CN102242208A - 双孢蘑菇333号菌株scar-pcr鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种双孢蘑菇333号菌株SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：利用SCAR分子标记对双孢蘑菇333号菌株进行PCR扩增。本发明的方法用于特异性地鉴别出双孢蘑菇333号菌株，该方法耗时短，操作简便，特异性强，只针对蘑菇333特异性扩增出389bp的产物，可以更大地保护双孢蘑菇的菌种资源。

Description

双孢蘑菇333号菌株SCAR-PCR鉴定方法
技术领域
    本发明涉及一种针对双孢蘑菇品种的特异性SCAR-PCR检测方法，更具体涉及一种双孢蘑菇333号菌株的特异性SCAR-PCR检测方法。
背景技术
双孢蘑菇(Agaricus bisporus) 属蘑菇科蘑菇属，别名蘑菇、洋蘑菇、白蘑菇。 其味道鲜美，质地脆嫩，属高蛋白低脂肪的营养食品。经常食用双孢蘑菇，可以防止坏血病、预防肿瘤，促进伤口愈合和解除铅、砷、汞等的中毒，兼有补脾、润肺、理气、化痰之功效，能防止恶性贫血，改善神经功能，降低血脂。
我国是食用蘑菇生产大国，但是食用蘑菇的菌种互相串引，流通量大使得菌种市场的管理比较混乱，同物异名、同名异物的现象较为普遍，品种知识产权得不到有效保护。自DNA双螺旋结构发现以来，伴随着分子生物学的发展许多生物技术已经用于食用蘑菇的分类鉴定研究。目前，常用的技术有：随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)、序列特异扩增区域(SCAR)、ITS序列分析等。
继同核不育单孢分离物配对杂交育种、原生质体融合等细胞水平的育种技术之后，双袍蘑菇的遗传育种已达到分子水平，其成果主要有同工酶电泳法鉴定种性，染色体混合标记连锁图的建立，纤维素酶、漆酶基因的克隆，性因子的定位等。而每个成果的取得都离不开各种遗传标记在该物种研究上的应用及不断更新。
随机扩增多态DNA（RAPD）技术在生命科学的许多研究领域已得到广泛应用，包括遗传多态性研究、分类研究、遗传关系分析、某些特定基因标记、作连锁图谱等。这种以 PCR反应为基础的技术克服了同工酶和RELP技术的一些缺点，具有快速、安全、简便、灵敏度高、需样量少的特点。该方法可用于鉴定不同类型的菌株，而不能对同一菌株进行检测。
各国对本国特产物种的保护已经成为国际贸易技术壁垒的新趋势。为了使得我国农产品物种资源免遭国外侵犯，对双孢蘑菇菌种资源权益保护，势在必行。因此建立双孢蘑菇菌种鉴别技术，十分必要。
序列特异扩增区域(SCAR)的PCR扩增技术已被应用于香菇等食用菌菌种的鉴别，但在双孢蘑菇菌株鉴别上的应用，尚未见报道。
发明内容
本发明基于分子标记技术，建立一种双孢蘑菇333号菌株的SCAR-PCR鉴定方法。
本发明的蘑菇333由福建省蘑菇菌种研究推广站提供，该菌种是目前国内主栽菌株，具有较强的适应能力，我国不管南方、北方都栽培有较大的面积。
本发明的一种双孢蘑菇333号菌株的特异性SCAR-PCR鉴定方法，是利用SCAR分子标记对双孢蘑菇333号菌株进行PCR扩增。
利用特异引物对蘑菇333的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，能特异性地扩增出389 bp的产物；所述特异引物的核苷酸序列为：
MR333-F：5’- AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3’；
MR333-R：5’- CGCAACCCGTATTCAACTCC -3’。
所述SCAR-PCR扩增的条件为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，退火68.0℃l min，72℃延伸l min，40个循环，最后72℃延伸l0 min，4℃保存。反应体系为：10 × Taq buffer 2.0 μL，Taq酶1.5 U，模板DNA 100 ng，MgCl2 3.5 mmol/L，dNTPs 300 μmol/L，上游引物0.5 μmol/L，下游引物0.5 μmol/L，用ddH2O将总体积补至20μL。
本发明的方法用于特异性地鉴别出双孢蘑菇333号菌株，该方法耗时短，操作简便，特异性强，只针对蘑菇333特异性扩增出389 bp的产物，可以更大地保护双孢蘑菇的菌种资源。
附图说明
图1为40个双孢蘑菇SCAR-PCR扩增产物图谱。
具体实施方式
试剂来源：10 × Taq buffer 与Taq酶、dNTPs购自上海生工有限公司，引物委托上海生工有限公司合成，DNA序列委托广州英韦创建生物科技有限公司测试。
 1.引物合成
根据SRAP-PCR扩增产物序列，应用Primer Premier 5.0自动设计了SCAR引物，并用Oligo 6进行分析评价。共设计了5对引物，成功扩增出PCR产物的只有1对，序列如表1。
表1 SCAR-PCR引物及其退火温度
Figure 2011101859019100002DEST_PATH_IMAGE001
SRAP-PCR扩增产物测序结果如下（下划线部分为SRAP引物，5’端为正向引物，3’端为反向引物碱基序列的反向互补序列）：
5’-GACTGCGTACGAATTAGCCCAGGAGTCCAGTAACATGGCGTGGAGCCGGCGCTTCGGCATTGGTGAATGTAGGGCATCTATAAGAAGGGGAATCGTTTATATAACAAGCCAACCGGGAAACCGGACAGGCCACCCCTCTCCAGTCTGCTTCCCGGCACAGCCGGGTTCAGCCCAATCTGGAAGTTAGTAGGGATCACCTAAGCTCCTGATCCGGGCAACTGCATAAGCAACCCGGGGATCAATCAGGTAACGGCCCCTGCGAGACGGCGAGCTCTGACAGTTATAACCACGGTACCTCAGCCCATAGGGGCATATGAAACCGGCTGCGGAGTAACGGGAAACGGTGCCGGGGTCACGCCCGGAGTCACACCGCGGGCCGTAGCGGCTGACTTGGAAAACATAACAGCTGACTCGAGAGGACACTATTCCGCCGTCAGTTGATTCCACGGCACGGTCCGTAAGGGCCGGCGGGGCAGAGTGGCCAATAGCCACGTGTCGCAAGACACCCCCTTAGCCGGGCACGCTTCATCCGAACCACCCCGTTCTTTCGTTATTGGAACGGCGAAAAGCCAAAGGATCTACCTTACATCCCAACGCCTTGGAACGCAAGTCCAAGACGATCCACAAAGTCATCAAGTCTCCATTGGACTCGGTGTTTGACAACCCTTCCTCAGAGATATTTGACCCCCTCTCTGAACACATTAAACCTGGACACCGGTTTGGACTCA-3’(728 bp)。
 2.双孢蘑菇DNA提取与电泳
双孢蘑菇DNA提取与DNA电泳按照文献[陈文炳，林媛，邵碧英，王泽生，廖剑华，李寿崧，江树勋，林河通。双孢蘑菇RAPD-PCR反应体系的优化，食品科学，2008，29（10）：428-432.]。
 3. SCAR-PCR反应体系与条件
反应体系为：10 × Taq buffer 2.0 μL，Taq酶1.5 U，模板DNA 100 ng，MgCl2 3.5 mmol/L，dNTPs 300 μmol/L，上游引物0.5 μmol/L，下游引物0.5 μmol/L，用ddH2O将总体积补至20μL。
扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，退火68.0℃l min，72℃延伸l min，40个循环，最后72℃延伸l0 min，4℃保存。PCR产物电泳按照文献[陈文炳，林媛，邵碧英，王泽生，廖剑华，李寿崧，江树勋，林河通。双孢蘑菇RAPD-PCR反应体系的优化，食品科学，2008，29（10）：428-432.]。
 4.结果分析
SCAR-PCR检测结果如图1，1号为333号菌株，检出特异性SCAR-PCR产物(389 bp)，2-40 号如表2所示 39种双孢蘑菇样品（均由福建省蘑菇菌种研究推广站提供）与纯水空白对照，均未检出PCR产物。可见，该方法对333号菌株具有特异性。
表2 40种双孢蘑菇样品名称与编号
<110> 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
 <120> 双孢蘑菇333号菌株SCAR-PCR鉴定方法
 <130>  11
 <160>  2    
 <170>  PatentIn version 3.3
 <210>  1
<211>  21
<212>  DNA
<213> 人工合成
 <400>  1
aggaaggaaagcaccaaatg g 21                      
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213> 人工合成
<400>  2
cgcaacccgtattcaactcc 20           

Claims (5)

1.一种双孢蘑菇333号菌株SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：利用SCAR分子标记对双孢蘑菇333号菌株进行PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的双孢蘑菇333号菌株SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：利用特异引物对蘑菇333的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增；所述特异引物的核苷酸序列为：
MR333-F：5’- AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3’；
MR333-R：5’- CGCAACCCGTATTCAACTCC -3’。
3.根据权利要求2所述的双孢蘑菇333号菌株SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：利用所述特异引物对蘑菇333的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，特异性地扩增出389 bp的产物。
4.根据权利要求2所述的双孢蘑菇333号菌株SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：所述SCAR-PCR扩增的条件为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，退火68.0℃ l min，72℃延伸l min，40个循环，最后72℃延伸l0 min，4℃保存。
5.根据权利要求2所述的双孢蘑菇333号菌株SCAR-PCR鉴定方法，其特征在于：所述SCAR-PCR扩增的反应体系为：10 × Taq buffer 2.0 μL，Taq酶1.5 U，模板DNA 100 ng，MgCl2 3.5 mmol/L，dNTPs 300 μmol/L，上游引物0.5 μmol/L，下游引物0.5 μmol/L，用ddH2O将总体积补至20μL。
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