小鼠的持续睡眠时间，与空白组比较，差异显著(p＜0.01或p＜0.05)，且水提醇沉组相对优于其余各组。提示滋肾宁神方采用水提醇沉工艺对小鼠中枢镇静催眠具有较好的作用。

3实验结果

实验结果表明，水提醇沉组作用效果优于其它给药组；说明滋肾宁神方采用水提醇沉工艺对小鼠中枢神经系统有明显的镇静和催眠作用，能明显抑制小鼠的自主活动，能明显延长戊巴比妥钠对小鼠的催眠时间，增加阈下剂量戊巴比妥钠所致睡眠动物数，对戊巴比妥钠致小鼠睡眠有协同作用。滋肾宁神方采用水提醇沉工艺其镇静催眠效果明显优于滋肾宁神丸，并且可大大减少服用量，从以上两方面考虑，选择水提醇沉工艺为滋肾宁神方的提取工艺。

实验例2对筛选所得工艺参数的优化实验

1、制何首乌粉碎工艺研究

取三份制何首乌(批号：080120)，每份2kg，平行进行干燥，60℃烘干，取出，称重，用粉碎机碎成30目粗粉，称重，计算出粉率，结果见表4。

表4制何首乌干燥与粉碎实验结果

上表结果表明：三份制何首乌干燥后的磨粉得率都在96％以上，符合要求，说明制何首乌干燥磨粉工艺可行。

2、药粉灭菌工艺研究

(1)试验方法

按处方比例取制何首乌粗粉混合均匀作为样品，分别采用湿热灭菌法、干热灭菌法和紫外线灭菌法，在规定的灭菌条件下对样品进行灭菌(见表5)，对样品进行微生物限度检查，并以2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量为指标，对灭菌前后的成分变化进行跟踪。

表5不同灭菌方法和条件

(2)微生物限度检查

照微生物限度检查法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

(3)2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部正文123页及附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(25∶75)为流动相；检测波长为320nm。理论板数按2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000。

对照品溶液的制备精密称取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷0.2mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取样品粉末(过四号筛)0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，上清液滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

(4)测定结果

灭菌前后样品微生物限度检查和2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的测定结果见表6。

表6灭菌方法和条件的考察结果

由上表可知：以微生物限度为考察指标，湿热灭菌法和干热灭菌法的灭菌效果较好。但湿热灭菌法灭菌前后2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量变化较大，而干热灭菌法其含量变化小，故选择干热灭菌法，灭菌条件为温度120℃时，灭菌1小时。

3、提取工艺技术条件的研究

根据本方水提的影响因素，选定加水倍数，提取次数，每次提取时间3个因素，每个因素取3个水平，选用L₉(3⁴)正交表进行试验，因素水平安排见表7。

按照L₉(3⁴)正交表，通过HPLC法，测定芍药苷的含量变化和总固物。

表7因素水平表

(1)试验方法

表8处方

样品制法：以上十五味，一起用数倍量的水煎煮一定次数，每次一定时间，滤过，合并滤液，减压浓缩至一定体积得浓缩液，备用。

检测指标：对芍药苷含量及总固物的量进行测定。本方药味众多，化学成分不明确，相互干扰大，不利于化学成分检测方法的建立。本制剂采用水提醇沉工艺，方中除芍药苷外其余水溶性指标成分尚未能进行含量测定。此外方中白芍(炒)具有养血、敛阴止汗、平肝止痛之功，与滋肾宁神方功能主治基本一致，因此根据预实验结果，并参考广东省药品检验所文献《HPLC法测定滋肾宁神丸中芍药苷的含量》选择白芍(炒)中有效成分芍药苷作为指标进行含量测定。

(2)芍药苷含量测定

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部正文41页及附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：ODS C₁₈色谱柱(250mm×4.60mm，5μm)；流动相∶乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)；检测波长：230nm；流速：1.0ml·min^-1；柱温：30℃。

对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解，摇匀，制成每1ml含芍药苷0.1mg的溶液。

标准曲线的制备 取上述对照品溶液依次进样1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl、18μl、20μl测定峰面积。以峰面积积分值(A)对进样量(m)进行回归，得回归方程A＝1387.3m-38.4(r＝0.9998)；表明芍药苷0.1μg～2.0μg进样量范围内与峰面积的线性关系良好。

供试品溶液的制备精密移取水提液25ml，减压浓缩至干，残渣加50％乙醇适量使溶解，并转移至50ml量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。计算提取物中芍药苷的含量。

(3)总固物测定

取样品50ml，精密量取，置已称重的蒸发皿中，在105℃烘干至恒重，计算提取物中总固物的重量。

(4)测定结果

正交实验结果见表9。

表9正交试验设计及结果

表10正交试验极差分析结果

表11正交试验方差分析结果

由表10、表11结果可知：影响总固物量和芍药苷提取率因素按影响大小排列为B(煎煮次数)＞A(加水倍数)＞C(煎煮时间)，从节省溶剂及节省时间考虑其最佳提取工艺为A2、B2、C2，即加水煎煮2次，每次加8倍量水，每次1.5小时。

4、最优提取工艺重复试验

根据最佳的提取工艺，即熟地黄、山药、金樱子等十五味一起加水煎煮2次，每次加8倍量水，每次1.5小时，滤过，合并滤液，重复试验，测定芍药苷和总固物的量，见表12。

表12最优提取工艺重复试验结果

最佳工艺条件确定为：按比例称取处方中除制何首乌外十五味加8倍量水煎煮2次，每次1.5小时。

5、醇沉工艺技术条件考察

根据本方醇沉的影响因素，选定浓缩温度(A)，浓缩液相对密度(B)，含醇量(C)，静置时间(D)等4个因素，每个因素取3个水平，选用L₉(3⁴)正交表进行试验，因素水平安排见表13。通过L₉(3⁴)正交表，通过HPLC法，测定芍药苷的含量变化和总固物。

表13醇沉工艺试验因素水平表

(1)试验方法

表14处方

样品制法：以上十五味，加水煎煮2次，每次加8倍量水，每次1.5煎煮小时，滤过，合并滤液，在一定温度下减压浓缩至一定相对密度(60℃)，浓缩液加乙醇至一定含醇量，静置一定时间，滤过，合并滤液，即得水提醇沉液，备用。

(2)芍药苷含量测定

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部正文41页及附录VI D)测定。试验方法同提取工艺技术条件研究中的芍药苷含量测定。

(3)总固物测定

取样品50ml，精密称定，置已称重的蒸发皿中，在105℃烘干至恒重，计算提取物中总固物的重量。

(4)测定结果

正交实验结果见表15。

表15醇沉工艺正交设计及试验结果

表16正交试验极差分析结果

表17正交试验方差分析结果

由表16、表17结果可知：影响总固物量和芍药苷提取率因素按影响大小排列为C(含醇量)＞D(静置时间)＞A(浓缩温度)＞B(浓缩液浓度)，从乙醇用量考虑其最佳提取工艺为B2、C3、D2，即90℃下减压回收乙醇至相对密度1.20(60℃)，浓缩液加乙醇至含醇量为80％，静置24小时，滤过，合并滤液，即得水提醇沉液，备用。

6、最优醇沉工艺重复试验

根据最佳的提取工艺重复试验，测定芍药苷和总固物的量，见表18。

表18最优提取工艺重复试验结果

最佳工艺条件确定为：90℃下减压浓缩至相对密度1.20(60℃)，浓缩液加95％乙醇调节含醇量至80％(即加5.3倍量乙醇)，静置24小时，滤过，合并滤液，即得水提醇沉液，备用。

7、浓缩工艺研究

分别取实施例1制备的水提醇沉液共八份，平均分成四组，每组两份，分别以60℃、70℃、80℃、90℃进行减压回收乙醇(压强均为-0.08～-0.09MPa)至相对密度为1.27(25℃)的清膏。并按提取工艺技术条件研究中的芍药苷含量测定方法测定并计算水提醇沉浓缩液中的芍药苷含量(mg)，结果见表19。

表19不同浓缩温度对芍药苷含量的影响(n＝2)

结果表明减压浓缩温度为60℃时芍药苷含量最高，因此减压浓缩温度选择60℃为宜。

8、干燥工艺研究

(1)干燥方式的选择

按比例称取实施例1制备的水提醇沉浓缩液与制何首乌粗粉，混匀，进行不同干燥方式的考察，结果显示，真空干燥和微波干燥可顺利进行。对三种干燥工艺下得到的干燥物进行总量计算和芍药苷含量测定，并计算芍药苷总转移率，结果见表20、表21。

表20不同干燥工艺对干燥产物的影响

表21不同干燥工艺对芍药苷含量的影响

注：总转移率(％)＝干燥物中芍药苷总量(mg)/药材中芍药苷总量(mg)×100

实验结果显示，水提醇沉浓缩液与制何首乌粗粉按比例混匀，真空干燥方法工艺可行，干燥时间短，产物干爽，指标成分芍药苷损失较少；与其它干燥工艺比较，是生产比较可行的干燥方式。

(2)干燥温度的选择

按比例称取实施例1制备的水提醇沉浓缩液与制何首乌粗粉，混匀，分别在60℃、70℃、80℃条件下进行真空干燥(压强均为-0.09MPa)，干燥结果如表22。对三种干燥工艺下得到的干燥物进行总量计算和芍药苷含量测定，并计算芍药苷总转移率，结果见表23。

表22不同干燥温度对干燥产物的影响

表23样品干燥温度的选择结果

注：总转移率(％)＝干燥物中芍药苷总量(mg)/药材中芍药苷总量(mg)×100

实验结果显示，水提醇沉浓缩液与制何首乌粗粉按比例混匀，在70℃、-0.09MPa下进行真空干燥，干燥时间短，产物干爽，指标成分芍药苷损失较少；与其它真空干燥条件比较，是生产比较可行的干燥条件。

(3)最优干燥工艺重复试验

根据最佳的干燥工艺重复试验，测定芍药苷和总固物的量。

表24白芍(炒)等醇提清膏干燥优化工艺重复试验结果

注：总转移率(％)＝干膏粉中芍药苷总量(mg)/药材中芍药苷总量(mg)×100

表24结果显示，干膏粉量为452.4g，与投料药材相比，该工艺芍药苷的总转移率为64.8％。重复实验结果基本相同，说明工艺稳定、重复可行。因此，本工艺干燥方式选为：水提醇沉清膏按比例加入制何首乌粗粉，混匀，在70℃、-0.09MPa条件下进行真空干燥。

实验例3成型工艺研究

1、颗粒制备工艺

工艺1：取实施例1制备的干膏粉与适量淀粉、羧甲基淀粉钠等辅料，混匀，用水制备软材，粘度较大，无法制粒。

工艺2：取实施例1制备的干膏粉与适量淀粉、羧甲基淀粉钠等辅料，混匀，用70％乙醇溶液制备软材，粘度适中，可制粒，但颗粒易吸湿。

工艺3：取实施例1制备的干膏粉与适量淀粉、羧甲基淀粉钠、滑石粉等辅料，混匀，用70％乙醇溶液制备软材，粘度适中，可制粒，颗粒不易吸湿。

工艺2、工艺3均可以制粒，考虑到不加滑石粉制得的颗粒易吸湿不稳定，因此选择工艺3。

颗粒制备工艺确定为：取实施例1制备的干膏粉与适量淀粉、羧甲基淀粉钠、滑石粉等辅料，混匀，用70％乙醇溶液制备成软材，制成20目的颗粒，颗粒于70℃下低温干燥。

2、吸湿百分率及休止角测定

吸湿百分率测定：将底部盛有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器放入25℃的恒温培养箱内恒温24小时，此时干燥器内的相对湿度为75％。在已恒重的称量瓶底部放入厚约2mm的实施例1制备的干膏粉及颗粒，准确称重后置于氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器内(称量瓶盖打开)，于25℃恒温培养箱保存96小时，称量，按下式计算吸湿百分率。平行做3份，结果见表25。

表25颗粒与粉末吸湿百分率比较(n＝3)

3、休止角测定

以实施例1制备的药粉和按上述步骤1中颗粒制备工艺制备的颗粒为样品，采用固定漏斗法，将三只漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上1cm的高度处，小心地将按不同样品分别沿漏斗壁倒入最上的漏斗中直到最下面漏斗形成的圆锥体尖端接触到漏斗口为止，由坐标纸测出圆锥底部的直径(反复测定5次)，计算出休止角(tgα＝H/R)，结果见表26。

表26药粉与颗粒的休止角(n＝5)

表25、表26结果表明：粉末制成颗粒后，其吸湿率性和流动性均有较大改善，故本工艺中选择将药粉制颗粒后再装胶囊。

4、临界相对湿度

将颗粒干燥至恒重后，在已恒重的称量瓶底部放入约2mm的干膏粉(干膏粉由实施例1制备)，准确称量后置于所列的分别盛有7种不同浓度硫酸或不同盐的过饱和溶液的干燥器内(称量瓶盖打开)，于25℃恒温培养箱中保持96小时后称量，计算吸湿百分率。以吸湿百分率数据为纵坐标，相对湿度数据为横坐标作图，结果见表27、图1。

表27颗粒96h后在不同相对湿度下的吸湿百分率

临界相对湿度CRH是药物吸湿与否的临界值，根据它确定生产时的环境湿度。由实验结果可知，制成颗粒的临界相对湿度CRH为67％，故在生产本制剂时，车间环境的相对湿度应控制在67％以下，同时对包装材料和贮存条件亦提出了相应的要求。

5、胶囊填充

按照上述步骤1中颗粒制备工艺制得的颗粒吸湿性较低、流动性较好，可以直接在自动胶囊填充机上填充。

在相对湿度50-65％的洁净操作车间环境下，取上述颗粒，混匀，采用自动胶囊填充机把上述干颗粒灌装入0#胶囊中，每粒调重为0.5g。

表28制剂处方

取实施例1制备的干膏粉，加入羧甲基淀粉钠、滑石粉、淀粉，混匀，制成颗粒。取上述颗粒，淀粉适量，混匀，装入0#胶囊，制成1000粒，每粒0.5g，即得。

实验例4芍药苷的含量测定

芍药苷系白芍(炒)所含特征性成分，正文采用高效液相色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI D)进行含量测定。

1、仪器与试药

(1)仪器：DIONEX SUMMIT高效液相色谱仪(美国戴安)，Chromeleon色谱工作站。

(2)试剂：乙腈为色谱纯(Merk公司)试剂，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

(3)对照品及样品：芍药苷(供含量测定用，0736-200219)由中国药品生物制品检定所提供。滋肾宁神胶囊3批(批号为20081028、20081029、20081030)，滋肾宁神胶囊由实施例1所述方法制备。

(4)色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，250mm×4.60mm)。

2、液相色谱条件

(1)实验条件的选择

①最大吸收波长的选择

参照《中国药典》2005年版一部中，白芍药材质量标准的含量测定方法，选择230nm作为检测波长。

②流动相的选择

参照《中国药典》2005年版一部中，白芍药材质量标准的含量测定方法，选择乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)为流动相。

③柱温的选择

研究中发现，不同柱温对待测成分的分离有一定的影响，但影响不大，即芍药苷的分离对温度的影响不敏感，故在实际实验中可根据样品分离的情况在20～40℃范围内选择适宜的柱温。

④理论板数的确定

根据精密度试验结果，暂订理论板数以芍药苷峰计算应不低于3000。

⑤最终色谱条件的确定

固定相为C₁₈色谱柱，粒径μm。流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)；检测波长：230nm；流速：1ml/min；柱温：20～40℃；进样量：10μl；理论塔板数都应不低于3000。

(2)前处理条件的选择

对照品溶液的配制精密称取芍药苷对照品4.8mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1ml甲醇中含芍药苷48μg的溶液，即得。

①提取溶媒考察

取本品内容物，研细，各取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇、70％乙醇、乙醇、甲醇、50％甲醇及70％甲醇各25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相应的溶媒补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定结果见表29。

表29不同浓度的乙醇提取溶媒对芍药苷含量的影响

结果表明，以50％乙醇作为溶剂提取得芍药苷含量较高，故采用50％乙醇作为提取溶剂。

②提取方法考察

取本品内容物，研细，各取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇各25ml，密塞，称定重量，分别采用超声处理和加热回流提取30分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定结果见表30。

表30超声和回流提取方法对芍药苷含量影响

结果表明，两种提取方法效果相当，从操作简便考虑，采用超声处理为宜。

③提取时间考察

取本品内容物，研细，各取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理30分钟、40分钟及60分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定结果见表31。

表31不同提取时间对芍药苷含量影响

结果表明，选用30分钟、40分钟和60分钟三个时间提取效果无显著性差异，从节约时间考虑，采用30分钟为宜。

④提取次数考察

取本品内容物，研细，各取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇各25ml，密塞，称定重量，分别超声处理30分钟1次和2次，另精密加入50％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟1次，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定结果见表32。

表32不同提取次数对芍药苷含量的影响

结果表明，不同提取次数及提取体积效果相当，从操作简便和节约成本考虑，采用提取次数为1次，提取体积为25ml为宜。

综上结果可得，供试品溶液的制备方法为：取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀。取上清夜，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，即得。

3、方法学考察

(1)专属性考察

按处方比例制成缺白芍按实施例1的方法制成缺白芍(炒)阴性对照溶液，精密吸取溶液10μl，测定，结果阴性对照液在芍药苷对照品相同保留时间位置上未见色谱峰，说明无干扰，见图2。

(2)线性范围的考察

精密吸取对照品溶液2、4、6、10、12、16、18、20μl进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，并以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，得标准曲线：Y＝1.191X-1.713，r＝0.9999。表明芍药苷在96～960ng范围内呈良好线性关系。结果见表33。

表33不同进样量的芍药苷测定值

(3)精密度试验：精密吸取上述对照品溶液10μl重复进样6次，测得峰面积积分值RSD＜2％，结果见表34。

(4)稳定性试验：取上述供试品溶液10μl，按上述色谱条件间隔一定时间测定6次，结果见表35，结果表明12小时内稳定。

表34精密度RSD％＜2％试验结果

表35样品在12小时内稳定性试验结果

(5)重复性试验：按上述芍药苷的含量测定方法，对同一批样品(批号：20081030)平行制备6份供试品溶液，测得峰面积并计算含量，RSD＜2％，结果见表36。

表36样品重复性RSD＜2％试验结果

(6)准确度试验：采用加样回收法，取已知含量的样品(批号20081030)，分别精密加入一定量的芍药苷对照品，按供试品制备与测定方法，在上述色谱条件，平行做9份，结果见表37。

加样回收率(％)＝(实测量-样品量)/加样量*100％

表37芍药苷回收率测定结果在99％-100％内(n＝9)

4、样品测定

取本品内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处30分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀。取上清夜，用0.45μm的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μl，按上述色谱条件测定，结果见表38。

表38三批样品含量测定结果(n＝2)

5、限度制定

根据实施例1制备的滋肾宁神胶囊处方量，计算每粒胶囊含白芍(炒)0.147g，按《中国药典》2005年版一部“白芍”【含量测定】规定，白芍(炒)中含芍药苷2.352mg，另按制剂工艺芍药苷50％的转移率计所得量的20％值作下限，确定滋肾宁神胶囊的含量限度为：本品每粒含芍药苷总量不得少于1.0mg。

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：胶囊的制备

熟地黄244g    山药196g      金樱子196g

酸枣仁49g     首乌藤244g    女贞子147g

菟丝子147g    牛大力391g    茯苓196g

珍珠母391g    白芍147g      丹参196g

制何首乌147g  黄精196g      五味子49g

五指毛桃391g；

取制何首乌粉碎成粗粉，采用干热灭菌法在温度120℃的灭菌条件下，灭菌1小时，备用；取处方中除制何首乌外其余熟地黄等十五味原料药，加水煎煮2次，每次加8重量倍水，每次煎煮1.5小时，滤过，合并滤液，滤液于90℃下减压浓缩至60℃测得相对密度为1.18～1.22，浓缩液加95％乙醇调节含醇量至80％，静置24h，滤过，滤液回收乙醇，于60℃减压浓缩至25℃测得相对密度为1.25～1.30的清膏，将水提醇沉清膏按比例加入制何首乌粗粉，混匀，在70℃、-0.09MPa条件下进行真空干燥，粉碎，取干膏粉，加入羧甲基淀粉钠12g、滑石粉8.5g及淀粉适量，混匀，制成颗粒，70℃下干燥，取上述颗粒与淀粉适量，混匀，装入胶囊，制成1000粒，用法与用量：口服，一次3粒，一日3次；

其中本发明药物组合物中芍药苷的检测方法为：

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部正文41页及附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验色谱柱：ODS C18色谱柱(250mm×4.60mm，5μm)；流动相∶乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)；检测波长：230nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；

对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解，摇匀，制成每1ml含芍药苷0.1mg的溶液；

标准曲线的制备取上述对照品溶液依次进样1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl、18μl、20μl测定峰面积。以峰面积积分值(A)对进样量(m)进行回归，得回归方程A＝1387.3m-38.4(r＝0.9998)；表明芍药苷0.1μg～2.0μg进样量范围内与峰面积的线性关系良好；

供试品溶液的制备精密移取水提液25ml，减压浓缩至干，残渣加50％乙醇适量使溶解，并转移至50ml量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得，每粒胶囊中芍药苷含量不得少于1.0mg。

实施例2：片剂的制备

熟地黄240g    山药200g     金樱子198g

酸枣仁45g     首乌藤242g   女贞子150g

菟丝子152g    牛大力385g   茯苓190g

珍珠母395g    白芍150g     丹参192g

制何首乌140g  黄精200g     五味子52g

五指毛桃387g；

取制何首乌粉碎成粗粉，采用干热灭菌法在温度115℃的灭菌条件下，灭菌1.2小时，备用；取处方中除制何首乌外其余熟地黄等十五味原料药，加水煎煮3次，每次加7重量倍水，每次煎煮1小时，滤过，合并滤液，滤液于90℃下减压浓缩至60℃测得相对密度为1.18～1.22，浓缩液加90％乙醇调节含醇量至80％，静置26h，滤过，滤液回收乙醇，于60℃减压浓缩至25℃测得相对密度为1.25～1.30的清膏，将水提醇沉清膏按比例加入制何首乌粗粉，混匀，在65℃、-0.09MPa条件下进行真空干燥，粉碎，取干膏粉，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂。

实施例3：口服液体制剂的制备

熟地黄250g     山药192g     金樱子190g

酸枣仁54g      首乌藤248g   女贞子142g

菟丝子140g     牛大力396g   茯苓201g

珍珠母386g     白芍143g     丹参200g

制何首乌150g   黄精190g     五味子46g

五指毛桃395g；

取上述原料药，按照常规工艺，加入常规辅料，制成口服液。

实施例4：滴丸的制备

熟地黄230g     山药205g     金樱子206g

酸枣仁42g      首乌藤225g   女贞子158g

菟丝子155g     牛大力385g   茯苓182g

珍珠母396g     白芍156g     丹参185g

制何首乌142g   黄精208g     五味子56g

五指毛桃382g；

取上述原料药，按照常规工艺，加入常规辅料，制成滴丸。

实施例5：本发明药物组合物中芍药苷的检测方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部正文41页及附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验色谱柱：ODS C18色谱柱(250mm×4.60mm，5μm)；流动相∶乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)；检测波长：230nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；

对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解，摇匀，制成每1ml含芍药苷0.1mg的溶液；

标准曲线的制备取上述对照品溶液依次进样1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl、18μl、20μl测定峰面积。以峰面积积分值(A)对进样量(m)进行回归，得回归方程A＝1387.3m-38.4(r＝0.9998)；表明芍药苷0.1μg～2.0μg进样量范围内与峰面积的线性关系良好；

供试品溶液的制备 精密移取实施例2制备的水提液20ml，减压浓缩至干，残渣加55％乙醇适量使溶解，并转移至50ml量瓶中，加60％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各8μl，注入液相色谱仪，测定，即得，每日用制剂量中芍药苷含量不得少于8mg。

实施例6：本发明药物组合物中芍药苷的检测方法

照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部正文41页及附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验色谱柱：ODS C18色谱柱(250mm×4.60mm，5μm)；流动相∶乙腈-0.1％磷酸溶液(14∶86)；检测波长：230nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；

对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇溶解，摇匀，制成每1ml含芍药苷0.1mg的溶液；

标准曲线的制备 取上述对照品溶液依次进样1μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl、18μl、20μl测定峰面积。以峰面积积分值(A)对进样量(m)进行回归，得回归方程A＝1387.3m-38.4(r＝0.9998)；表明芍药苷0.1μg～2.0μg进样量范围内与峰面积的线性关系良好；

供试品溶液的制备 精密移取实施例3制备的水提液30ml，减压浓缩至干，残渣加45％乙醇适量使溶解，并转移至50ml量瓶中，加45％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各12μl，注入液相色谱仪，测定，即得，每日用制剂量中芍药苷含量不得少于12mg。

Claims (5)

1.一种具有滋肾宁神作用的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：该药物组合物的原料药组成为：

取制何首乌粉碎成粗粉，采用干热灭菌法在温度110-130℃的灭菌条件下，灭菌0.5-1.5小时，备用；取处方中除制何首乌外其余熟地黄等十五味原料药，加水煎煮1-3次，每次加6-10重量倍水，每次煎煮0.5-2.5小时，滤过，合并滤液，滤液于90℃下减压浓缩至60℃测得相对密度为1.18～1.22，浓缩液加85-95％乙醇调节含醇量至80％，静置20-30h，滤过，滤液回收乙醇，于60℃减压浓缩至25℃测得相对密度为1.25～1.30的清膏，将水提醇沉清膏按比例加入制何首乌粗粉，混匀，在65-75℃、-0.09MPa条件下进行真空干燥，即得。

2.如权利要求1所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法中药物组合物的原料药组成为：

3.如权利要求1所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法中药物组合物的原料药组成为：

4.如权利要求1所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法中药物组合物的原料药组成为：

5.如权利要求1-4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：

取制何首乌粉碎成粗粉，采用干热灭菌法在温度120℃的灭菌条件下，灭菌1小时，备用；取处方中除制何首乌外其余熟地黄等十五味原料药，加水煎煮2次，每次加8重量倍水，每次煎煮1.5小时，滤过，合并滤液，滤液于90℃下减压浓缩至60℃测得相对密度为1.18～1.22，浓缩液加95％乙醇调节含醇量至80％，静置24h，滤过，滤液回收乙醇，于60℃减压浓缩至25℃测得相对密度为1.25～1.30的清膏，将水提醇沉清膏按比例加入制何首乌粗粉，混匀，在70℃、-0.09MPa条件下进行真空干燥，即得。

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