CN102234309B

CN102234309B - 一种c-端修饰为氟甲基酮的肽的制备方法

Info

Publication number: CN102234309B
Application number: CN 201010150563
Authority: CN
Inventors: 向双春; 李云平
Original assignee: ZHANGJIAGANG ALANING BIOCHEMICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: ZHANGJIAGANG ALANING BIOCHEMICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2010-04-20
Filing date: 2010-04-20
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2030-04-20
Also published as: CN102234309A

Abstract

本发明涉及一种C-端修饰为氟甲基酮的肽的制备方法。本方法将待修饰成氟甲基酮的保护氨基酸的α位氨基用3-亚甲基吲哚保护，然后在树脂上直接将羧基转化成甲基酮，从而避免了一般均相合成中易发生的一些副反应。本发明可以合成得到光学纯或外销旋C端修饰为氟甲基酮的肽，同时还可以用于肽链较长的C端修饰为氟甲基酮的肽的制备，所得粗产品Z-Tyr-Val-Asp-FMK的纯度较高。

Description

一种C-端修饰为氟甲基酮的肽的制备方法

技术领域

本发明涉及肽衍生物的制备方法，尤其涉及C-端修饰为氟甲基酮的肽的制备方法。

背景技术

许多疾病的治疗需要对疾病相关的细胞凋亡进行控制或加以改变。胱冬肽酶(Caspase)是一类天冬氨酸残基特异性的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起关键作用，它们对B细胞淋巴瘤/白血病家族成员具有重要的酶解修饰作用，目前已发现十余种成员，包括Caspase1～10等。研究表明，用胱冬肽酶抑制剂来缓减和控制细胞凋亡，从而可使某些疾病得到有效的治疗，例如：肿瘤细胞常呈凋亡不足，化疗和放疗可诱导肿瘤细胞进入凋亡，通过活化胱冬肽酶系统或活化死亡受体启动胱冬肽酶系统，可以进一步促进肿瘤细胞的凋亡；在治疗脑缺血时，可以用胱冬肽酶抑制剂来防止本不该发生的神经细胞的凋亡；新生儿窒息以及老年痴呆症等疾病也可以使用胱冬肽酶药物预防正常细胞的凋亡，从而达到治疗目的。因此，胱冬肽酶在治疗肿瘤、脑缺血及新生儿窒息、老年痴呆症等领域中具有广阔的应用前景。

国外胱冬肽酶抑制剂(Caspase inhibitor)的筛选和研究对象主要为C-端修饰醛肽(peptide aldehyde)、活性多肽片断、C-端修饰为氯甲基酮的(chloromethylketone)肽、C-端修饰为氟甲基酮的肽(fluoromethylketone)等，其中C端修饰为氟甲基酮的肽近年来被发展为胱冬肽酶抑制剂，是一类抗细胞衰老和凋亡的生化产品，当前主要被用于生化试剂盒、抗体、抑制剂、生物制药、生物工程等。

现有技术中，采用有机合成方法制备光学活性的或外消旋的C端修饰为氟甲基酮的肽，产率低，合成工艺很复杂，而且工艺不稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备C端修饰为氟甲基酮的肽的方法，工艺简单，产率高，而且工艺稳定。

本发明提供一种制备C端修饰为氟甲基酮的肽的方法，所述C端修饰为氟甲基酮的肽的结构如式6或式6-1，其中R是可变基团，A₁～A_n为各种构型的带有保护基的氨基酸残基，A′₁～A′_n为选择性脱保护后的各种构型的氨基酸残基，包括如下步骤：

(1)、采用偶联剂L将式1化合物与树脂连接，得到式2化合物，所述式1化合物中的R₁、R₂、R₃、R₄各自独立地选自H、Br、Cl、I、F、NO₂、CN、NH₂、烷基、烷氧基、COOH或OH；

(2)、将C端受保护的氨基酸与式2化合物进行还原胺化反应，得到式3化合物，式3化合物中的R₅为保护基；

(3)、采用常规的Fmoc固相合成方法，在式3化合物的氨基酸残基的N端进行延伸，得到式4化合物；

(4)、将式4化合物脱除保护基R₅，获得α羧基，然后将该α羧基转化成氟甲基酮基，获得式5化合物；

(5)、将式5化合物进行切割反应，获得产品为式6化合物，或在切割反应前、切割反应中或切割反应后，进行选择性脱保护，获得产品为式6-1化合物；

所述反应步骤(1)～(5)用结构式表示如下：

所述偶联剂L为如以下链状结构之一：

XCH₂(CH₂)n-COO-，

XCH₂(CH₂)n-CO-，

XCH₂(CH₂)n-NH-，

XCH₂(CH₂)n₁-NH-CO-(CH₂CH)m-COO-，

XCH₂(CH₂)n₁-NH-CO-(CH₂CH)m-CO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂CH₂-NH-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CO₂-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CH₂O-CO-(CH₂CH)m-COO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CH₂O-CO-(CH₂CH)m-CO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CO₂-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂CH₂-NH-CO-(CH₂CH)m-COO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂CH₂-NH-CO-(CH₂CH)m-CO-；

其中，X为F、Cl、Br或I，n＝1～20，n₁＝1～5000，m＝1～20。

上述方法中，所述C端受保护的氨基酸为L型或D型氨基酸或外消旋的各种氨基酸，其中保护基R5为甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苄基、5-羟基吡啶基、3-萘酚基或三苯甲基。

所述的步骤(1)中，树脂的取代度为0.2～1.5mmol/g，优选取代度为0.8mmol/g。

当本发明需制备的目的产品是光学活性的C端修饰为氟甲基酮的肽时，步骤(4)中所述的将该α羧基转化成氟甲基酮基的方法是：先采用重氮甲烷将α羧基转换为重氮甲基酮基，然后进行氟化反应，转化成氟甲基酮基，其中氟化剂是质量浓度为5％～80％的氟化氢/吡啶溶液；氟化温度为-10℃～30℃，最佳温度为-2℃～10℃。

其中氟化氢/吡啶溶液最佳质量浓度为20％～45％。

当本发明需制备的目的产品是外消旋的C端修饰为氟甲基酮的肽时，步骤(4)中所述的将该α羧基转化成氟甲基酮基的方法是：以三氟乙酸酐为氟化剂，将α羧基直接氟化成氟甲基酮基，三氟乙酸酐的摩尔总量与每克树脂的取代度之比为1～10∶1，氟化温度为-10℃～30℃。

所述三氟乙酸酐的摩尔总量与每克树脂的取代度之比优选为7∶1，氟化温度优选为-2℃～10℃。.

本发明关键反应是通过将待要修饰成氟甲基酮的保护氨基酸的α位氨基用3-亚甲基吲哚保护，然后在树脂上直接将羧基转化成甲基酮。从而避免了一般均相合成中易发生的一些副反应。本发明可以合成得到光学纯或外销旋C端修饰为氟甲基酮的肽，同时还可以用于肽链较长的C端修饰为氟甲基酮的肽的制备。本发明的另外一个优点是粗产品的纯度较高，Z-Tyr-Val-Asp-FMK甚至可达92％。

具体实施方式

实施例一光学活性的C-端修饰为氟甲基酮的肽Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-FMK的制备

按下步骤：

(1)、制备结构式如下式的3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂：

具体合成方法为：

①.3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸乙脂的制备：3-吲哚甲醛50g(即344mmol)、碳酸钾71.5g(517mmol)和偶联剂3-溴丙酸乙脂62ml(517mmol)混合于600ml DMF中，室温搅拌过夜，滤掉不溶物，滤液通过减压蒸馏浓缩到无DMF，得到胶状物。500ml水加入到胶状物中，剧烈搅拌产生白色固体。过滤，滤饼通过真空干燥，得到3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸乙脂75g，收率：94.2％。

②.3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸的制备：用3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸乙脂6g(23.06mmol)和氢氧化钾溶于50ml甲醇中，回流5小时。减压蒸干反应液，得到的残物用20ml2N的氯化氢/二氧六环溶解，加入100ml乙醚产生白色固体，过滤，滤液经减压蒸干，得到5.6g白色固体即为3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸，收率95.2％。

③.3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂的制备：将取代度为1.0mmol/g的AM树脂2g放入20ml干燥的DMF中浸泡10分钟，然后加入3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸2.17g(即100mmol)与树脂混合，依次加入HOBt(1.35g，100mmol)、1.74ml二异丙基乙胺和N，N′-二异丙基碳二亚胺(1.26g，100mmol)，该混合物在室温摇晃24小时；滤掉反应液，树脂分别用DMF、DCM洗，该树脂再用乙酸酐封住未反应的胺基，干燥后得到3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂3.32g，增重1.32g，取代度为：0.56。

上述①中采用的偶联剂还可以选择如下结构之一：

XCH₂(CH₂)n-COO-，

XCH₂(CH₂)n-CO-，

XCH₂(CH₂)n-NH-，

XCH₂(CH₂)n₁-NH-CO-(CH₂CH)m-COO-，

XCH₂(CH₂)n₁-NH-CO-(CH₂CH)m-CO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂CH₂-NH-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CO₂-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CH₂O-CO-(CH₂CH)m-COO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CH₂O-CO-(CH₂CH)m-CO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CO₂-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂-CO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂CH₂-NH-CO-(CH₂CH)m-COO-，

XCH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)n₁CH₂CH₂-NH-CO-(CH₂CH)m-CO-，

其中，X为F、Cl、Br或I，n＝1～20，n₁＝1～5000，m＝1～20。

树脂的取代度为0.2～1.5mmol/g，最好为0.8mmol/g。

(2)、将C端受保护的氨基酸H-Asp(OMe)-OTrt与3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂进行还原胺化反应，然后采用常规的Fmoc固相合成方法，在H-Asp(OMe)-OTrt的N端进行肽链延伸，得到Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-OTrt-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂，其结构式如下：

具体合成方法为：取代度为0.56mmol/g的3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂浸3g，泡于25ml1％AcOH/DMF中，10分钟后加入H-Asp(OMe)-Otrt0.72g(1.68mmol)，20分钟后逐批加入NaBH₄106mg(2.8mmol)，三小时后抽干反应液，所得树脂用DMF洗数次后直接用DIC/HOBt作为链接剂，通过Fmoc-固相合成法完成多肽的合成，得到Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-OTrt-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂。

(3)、将式Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-OTrt-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂脱除氨基酸残基Asp的保护基Trt，获得α羧基，用重氮甲烷将α羧基转换为重氮甲基酮基，然后进行氟化反应，转化成氟甲基酮基，获得Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-FMK-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂，其结构如下：

具体合成方法为：Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-OTrt-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂1g，用1％的TFA/DCM处理1小时，抽干反应液，该树脂用DMF洗数次，再用四氢呋喃洗数次，最后浸泡于10ml无水四氢呋喃。将257μl的NMM加入到上述树脂中，冷却到0℃，然后滴加3ml氯甲酸异丁脂的无水四氢呋喃溶液(其中氯甲酸异丁脂325μl，2.4mmol)，20分钟后加入9ml、0℃的0.5mol/升的重氮甲烷/乙醚溶液。1小时后加入4ml、70％的氟化氢/吡啶溶液，0℃反应1小时，然后室温反应过夜。抽干反应液，该树脂分别用四氢呋喃和二氯甲烷洗数次，干燥后，得到Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-FMK-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂1.03g.

其中，氟化氢/吡啶溶液的质量浓度可以为5％～80％的，最佳质量浓度为20％到45％；氟化温度为-10℃～30℃，最佳温度为-2℃～10℃。

(4)、将Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-FMK-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂脱进行切割反应，获得光学活性的C-端修饰为氟甲基酮的肽Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-FMK。

具体操作方法如下：取1g Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-FMK-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂，用切割液(成分为：95％三氟乙酸，1％甲基苯基硫醚，2％苯酚，2％水)切割1小时，得到切割混合液用石油醚沉淀得到光学活性的C端修饰为氟甲基酮的肽Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-FMK，的粗产品145mg，粗品纯度87％。该粗品经制备色谱纯化，得到纯品113mg，总收率：32.5％。；Ms：6696[100％，M+1]；HPLC纯度：98.8％。

实施例二外消旋的C端修饰为氟甲基酮的肽Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-dl-Asp(OMe)-FMK的制备

按下步骤：

(1)、同实施例一的步骤(1)制得3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂。

(2)、同实施例一的步骤(2)制得Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-OTrt-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂。

(3)、将式Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-OTrt-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂脱除氨基酸残基Asp的保护基Trt，获得α羧基，然后将该α羧基以三氟乙酸酐为氟化剂直接转化成氟甲基酮基，获得Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-dl-Asp(OMe)-FMK-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂，其结构如下

具体操作如下：1g Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-Asp(OMe)-OTrt-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂用1％的TFA/DCM处理1小时，抽干反应液，该树脂用DMF洗数次，再用四氢呋喃洗数次，最后浸泡于10ml无水四氢呋喃。三氟乙酸酐574mg(4.15mmol)加入到上述树脂中，冷却到0℃，然后加入三乙胺583μl(4.15mmol)和DMAP16.9mg(0.14mmol)。0℃反应1小时，然后室温反应过夜。抽干反应液，该树脂分别用四氢呋喃和二氯甲烷洗数次，干燥后，得到树脂1.01g。

其中，氟化剂三氟乙酸酐用量如下：三氟乙酸酐摩尔总量与每克树脂的取代度之比为1～10∶1，最优比为7∶1。氟化温度为-10℃～30℃，最优氟化温度为-2℃到10℃。

(4)、将Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-dl-Asp(OMe)-FMK-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂进行切割反应，获得Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-dl-Asp(OMe)-FMK。

具体操作如下：1g Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-dl-Asp(OMe)-FMK-3-(3-醛基-1H-吲哚-1-基)丙酸-AM树脂用切割液(含有如下组分：95％三氟乙酸，1％甲基苯基硫醚，2％苯酚，2％水)切割1小时，得到切割混合液，用石油醚沉淀得到外消旋的C端修饰为氟甲基酮的肽，即Z-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-dl-Asp(OMe)-FMK的粗产品123mg，粗品纯度77％。该粗品经制备色谱纯化，得到纯品74mg，总收率：29.5％。Ms：669.6[100％，M+1]；HPLC纯度：96.3％。

本文中涉及的“％”均为质量浓度。

本文涉及的化学基团代号与基团名称一一对应列于下表：

AM	胺甲基
		DMF	N，N′-二甲基甲酰胺
HOBt	1-羟基苯并三唑
		DCM	二氯甲烷
Z(CBz)	苄氧羰基
		AcOH	乙酸
NMM	N-甲基吗啡啉
		Trt	三苯甲基
FMK	氟甲基酮
		DMAP	4-二甲氨基吡啶
Me	甲基
		NaBH₄	硼氢化钠
TFA	三氟乙酸
		DIC	N，N′-二异丙基碳二亚胺

Claims

1.一种制备C端修饰为氟甲基酮的肽的方法，所述C端修饰为氟甲基酮的肽的结构如式6或式6-1，其中R是可变基团，A₁～A_n为各种构型的带有保护基的氨基酸残基，A′₁～A′_n为选择性脱保护后的各种构型的氨基酸残基，包括如下步骤：

(1)、采用偶联剂L将式1化合物与树脂连接，得到式2化合物，所述式1化合物中的R₁、R₂、R₃、R₄均为H，所述偶联剂L为3-溴丙酸乙酯；

(2)、将C端受保护的氨基酸与式2化合物进行还原胺化反应，得到式3化合物；.

(3)、采用常规的Fmoc固相合成方法，在式3化合物的氨基酸残基的N端进行肽链延伸，得到式4化合物；

具体方法是：取式4化合物1g，用1％的三氟乙酸/二氯甲烷处理1小时，抽干反应液，该树脂用N，N′-二甲基甲酰胺洗数次，再用四氢呋喃洗数次，最后浸泡于10ml无水四氢呋喃；然后采用步骤A或步骤B；

步骤A如下：

加入257μl N-甲基吗啡啉，冷却到0℃，然后滴加3ml氯甲酸异丁脂的无水四氢呋喃溶液，其中氯甲酸异丁脂2.4mmol；20分钟后加入9ml、0℃的0.5mol/升的重氮甲烷/乙醚溶液；1小时后加入4ml、70％的氟化氢/吡啶溶液，0℃反应1小时，然后室温反应过夜；抽干反应液，别用四氢呋喃和二氯甲烷洗数次，干燥后即得式5化合物；

步骤B如下：

加入三氟乙酸酐574mg，冷却到0℃，然后加入三乙胺583μl和4-二甲氨基吡啶16.9mg，0℃反应1小时，然后室温反应过夜；抽干反应液，分别用四氢呋喃和二氯甲烷洗数次，干燥后，得到式5化合物；

所述反应步骤(1)～(5)用结构式表示如下：

。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述树脂的取代度为0.2～1.5mmol/g。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述树脂的取代度为0.8mmol/g。