CN102247361B

CN102247361B - 5-硝基-1氢-吲唑-3-腈在制备药物中的应用

Info

Publication number: CN102247361B
Application number: CN201010179588.3A
Authority: CN
Inventors: 杜冠华; 方莲花; 宫丽丽; 谢平
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2010-05-20
Filing date: 2010-05-20
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2030-05-20
Also published as: CN102247361A

Abstract

本发明公开了如式(I)所示的化合物5-硝基-1氢-吲唑-3-腈或其生理上可接受的衍生物在制备药物中的应用。该化合物具有抑制Rho激酶活性的作用；具有提高一氧化氮合酶水平而促进一氧化氮生成的作用；具有阻断钙通道的作用；具有开放钾离子通道的作用；具有舒张血管、保护血管功能的作用；具有降低血压的药理作用，可用于制备防治高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死及心力衰竭等血管张力异常增高诱发的血管性疾病的药物；同时具有具有毒性较低、合成工艺简单等优点。

Description

5-硝基-1氢-吲唑-3-腈在制备药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物5-硝基-1氢-吲唑-3-腈(5-nitro-1H-indazol-3-carbonitrile，简称DL0805)的新的药理作用，具体涉及DL0805及其生理上可接受的衍生物在制备药物中的应用。

技术背景

众所周知，心脑血管疾病是威胁人类健康的头号杀手，其发病群体在逐步年轻化，发病率和死亡率也在不断上升。这些疾病的主要病因是中央或外周血管结构和功能的改变，如血管张力的异常增加。舒张血管活性物质可主要用于高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死及心力衰竭等与血管张力异常增高诱发的血管性疾病的治疗。

小分子GTP结合蛋白是一种在细胞功能调节过程中起关键作用的单体G蛋白分子。Rho是一种小分子G蛋白，Rho激酶是最早发现的Rho的效应物。在分子水平，Rho激酶表达上调促进炎症、氧化应激、血栓形成和纤维化的各种因子，下调内皮型一氧化氮合酶。在细胞水平，Rho激酶介导血管平滑肌细胞收缩，促进增殖和迁移，促进炎症细胞移动。Rho激酶通过与血管紧张素II、内皮素-1等血管活性物质相互作用，直接参与许多心脑血管疾病的发生发展，如高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死及心力衰竭等。应用Rho激酶抑制剂，对多种心脑血管疾病的治疗具有重要意义，对于目前严重危害人类健康的心脑血管疾病的研究和治疗产生积极的作用。

化合物5-硝基-1氢-吲唑-3-腈(5-nitro-1H-indazol-3-carbonitrile，简称DL0805)，结构式如下

迄今为止，我们没有查到DL0805在预防和治疗血管性疾病的应用的相关报道。

发明内容

本发明的一个方面，涉及如式1所示的化合物5-硝基-1氢-吲唑-3-腈(5-nitro-1H-indazol-3-carbonitrile，简称DL0805)在制备预防、缓解和/或治疗心脑血管疾病引发的症状的药物中的应用。

所述的心脑血管疾病是由各种原因引起的血管性疾病。尤其是由血管张力异常增高诱发的血管性疾病。特别包括高血压病。

在本发明中，所述预防、缓解和/或治疗血管性疾病或血管性疾病引发的疾病或症状选自抑制Rho激酶的活性，提高一氧化氮合酶水平而促进一氧化氮生成，阻断钙通道，开放钾通道，舒张血管、保护血管功能，降低血压。

本发明是通过如下技术方案来实现：通过表达和纯化获得功能性ROCK蛋白，利用ROCK蛋白活性评价系统，筛选出其抑制剂DL0805，合成获得DL0805单体化合物，通过体外血管环张力测定系统，进一步观察DL0805化合物对去甲肾上腺素或氯化钾引起血管收缩的作用，判定DL0805对大鼠离体血管的舒张作用及机制，注射给与DL0805观察对大鼠血压的影响及对高血压等血管张力异常增高诱发的心脑血管疾病的预防和治疗作用。

本发明的另一方面，涉及一种用于预防、缓解和/或治疗血管张力异常增高引发的疾病或症状的药物组合物，其含有预防和/或治疗有效量的DL0805，以及任选的药学可接受的载体和/或辅料。当然，根据本领域的公知常识，还有加入其它的活性成分，制备成复方制剂。本发明所述的产品包括药品、保健品。

在本发明中，根据施用途径，所述DL0805药物组合物可呈选自如下剂型：溶液、悬液、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。

本发明的DL0805药物组合物可以用已知的方法配制，使用几种途径对受试者施用，包括但不限于肠胃外、经口、局部、皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、静脉、鼻内途径。

本发明中DL0805可通过已知方法制备得到。

本发明的DL0805药物组合物任选的可以通过任何常规方法用一种或多种药学可接受的载体和/或赋形剂来配制。因此，DL0805和它药学可接受的衍生物可特别配制为例如吸入或吹入(通过口或鼻)或经口、含化、肠胃外或直肠给药。

DL0805药物组合物也可以采用溶液、悬液、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。这些制剂将含有治疗有效量的DL0805，优选为纯化形式，以及适量的载体，以提供对患者适当给药的形式。

在本发明中，所述纯化形式的DL0805是指基本上纯的5-硝基-1氢-吲唑-3-腈，尤其是纯度大于80％，优选的大于85％，特别优选的大于90％，甚至更优选的大于95％的DL0805。所述纯化形式的DL0805纯度范围可以是例如90-96％。

有益技术效果：

DL0805为单体化合物，具有毒性较低、合成工艺简单等优点；

具有很好的应用与开发前景，是一种比较理想的新型的预防和治疗新型的心脑血管疾病的化合物，可应用于药物的制备。

DL0805具有抑制Rho激酶活性的作用，具有提高一氧化氮合酶水平而促进一氧化氮生成的作用，具有阻断钙通道的作用，具有开放钾离子通道的作用，具有舒张血管、保护血管功能的作用，具有降低血压的药理作用，具有预防和治疗高血压、动脉粥样硬化、脑血管痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死及心力衰竭等与血管张力异常增高诱发的心脑血管疾病的作用。

附图说明

图1.DL0805的化学结构。

图2.DL0805对Rho激酶活性的影响。计算得出其半数抑制浓度(IC₅₀值)为6.67±0.67μM。

图3.DL0805后处理对去甲肾上腺素(A)和KCl(B)引起的血管收缩的影响。n＝6。

图4.DL0805前处理对去甲肾上腺素(A)和KCl(B)引起的血管收缩的影响。n＝6。

图5.DL0805对去甲肾上腺素引起的内皮完整和去内皮大鼠主动脉收缩的影响(A).内皮源性活性物质对DL0805舒血管作用的影响。 n＝6.与去甲肾上腺素比较，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01。

图6.钾通道阻断剂对DL0805舒血管作用的影响。与对照组比较，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01. n＝6。

图7.DL0805对去甲肾上腺素诱导的内质网钙释放的影响。与对照组比较，¹⁾P＜0.05，²⁾P＜0.01. n＝6。

图8.DL0805(1、5、10mg/kg)对正常大鼠血压的影响。

具体实施方式

下面结合本发明，进一步说明DL0805的制备过程及其在体内降低血压的药理作用及在预防和治疗高血压等血管张力异常增高诱发的疾病的应用。下述实施例更详细地举例说明本发明，并不是对本发明的任何限制。

实施例1：DL0805对Rho激酶活性的抑制作用评价。

本实施例通过在白色不透明的96孔板中，每板均设6个阳性对照、6个阴性对照孔。加入5μL化合物，10μL 0.25μM Rho激酶，10μL 1μM Rho激酶特异性底物S6peptide及25μL 1μM ATP。混合均匀后，在37℃反应1小时，加入显色试剂Kinase-Glo，室温孵育10min，读数。并根据下列公式计算样品对Rho激酶的抑制率(％)：其中M_com代表化合物的平均值；M_neg代表阴性对照的平均值；M_pos代表阳性对照的平均值。两倍比依次稀释10个浓度的DL0805，最后根据测定结果计算DL0805对Rho激酶的IC₅₀值。结果显示DL0805能剂量依赖性的抑制Rho激酶的活性，其半数抑制浓度(IC₅₀值)为6.67±0.67μM。判定DL0805极有可能具有预防和治疗血管张力异常增高诱发的血管性疾病的药理作用及应用。

实施例2：DL0805对去甲肾上腺素预刺激血管环收缩的作用。

实验动物选用雄性SD大鼠6只，体重250～300g。大鼠断头处死后，迅速取出胸主动脉，剪成2-3mm长的血管环，将血管环置于盛有K-H液10mL(37℃恒温，并持续通入95％氧气和5％二氧化碳的混合气体)的浴槽中，张力变化被传输并记录在BL-420S生物机能实验系统中。血管环在1.2g张力稳定60min，期间每20min换K-H液1次。以60mM KCl刺激血管环，使血管环收缩，达到最大幅度后冲洗2次，使血管环恢复到刺激前的状态，共2次。加入1μM去甲肾上腺素，达到最大收缩幅度后给予10μM的乙酰胆碱，并测定其舒张幅度。若舒张幅度大于80％表示内皮完整，表明操作过程中对血管环内皮的损失极小，内皮完整性良好，为有内皮组；若不舒张或舒张幅度小于30％表示内皮损失大，内皮功能不完整，为无内皮组。检测内皮功能后，冲洗至刺激前的状态，再稳定30min，进一步检测药物对血管环的影响。

去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)是一种血管收缩药。本实施例通过在反应体系中加入1μM去甲肾上腺素，使血管呈收缩状态，1，2，5，10，25，50μM累积浓度的DL0805对去甲肾上腺素所引起的无内皮和有内皮血管环的收缩均有明显的抑制作用，其抑制作用随浓度的增高而增强，并呈量效关系。判定DL0805对去甲肾上腺素所引起的血管收缩的舒张作用及在预防和治疗血管张力异常增高诱发的血管性疾病的药理作用及应用。

实施例3：DL0805对KCl预刺激血管环收缩的作用。

张力测定用血管环制备方法同实施例3。

高钾能够引起血管收缩。本实施例通过在反应体系中加入60mM KCl，使血管呈收缩状态，1，2，5，10，25，50μM累积浓度的DL0805对KCl所引起的无内皮和有内皮血管环的收缩均有明显的抑制作用，其抑制作用随浓度的增高而增强，并呈量效关系。判定DL0805对去甲肾上腺素所引起的血管收缩的舒张作用及预防和治疗血管张力异常增高诱发的血管性疾病的药理作用及应用。

实施例4：各种内皮源性活性物质对DL0805舒血管作用的影响。

张力测定用血管环制备方法同实施例3。

本实施例通过在反应体系中加入一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(100μM)，环氧合酶抑制剂吲哚美辛(5μM)，鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝(5μM)，预孵育20min后加入1μM去甲肾上腺素使血管呈收缩状态，观察1，2，5，10，25，50μM累积浓度的DL0805对去甲肾上腺素所引起的无内皮和有内皮血管环的舒张作用。L-NAME、亚甲蓝可以显著降低DL0805对去甲肾上腺素预收缩血管的舒张作用，吲哚美辛对DL0805的舒张作用无显著影响。判定DL0805舒血管作用具有内皮依赖性，具有提高一氧化氮合酶水平而促进一氧化氮生成的作用，及在预防和治疗血管张力异常增高诱发的血管性疾病的药理作用及应用。

实施例5：钾通道阻断剂对DL0805舒血管作用的影响。

张力测定用血管环制备方法同实施例3。

本实施例通过在反应体系中加入ATP敏感型钾通道抑制剂格列笨脲(10μM)，钙离子激活性钾通道抑制剂TEA(5mM)，电压敏感型钾通道抑制剂4-AP(100μM)，预孵育20min后加入1μM去甲肾上腺素使血管呈收缩状态，观察1，2，5，10，25，50μM累积浓度的DL0805对去甲肾上腺素所引起的无内皮和有内皮血管环的舒张作用。4-AP、TEA可以显著降低DL0805对去甲肾上腺素预收缩血管的舒张作用，而格列苯脲对高浓度DL0805的舒张作用有显著影响，说明低浓度的DL0805可开放钙离子激活性钾通道和电压敏感型钾通道，高浓度时才开放ATP敏感型钾通道。判定DL0805具有开放钾通道的作用及在预防和治疗血管张力异常增高诱发的血管性疾病的药理作用及应用。

实施例6：DL0805对去甲肾上腺素诱导的内质网钙释放的作用。

张力测定用血管环制备方法同实施例3。

为了确定DL0805舒张血管的作用是否与内质网钙释放相关，本实施例通过在无钙K-H液中加入50μM EGTA，使反应体系中呈无钙状态。血管环在无钙K-H液中洗三次后，与5，10，25，50μM的DL0805预孵育20min，然后在反应体系中加入1μM去甲肾上腺素，刺激内质网的钙释放，并观察去甲肾上腺素引起的收缩。DL0805四个剂量对去甲肾上腺素所引起的收缩均有明显的抑制作用，其抑制作用随浓度的增高而增强，并呈量效关系，说明DL0805具有钙通道阻断作用。判定DL0805对血管的舒张作用与内质网的钙释放相关及在预防和治疗血管张力异常增高诱发的血管性疾病的药理作用及应用。

实施例7：DL0805对大鼠体内的降压作用。

SD大鼠250±20g，24只大鼠随机分为4组：DL0805低、中、高三个剂量组(DL08051、5、10mg/kg)及溶剂对照组。大鼠体内血压测定环境温度控制在18-25℃，湿度控制在45％-60％之间，室内自然光线。用乌拉坦(1.25g/kg)腹腔注射麻醉，固定在手术台上。分离大鼠股动脉，股动脉插管经压力换能器与BL-420S生物机能实验系统相连，描记大鼠动脉收缩压和舒张压；肢体Ⅱ导联接BL-420S生物机能实验系统，记录心电图进行心电描记，记录心率。术后稳定10min后，尾静脉注射给药DL0805(1、5、10mg/kg)，给药后连续采样1h。观察DL0805对大鼠血压和心率的变化。结果显示，DL0805显著降低麻醉大鼠的收缩压和舒张压，而对心率无明显改变，判定DL0805对大鼠有舒张血管、保护血管功能、降低血压的作用及在预防和治疗血管张力异常增高诱发的血管性疾病的药理作用及应用。

综上所述，DL0805具有预防和治疗血管张力异常升高诱发的血管性疾病的作用；抑制Rho激酶活性，提高一氧化氮合酶水平而促进一氧化氮生成，阻断钙通道，开放钾离子通道，舒张血管、保护血管功能，降低血压的药理作用，能够抵抗高血压、动脉粥样硬化、脑血痉挛、冠状动脉痉挛、心肌梗死及心力衰竭等心脑血管疾病，可应用于药物的制备。

Claims

1.如式(I)所示的化合物5-硝基-1氢-吲唑-3-腈在制备预防和/或治疗心脑血管疾病的产品中的应用

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的心脑血管疾病是由血管张力异常增高诱发的血管性疾病。

3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的心脑血管疾病选自高血压病。

4.根据权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，所述的产品包括药品、保健品。

5.一种药物组合物在制备预防和/或治疗心脑血管疾病的产品中的应用，其特征在于，包括有效剂量的式(I)所示的化合物和药学可接受的载体和/或辅料，

6.根据权利要求5的应用，其特征在于，药物组合物中还包括其他的抗心血管疾病活性成分。

7.根据权利要求5-6任一项的应用，其特征在于，所述的药物组合物选自溶液、混悬液、乳剂、丸剂、胶囊、粉末、控制释放或持续释放制剂。