CN102181563B

CN102181563B - 一种基于多重pcr技术快速鉴定常见仓储书虱的方法

Info

Publication number: CN102181563B
Application number: CN 201110120037
Authority: CN
Inventors: 王进军; 魏丹丹; 豆威; 王梓英; 袁明龙
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2011-05-10
Filing date: 2011-05-10
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2031-05-10
Also published as: CN102181563A

Abstract

一种基于多重PCR技术快速鉴定常见仓储书虱的方法，首先提取单体书虱或群体书虱基因组DNA，以此为PCR模板，设计特异引物在普通PCR试剂盒的体系和程序下进行多重PCR反应，通过凝胶电泳检测，确定书虱种。该方法快速、高效，只需一个PCR反应，便可以鉴定6种书虱，同时准确性和稳定性高，无论是群体或单体书虱、雌性或雄性个体、若虫或成虫，同一地理种群或不同地理种群之间都能够得到可靠的结论；与酶切方法相比，简易而经济，该方法无需复杂的技术步骤和昂贵的试剂，一般的技术人员均可操作。

Description

一种基于多重PCR技术快速鉴定常见仓储书虱的方法

技术领域

本发明涉及植物保护和生物技术领域，具体涉及一种基于多重PCR技术快速鉴定6种常见仓储书虱的方法。

背景技术

书虱属于啮虫目（Psocoptera），书虱科（Liposcelididae），书虱属（Liposcelis），是啮虫目中最具经济意义的一个属。书虱属已知有120多个种，我国已报道23个种，但在世界范围内广泛发生为害的常见书虱主要包括嗜卷书虱（Liposcelis bostrychophila）、嗜虫书虱（L. entomophila）、小眼书虱（L. paeta）、无色书虱（L. decolor）、三色书虱（L. tricolor）以及云南书虱（L. yunnaniensis）等6个种。书虱不仅直接取食储藏物造成严重危害，而且能携带病原菌并造成食品污染，对世界粮食和食品安全造成了严重威胁。在我国，书虱对各种储粮保护剂的抗性发展相当迅速，目前已发展成为“双低（低氧、低药剂）”和“三低（低氧、低药剂、低温）”储粮中的害虫优势种群。特别在我国各主要检疫口岸，书虱是一类常被截获的有害生物。书虱因其体型微小（体长约 1 mm）、成若虫形态极其相似（若虫期的书虱更是难以区分），加之采用形态特征鉴定物种需较高的专业技术，对不同书虱种类进行正确的形态鉴定特别困难。相关部门也迫切需求能够对储粮书虱进行快速、方便鉴定的技术。因此，建立一种经济、高效、准确而快速的不同书虱种类的鉴定方法，对于采取有效的防治措施和检疫处理措施具有重要意义。

近年来，基于DNA分析的分子生物学技术在昆虫近缘种鉴定、种群遗传分析等领域得到广泛应用。其中线粒体细胞色素C 氧化酶亚基I（COI）基因和核糖体基因的转录内间隔区2（ITS2）是被公认的物种鉴定的基因条形码，被广泛应用于动植物的物种鉴定。已有的研究表明，COI基因对PCR反应扩增所要求DNA模板的质量要远远高于核糖体ITS2基因；COI基因在一些诸如书虱等昆虫的近缘物种中十分保守，其发挥的鉴定作用受到很大限制，而ITS2基因由于其进化速率较快，其序列长度及碱基组成在近缘物种中也有很大的差异，使其成为近缘物种鉴定的十分有效的分子标记而被广泛应用。

目前，对于常见仓储书虱种的鉴定主要依据其形态特征进行，而利用分子标记进行书虱种鉴定的报道仅见PCR-RFLP 技术一例，其分别利用5 种限制性内切酶对16S rDNA基因区域进行酶切，可以识别4种书虱。但该方法步骤繁琐且不够高效，同时只针对群体书虱提取基因组DNA，对单体书虱的鉴定未进行探讨。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于多重PCR技术快速鉴定常见仓储书虱的方法。本发明克服了现有技术的缺陷，采用STE法既可以提取单头书虱DNA，也可以提取群体书虱的基因组DNA，后续的实验证明两类DNA均可得到理想的鉴定效果。此外，本发明设计的6种书虱特异的ITS2引物可以进行多重PCR扩增，只需一个PCR反应，简单地判断产物大小便可鉴定6种书虱。在对6种书虱及其不同地理种群、雌雄个体间的ITS全序列进行克隆测序和序列分析的基础上，利用ITS2的碱基数在6种书虱种中具有稳定长度变化差异的特征，本发明申请人成功地在不同种书虱的ITS2上的非保守区域且兼顾PCR产物长度的差异，设计了6条特异引物，并分别命名为LipB（嗜卷书虱），LipE（嗜虫书虱），LipD（无色书虱），LipT（三色书虱），LipP（小眼书虱）及LipY（云南书虱）。由于ITS2位于5.8S rDNA和28S rDNA基因之间，而5.8S在不同种书虱中十分保守，本发明申请人设计了一条Lip5.8SF引物作为6种书虱通用的上游引物。通过多重聚合酶链式反应（PCR）技术体系及程序的建立便可以快速准确鉴定此6种书虱。

本发明的技术思路如下：

首先提取单体书虱或群体书虱基因组DNA，以此为PCR模板，将Lip5.8SF和LipB，LipE，LipD，LipT，LipP及LipY 7条引物混合作为PCR的引物，在普通PCR试剂盒的体系和程序下即可进行多重PCR反应，PCR结束后，将PCR产物在2% 的琼脂糖凝胶上进行电泳，通过与50 bp的小分子量DNA Marker进行比对判定PCR产物的大小并确定书虱种。

本发明依次通过以下步骤实现：

（1）采用STE法提取单体书虱或群体书虱的基因组DNA；

（2）以书虱基因组DNA为模板，设计如下7条引物混合作为PCR的引物，在普通PCR试剂盒的体系和程序下进行多重PCR扩增；

Lip5.8SF：5’-TGTGAACTGCAGGACACATGAACATC-3’

LipB：5’-AAACGTGACGCAGAAAACATCCGAG-3’

LipE：5’-ATGAAGAGTAGAGATAGAAACCGTTG-3’

LipD：5’-CGAGCTTAGCGATCATCGTTTCCG-3’

LipT：5’-CGTAACTTTCAATAACCGTAGACA-3’

LipP：5’-CTCGATCGACGTTCAAACACGCCTG-3’

LipY：5’-GTCTGTAGCTTTTACTTCGCTAACG-3’

（3）PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用50 bp DNA Marker （TaKaRa）作为参照，进行PCR产物大小的判断，确定书虱的种类：嗜卷书虱为300bp，嗜虫书虱为329 bp，小眼书虱为262bp，三色书虱为145bp，云南书虱为234bp，无色书虱为450bp。

附图说明

图1为6种书虱多重PCR电泳结果示意图：书虱种从左至右依次为嗜卷书虱、嗜虫书虱、小眼书虱、三色书虱、云南书虱及无色书虱。其中A图为单体书虱DNA扩增效果图， B图为群体书虱DNA扩增效果图。

本发明的优点是：

1．该方法采用多重PCR技术，快速、高效。只需一个PCR反应，便可以鉴定6种书虱；

2．准确性和稳定性高。设计的ITS2特异性下游引物，只有其遇到与之对应的书虱种的模板DNA时才能够与通用的上游引物发生配对并扩增出预定大小的目的条带。无论是群体或单体书虱、雌性或雄性个体、若虫或成虫，同一地理种群或不同地理种群之间都能够得到可靠的结论；

3．对模板DNA的质量要求不高，即使是严重降解的DNA也有很好的扩增效果；

4．本方法与酶切方法相比，简易而经济。该方法无需复杂的技术步骤和昂贵的试剂，一般的技术人员均可操作。

具体实施方式：

实施例1：采用STE法分别提取6种书虱的单体及群体基因组DNA

A．6种书虱的单体DNA提取：采用25 μL STE裂解液（100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）将6个已知种书虱的单体分别充分研磨，并分别加入0.3 μL的蛋白酶K（20 mg/mL）后在37℃下孵育40 min，孵育结束后立即将每一混合液在95℃条件下放置5 min以将蛋白酶K变性。变性后将混合液在1000 rpm的转速下离心1 min，上清液即为单头书虱的DNA模板，可置于-20℃长期保存。以上温度的控制均可在PCR仪中操作。

B．6种书虱群体基因组DNA提取：每一已知种的书虱取大约10 mg分别在液氮中充分研磨；每一管分别加入450 μL STE提取液（100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8.0, 50 μL 10% SDS和5 μL 蛋白酶K[20 mg/mL]）；轻轻混匀，56℃水浴过夜（12-16 h）；6管分别含有6种书虱基因组DNA的混合液可同时进行下列抽提核酸的步骤：加入等体积的Tris-饱和酚，轻柔颠倒5-10 min；4℃10,000 rpm离心10 min，取上清液；加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），轻柔颠倒5-10 min；4℃10,000 rpm离心10 min，取上清液；加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），缓慢颠倒5-10 min；4℃10,000 rpm离心10 min，取上清液；加入2倍体积的无水乙醇（-20℃预冷）和0.1倍体积的醋酸钠（3 M，pH 7.0），混匀，-20℃静置60 min以上；4℃10,000 rpm离心10 min，弃上清液；加入1 mL 70 %乙醇（-20℃预冷）洗涤DNA；4℃10,000 rpm离心10 min，弃上清液；自然风干，加入50 μL无菌双蒸水溶解DNA，-20℃保存DNA。

实施例2：PCR 体系及程序：进行2组PCR的扩增，其中一组以6种单体书虱DNA为模板，另一组以6种书虱的群体DNA为模板。一种书虱对应一个PCR反应，反应体系体积均为25 μL，具体加样顺序及用量如表1所示：

10×PCR buffer	2.5 μL	10×PCR buffer	2.5 μL
				Mg²⁺（25 mmol/μL）	2 μL	Mg²⁺（25 mmol/μL）	2 μL
dNTPs（10 mmol/μL）	2 μL	dNTPs（10 mmol/μL）	2 μL
				某一种书虱单体DNA	1 μL	某一种书虱群体DNA	1 μL
7条引物（10 pmol/μL）	各1 μL	7条引物（10 pmol/μL）	各1 μL
				ddH₂O	10.2 μL	ddH₂O	10.2 μL
Taq（5 U/μL, TaKaRa）	0.3 μL	Taq（5 U/μL, TaKaRa）	0.3 μL
				Total	25 μL	Total	25 μL

表1. 6种书虱多重PCR的体系

6种书虱分别为：嗜卷书虱、嗜虫书虱、无色书虱、三色书虱、小眼书虱和云南书虱；7条引物如前所述分别为Lip5.8SF，LipB，LipE，LipD，LipT，LipP及LipY；反应程序为94℃ 3 min，30 ×（94℃ 30 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min），72℃终延伸10 min。

实施例3：PCR 产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用50 bp DNA Marker （TaKaRa）作为参照。书虱种判断的标准是：嗜卷书虱为300bp，嗜虫书虱为329 bp，小眼书虱为262bp，三色书虱为145bp，云南书虱为234bp，无色书虱为450bp。

Claims

1.一种基于多重PCR技术快速鉴定6种常见仓储书虱：嗜卷书虱、嗜虫书虱、无色书虱、三色书虱、小眼书虱和云南书虱的方法，其特征在于，依次通过以下步骤实现：

(1)采用STE法提取单体书虱或群体书虱的基因组DNA；

(2)以书虱基因组DNA为模板，设计如下7条引物混合作为PCR的引物，在普通PCR试剂盒的体系和程序下进行多重PCR扩增；

Lip5.8SF：5’-TGTGAACTGCAGGACACATGAACATC-3’

LipB：5’-AAACGTGACGCAGAAAACATCCGAG-3’

LipE：5’-ATGAAGAGTAGAGATAGAAACCGTTG-3’

LipD：5’-CGAGCTTAGCGATCATCGTTTCCG-3’

LipT：5’-CGTAACTTTCAATAACCGTAGACA-3’

LipP：5’-CTCGATCGACGTTCAAACACGCCTG-3’

LipY：5’-GTCTGTAGCTTTTACTTCGCTAACG-3’

(3)PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用50bp DNA Marker作为参照，进行PCR产物大小的判断，确定书虱的种类：嗜卷书虱为300bp，嗜虫书虱为329bp，小眼书虱为262bp，三色书虱为145bp，云南书虱为234bp，无色书虱为450bp；

步骤(2)PCR体系及程序：反应体系体积均为25μL，具体加样顺序及用量如下表：

10×PCR buffer 2.5μL 10×PCR buffer 2.5μL Mg²⁺ 25mmol/μL 2μL Mg²⁺ 25mmol/μL 2μL dNTPs 10mmol/μL 2μL dNTPs 10mmol/μL 2μL 某一种书虱单体DNA 1μL 某一种书虱群体DNA 1μL 7条引物 10pmol/μL 各1μL 7条引物 10pmol/μL 各1μL ddH₂O 10.2μL ddH₂O 10.2μL Taq 5U/μL,TaKaRa 0.3μL Taq 5U/μL,TaKaRa 0.3μL Total 25μL Total 25μL

反应程序为94℃ 3min，30×94℃ 30s，58℃ 40s，72℃ 1min，72℃终延伸10min。