CN102232358B - 葡萄离体茎段的脱毒方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种葡萄离体茎段的脱毒方法，包括如下步骤：1)选择继代培养至茎半木质化的葡萄品种或相关砧木的试管苗，无菌条件下剪取单芽茎段接种在培养基中，置于22-28℃、2000-3000lx培养室培养至刚刚露出小白根，得到葡萄离体茎段；2)将葡萄离体茎段置于35-40℃的培养箱中，暗处理并同时进行热处理；3)热处理10d后开始观察侧芽生长情况，当黄化嫩梢长至6-10cm，在无菌条件下肉眼剥取0.2-0.8mm左右的微茎尖，置于培养基中培养，直至得到繁殖材料。本发明既不要求光照，也不要求频繁变温处理，操作简单、省时、省电、省工，效率高、成本低，对研究环境及条件设施要求不十分严格，只要具备组培条件的研究及教学单位均可应用。

Description

葡萄离体茎段的脱毒方法
技术领域
本发明涉及果树生物技术领域，具体的说，涉及一种葡萄离体茎段的脱毒技术。
背景技术
目前国内已报道葡萄病毒病主要有9种：扇叶病、卷叶病、茎痘病、栓皮病、斑点病、脉坏死病、耳突病、星状花叶病和缩叶病。其中，扇叶病与卷叶病是我国葡萄生产中分布最广、危害最严重的病毒病种类。据调查，目前我国葡萄栽培区域内，85％以上的葡萄园普遍发病，给葡萄生产带来了极大的损失。郭德银等采用间接ELISA法，随机检测了35个葡萄品种，带扇叶病毒率高达74.3％。何水涛等对国家葡萄种质资源圃(郑州)内39个品种共78株葡萄进行了PAS-ELISA检测，带毒率为76.9％。
鉴于繁殖材料带病毒是葡萄病毒病的主要传播途径，因此，对葡萄繁殖材料进行病毒脱除，建立无病毒的葡萄原原种圃、母本园和苗圃等无病毒苗木的生产体系，以保证栽植材料健康无毒，是防治葡萄病毒病的关键。
据报道，目前用于脱毒最有效的方法是“热处理并结合茎尖培养”。尚志华将转接后20天的组培苗置于光照1000-2500Lx的培养箱内，起始温度设为34℃，以后每天升高1℃，直到37℃(白天37℃，夜间25℃)，热处理40-60d后，剥取0.5mm的茎尖，经检测的脱除率可达62.5％；张金文等用此方法对7个葡萄品种进行病毒脱除，将试管苗置于35-37℃温度下热处理45-60d，结果发现葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱毒率高达92％。
根据目前的报道，对葡萄栽植材料的脱毒虽然取得了很好的进展，但仍存在许多问题，主要为：(1)用于脱毒的试管苗材料不耐热，脱毒过程中植株死亡，获得的微茎尖数量少；(2)需要将温度逐渐升高或昼夜变化，并同时控制湿度和光照，对研究环境及条件设施要求严格，通用性差；(3)程序繁杂，脱毒需要的时间长，因此培育葡萄无病毒苗木的周期也相对较长；(4)从试管材料的准备、生根到茎尖培养需要不同的培养基；(4)前人发表的一些文章虽然获得了较高的脱毒率，但并未与脱毒前材料的带毒情况作比较，因此其较高的脱毒率也有待进一步实验。
针对这些问题，我们借助前人的经验开展了进一步的研究，旨在创建一种脱毒率高、操作方便简单、通用性强的高效脱毒技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄离体茎段的脱毒方法。此方法既不要求光照，也不要求频繁变温处理，操作简单、省时、省电、省工，效率高、成本低，对研究环境及条件设施要求不十分严格，只要具备组培条件的研究及教学单位均可应用。
本发明所述的葡萄离体茎段的脱毒方法，包括如下步骤：
1)选择继代培养至茎半木质化的葡萄品种或相关砧木的试管苗，无菌条件下剪取单芽茎段接种在培养基中，置于22-28℃、2000-3000lx培养室培养至刚露出小白根，得到葡萄离体茎段；
2)将葡萄离体茎段置于35-40℃的培养箱中，暗处理并同时进行热处理；
3)热处理10d后开始观察侧芽生长情况，当黄化嫩梢长至6-10cm，在无菌条件下剥取0.2-0.8mm左右的微茎尖，置于培养基中培养，直至得到繁殖材料。
其中，本发明的方法中，步骤1)和3)都采用同一种培养基，所述培养基是添加了0.1-0.5mg/L IAA，15-30mg/L蔗糖，以及4.5-7.0mg/L琼脂或明胶，pH为5.8的改良B5培养基。
优选的，所述培养基是添加了0.2mg/L IAA，20mg/L蔗糖，5.0mg/L琼脂或明胶，pH为5.8的改良B5培养基。其中，IAA是吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid)的简称，生物学名称为生长素，是一种植物激素。
其中，所述蔗糖可选用白砂糖、绵白糖等本领域常用蔗糖中的一种或多种。
改良B5培养基的配方包括下表的各组分：
  成分   使用浓度(mg/L)
  大量元素   硝酸钾KNO3   1250
  MgSO4·7H2O   125
  NaH2PO4·H2O   85.4
  CaCl2   113.2
  (NH4)2SO4   67
  微量元素   KI   0.375
  H3BO4   1.5
  MnSO4·4H2O   5
  ZnSO4·7H2O   1.0
  Na2MoO4·2H2O   0.125
  CoCl2·6H2O   0.0125
  CuSO4·5H2O   0.0125
  铁盐   Na2-EDTA   37.3
  FeSO4·7H2O   27.8
  有机成分   肌醇   25
  烟酸   1.0
  盐酸吡哆醇   1.0
  盐酸硫铵   10
一般，所述改良的B5培养基的配置方法是将适量的属于大量元素的各组分、属于微量元素组的各组分、属于铁盐的各组分以及属于有机成分的各组分分别溶于水中，配置成溶液，待用；使用前，按上述浓度将各溶液混合成改良的B5培养基。
优选的，所述步骤1)是置于23-27℃、2000-2500lx的培养室中培养；优选置于27℃、2000lx的培养室中培养。步骤1)中在培养室中的培养时间为5-10d，优选7d；实验证明，培养7d左右刚刚露出根原基、侧芽尚未萌发的半木质化茎段的材料对温度适应能力强，培养箱温度可直接调到较高温度，如38℃左右进行热处理，效果较好，腋芽萌发出的黄化嫩梢不会因突然高温而死掉，存活率高，处理一次即可获得一批茎尖；
所述步骤2)是置于37-39℃的培养箱进行热处理；优选置于38℃的培养箱进行热处理。
步骤2)中，所述暗处理可如下进行：将葡萄离体茎段置于有盖箱中，然后置于培养箱中，进行处理；其中所述有盖箱优选泡沫箱；因为泡沫箱一方面可以防止培养瓶内水分散失，另一方面又可形成黑暗处理，使侧芽快速萌发并生长；
另外，步骤3)中，优选当黄化嫩梢长至8-9cm时，然后在无菌条件下剥取0.5mm的微茎尖。
本发明所述的脱毒方法可用于各种葡萄品种及砧木，如巨峰，红地球，夏黑，砧木5A，砧木5BB，砧木8B等，适用品种及材料种类范围极广。
与现有技术相比，本发明的关键点主要在于：
1)采用培养7d左右刚刚露出根原基、侧芽尚未萌发的半木质化茎段效果较好，腋芽萌发出的黄化嫩梢不会因突然高温而死掉，存活率高，处理1次便可获得一批茎尖；
2)此类材料对温度适应能力强，培养箱温度直接调到38℃；
3)试管材料放于泡沫箱，既防止玻璃瓶内水分散失，又可形成黑暗处理，侧芽可快速萌发并生长；
4)用于继代、生根及微茎尖生长的培养基均为一种，成份简单，通用性强；
5)此方法既不要求光照，也不要求频繁变温处理，操作简单、省时、省电、省工，效率高、成本低，对研究环境及条件设施要求不十分严格，只要具备组培条件的研究及教学单位均可应用。
本发明综合以上因素建立了一种利用半木质化茎段快速，高效脱除葡萄病毒的方法，并在实践中，将此方法在3个葡萄品种(巨峰，红地球，夏黑)及3个葡萄砧木(5A，5BB，8B)上应用，结果证明，6个材料葡萄扇叶病毒与卷叶病毒两种病毒同时脱掉的脱毒率均达64.23％以上，最高可达95.1％。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
对照例1
尚志华将转接后20天的葡萄组培苗置于光照1000-2500Lx的培养箱内，起始温度设为34℃，以后每天升高1℃，直到37℃(白天37℃，夜间25℃)，热处理40-60d后，剥取0.5mm的茎尖，经检测的葡萄扇叶病毒脱除率可达62.5％(见尚志华，葡萄扇叶病毒脱除与检测技术研究2006，南京农业大学硕士学位论文)。
实施例1
选择继代培养60d，生长健壮的葡萄品种巨峰的试管苗(带毒率均为100％)，在无菌条件下剪取半木质化的单芽茎段接种在改良B5+0.2mg/L IAA+20mg/L白砂糖+5.0mg/L琼脂，pH5.8的培养基中，置于27℃、2000lx培养室培养7d，露出小白根后放于泡沫箱，盖好盖，放入培养箱中。10d后黄化嫩梢长至100ml三角瓶瓶口(约8-9cm)，在无菌条件下剥取0.5mm的微茎尖培养在改良B5+0.2mg/L IAA+20mg/L白砂糖+5.0mg/L琼脂，pH5.8的培养基中，至于27℃、2000lx培养室培养。
茎尖形成试管苗后，利用酶联免疫双抗体夹心法进行病毒检测，结果，葡萄扇叶病毒与卷叶病毒两种病毒同时脱掉的脱毒率为95.1％。
实施例2
选择继代培养57d，生长健壮的葡萄品种红地球的试管苗，在无菌条件下剪取单芽茎段接种在改良B5+0.5mg/L IAA+30mg/L白砂糖+8mg/L琼脂，pH5.8的培养基中，置于25℃、2500lx培养室培养9d，露出小白根后放于泡沫箱，盖好盖，放入培养箱中。12d后黄化嫩梢长6-8cm，在无菌条件下剥取0.4-0.7mm的微茎尖培养在改良B5+0.24mg/L IAA+25mg/L白砂糖+7.0mg/L琼脂，pH5.8的培养基中，至于25℃、2500lx培养室培养。
茎尖形成试管苗后，进行病毒检测，结果，葡萄扇叶病毒与卷叶病毒两种病毒同时脱掉的脱毒率为78.8％。
实施例3
选择继代培养60d，生长健壮的葡萄砧木5BB的试管苗(带毒率均为100％)，在无菌条件下剪取单芽茎段接种在改良B5+0.2mg/LIAA+20mg/L白砂糖+5.0mg/L琼脂，pH5.8的培养基中，置于27℃、2000lx培养室培养7d，露出小白根后放于泡沫箱，盖好盖，放入培养箱中。15d后黄化嫩梢长至8-9cm，在无菌条件下剥取0.5mm的微茎尖培养在改良B5+0.2mg/L IAA+20mg/L白砂糖+5.0mg/L琼脂，pH5.8的培养基中，至于27℃、2000lx培养室培养。
茎尖形成试管苗后，经病毒检测，葡萄扇叶病毒与卷叶病毒两种病毒同时脱掉的脱毒率为92.8％。
实施例4
选择继代培养65d，生长健壮的葡萄砧木5A的试管苗(带毒率均为100％)，在无菌条件下剪取单芽茎段接种在改良B5+0.1mg/LIAA+18mg/L白砂糖+3.5mg/L琼脂，pH5.8的培养基中，置于27℃、2000lx培养室培养10d，露出小白根后放于泡沫箱，盖好盖，放入培养箱中。13d后黄化嫩梢长至8-9cm，在无菌条件下剥取约0.5mm(0.4-0.6mm)的微茎尖培养在改良B5+0.21mg/L IAA+20mg/L白砂糖+4.5mg/L琼脂，pH5.8的培养基中，至于27℃、2000lx培养室培养。
茎尖形成试管苗后，经病毒检测，葡萄扇叶病毒与卷叶病毒两种病毒同时脱掉的脱毒率为75.3％。

Claims (12)

1.一种葡萄离体茎段的脱毒方法，包括如下步骤：
1)选择继代培养至茎半木质化的葡萄品种或相关砧木的试管苗，无菌条件下剪取单芽茎段接种在添加了0.1-0.5 mg/L IAA，15-30mg/L蔗糖，以及4.5-7.0mg/L琼脂或明胶，pH为5.8的改良B5培养基中，置于22-28℃、2000-3000lx培养室培养至刚露出小白根，得到葡萄离体茎段；其中，所述改良B5培养基包括以下组分：
Figure FDA00001737481900011
2)将葡萄离体茎段置于35-40℃的培养箱中，暗处理并同时进行热处理；暗处理如下进行：将葡萄离体茎段置于有盖箱中，然后置于培养箱中，进行处理；
3)热处理10d后开始观察侧芽生长情况，当黄化嫩梢长至6-10cm，在无菌条件下剥取0.2-0.8mm的微茎尖，置于培养基中培养，直至得到繁殖材料。
2.如权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于，所述培养基是添加了0.2 mg/L IAA，20 mg/L蔗糖，5.0 mg/L琼脂或明胶，pH为5.8的改良B5培养基。
3.如权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤1)是置于23-27℃、2000-2500lx的培养室中培养。
4.如权利要求3所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤1)是置于27℃、2000lx的培养室中培养。
5.如权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤1)中在培养室中的培养时间为5-10d。
6.如权利要求5所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤1)中在培养室中的培养时间为7d。
7.如权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤2)是置于37-39℃的培养箱进行热处理。
8.如权利要求7所述的脱毒方法，其特征在于，所述步骤2)是置于38℃的培养箱进行热处理。
9.如权利要求1所述的脱毒方法，其特征在于，步骤3)中，当黄化嫩梢长至8-9cm，在无菌条件下剥取0.5mm的微茎尖。
10.如权利要求1-9任一项所述的脱毒方法的应用，其特征在于，用于葡萄品种及相关砧木的脱毒。
11.一种用于葡萄离体茎段脱毒的培养基，其特征在于，所述培养基是添加了0.1-0.5 mg/L IAA，15-30mg/L蔗糖，以及4.5-7.0mg/L琼脂或明胶，pH为5.8的改良B5培养基；其中，所述改良B5培养基包括以下组分：
Figure FDA00001737481900021
12.如权利要求11所述的一种用于葡萄离体茎段脱毒的培养基，其特征在于，所述培养基是添加了0.2 mg/L IAA、20 mg/L蔗糖，以及5.0 mg/L琼脂，pH为5.8的改良B5培养基。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102835316A (zh) * 2012-09-26 2012-12-26 中法合营王朝葡萄酿酒有限公司 一种蛇龙珠葡萄品种葡萄病毒病的脱除与苗木快繁方法
CN103109744B (zh) * 2013-03-10 2014-05-14 通化师范学院 一种葡萄试管内集成脱毒方法
CN109348882A (zh) * 2018-10-09 2019-02-19 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 一种牛油果砧木无性繁殖方法
CN112438200A (zh) * 2019-08-28 2021-03-05 中国农业大学 一种鲜食葡萄的组织快繁方法
CN115500166A (zh) * 2022-10-19 2022-12-23 华中农业大学 84k银腺杨内生菌快速脱毒方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1252216A (zh) * 1998-10-23 2000-05-10 中国科学院遗传研究所 一种葡萄试管苗繁殖方法及所使用的培养基
CN1255283A (zh) * 1998-11-29 2000-06-07 陈方 一种培育脱病毒良种苗木的方法
CN101418350A (zh) * 2008-10-28 2009-04-29 南京农业大学 利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1252216A (zh) * 1998-10-23 2000-05-10 中国科学院遗传研究所 一种葡萄试管苗繁殖方法及所使用的培养基
CN1255283A (zh) * 1998-11-29 2000-06-07 陈方 一种培育脱病毒良种苗木的方法
CN101418350A (zh) * 2008-10-28 2009-04-29 南京农业大学 利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱波."脱毒山葡萄工厂化快繁技术体系及微型嫁接技术的研究".《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》.2006,(第4期),摘要.
陈耕云."广西罗城毛葡萄组织培养脱毒技术研究".《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》.2007,(第6期),摘要.
顾沛雯."葡萄卷叶病毒的脱毒技术研究".《西北农林科技大学学报( 自然科学版)》.2008,第36卷(第5期),第85-91页.

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