CN1252216A

CN1252216A - 一种葡萄试管苗繁殖方法及所使用的培养基

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Publication number: CN1252216A
Application number: CN 98123536
Authority: CN
Inventors: 朱有光; 林建兴; 张性坦; 赵存; 柏惠侠; 李诺
Original assignee: Institute of Genetics of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2000-05-10
Anticipated expiration: 2018-10-23
Also published as: CN1138468C

Abstract

本发明提供了一种葡萄试管苗繁殖方法及所使用的继代培养基和光自养培养基。所述的继代培养基是在基础培养基中按常规量加入有机附加物——肌醇,盐酸硫胺素,烟酸,盐酸吡哆醇,琼脂后再加入生长素类物质和2%～3%的蔗糖。所述的光自养培养基是在基础培养基中仅将琼脂含量提高到0.8%或0.8%以上,pH值调整至6.0。利用本发明的方法可缩短繁殖周期,提高繁殖率,降低成本。

Description

一种葡萄试管苗繁殖方法及所使用的培养基

本发明涉及利用组织培养繁殖葡萄试管苗的方法以及所使用的培养基。

葡萄是世界上栽培面积和总产量都占第一位的果树。除用常规方法进行繁殖、育种和脱毒外，八十年代以来许多研究者开展了生物工程技术的研究，以加快葡萄育种和繁殖。

M.Barlass等(M.Barlass etc.，Ann.Appl.Biol.1982，101：291～295)通过葡萄茎尖碎片培养，证明了再生植株脱除了嫁接传播的卷叶、黄斑和斑点病毒。茎尖培养与热处理相结合，也可获得无扇叶病毒的葡萄。

R.Chee和R.M.Pool(R.Chee and R.M.Pool，Scientia Horticulturae，16(1982)：17～27)尝试了通过组织培养快速繁殖葡萄，他们以葡萄品种“罗金安”(Rougeon)茎尖为材料，在含有NAA和BA的MS固体培养基上培养，在每日10小时光照下得到具有2～4个叶原基的茎。原始外植体继代培养可产生茎丛，出现了茎增殖的潜力。切下的茎丛(1.5cm长)继代培养在含5μM BA和0.5μM NAA的培养基上，45天中在硬的愈伤组织顶部产生10～30个密生的茎丛。

茎尖转入生根培养基后30～40天，产生的小植株栽入灭过菌的装有泥炭的花盆中，放在生长箱内保持100％相对湿度。每天光照16小时，暗中温度27℃，光下31℃。当茎高达到4cm，具有4～6片展开的小叶时，把生长箱内的相对湿度降至60％进行锻炼。然后栽入大花盆中并移入生长室内。总共产生24个小植株，全部移栽，其中6株死亡，成活率为75％。

上述实验中虽然可以从一块愈伤组织产生10～30个茎，但是R.chee等总共只获得24株再生植株，说明实际成苗率并不高。并且，该实验在严格控制光照、温度和湿度的情况下试管苗移栽成活率也只有75％，显然不适合大规模工厂化生产的需要。

A.Bouquet(A.Bouquet，Colloque multiplication de la vigne.1982.Bordeaux.)在前人工作的基础上把葡萄离体繁殖技术概括为微型扦插和微型繁殖两种途径。

在微型扦插中，外植体在不含任何植物激素的培养基上长成具有根系和茎叶的植株。再把这些小植株每株切成约10段接种在新的培养基上，重新长出完整的植株，如此无限循环，大约两个月转接一次。每个外植体的年增殖率的理论值约为1.0×10⁶。本方法的缺点是两个月转接一次，周期太长，繁殖系数偏低。作者没有提到具体使用哪一种培养基，也没说明植株移栽成活率有多少，因此无法计算出一年内可获得多少移栽成活的植株。

在微型繁殖中，培养基加入细胞激动素，一般用量为2mg/L。将外植体接种在培养基后，腋芽萌发，叶片生长，很快就形成一堆丛生芽。切取带叶的小芽接种在相同的培养基上，就可以无限循环地繁殖。每2～3周转接一次。微型繁殖每次移植的增殖率为8～10倍。这一方法的理论效率比微型扦插高。但是存在着某种难以克服的技术困难。因此，A.Bouquet断言“尽管葡萄微型繁殖有一个可观的繁殖系数，但在短期和较长时间内似乎还不可能成功地应用于商品化生产”。正如A.Bouquet所预言的那样，由于茎丛形成的再生植株较弱，移栽成活率低，实际繁殖系数并不高，现在几乎没有人用这一方法进行葡萄试管苗快速繁殖。

无论是用于何种目的，葡萄组织培养最终都要获得再生植株。因此，再生植株的移栽成活率对实验的成败起着决定性作用。尤其是对脱病毒试管苗或优良品种进行离体快速繁殖更需要有较高的移栽成活率，尽可能提高繁殖系数，降低生产成本。

一般都是通过严格控制环境的温度和湿度来提高葡萄试管苗的移栽成活率，而忽视了试管苗自身的生理状态，使移栽成活率低且不稳定。如上述R.Chee和R.M.Pool的实验，即使在严格控制光照、温度和湿度的条件下，移栽成活率也只有75％。在大规模葡萄试管苗工厂化生产中，湿度和温度很难控制。而且控制温度和湿度需要昂贵的设备，这就必然提高试管苗的生产成本。如何在不太严格的环境条件下提高葡萄试管苗的移栽成活率是一个亟待解决的问题。

本发明的一个目的是针对现有技术的缺点和局限性，提供一种利用组织培养繁殖葡萄试管苗的方法，提高试管苗对移栽后的环境条件的适应能力，进而提高移栽成活率，降低培养成本。

本发明的另一个目的是提供一种用于繁殖葡萄试管苗的方法的继代培养基。

本发明的再一个目的是提供一种用于繁殖葡萄试管苗的方法的光自养培养基。

除非特别说明，本发明所用的百分比均为重量百分比。

本发明采用GS(继代培养基)和GP(光自养培养基)对培养基的基本无机盐成分无特殊要求，但培养基的碳源、有机附加物、激素浓度和琼脂以及pH值都做了相应的调整。MS、B₅或怀特等培养基以及在这些培养基的基础上发展起来的其它培养基均可用作无机盐基础培养基。无机盐基础培养基只含有无机盐，不含有有机附加物的培养基。以1/2B₅(B₅培养基的大量元素减半)培养基为最佳。

GS培养基是在无机盐基础培养基中按常规量加入有机附加物——肌醇，盐酸硫胺素，烟酸，盐酸吡哆醇，琼脂后再加入0.05～0.1mg/L的植物生长素(也可使用其它生长素类物质，但浓度要作相应的变化)，用于试管苗的增殖。当植物生长素浓度低于0.05mg/L时，茎的形成和生长较慢，高于0.1mg/L时则在外植体的基部形成较多的愈伤组织，均不利于试管苗的快速增殖。此外，GS培养基还必须加入2％～3％的蔗糖。蔗糖含量低于2％时，长期继代培养会出现较多的玻璃苗，高于3％时不仅外植体生长速度减慢，而且增加了试管苗的生产成本。最好使用2％的蔗糖。pH值为5.6左右

GP培养基(光自养培养基)就是使葡萄试管苗在离体培养阶段在饥饿胁迫下进行光自养生长的培养基。GP培养基不含碳源。仅加入生长素类物质，如0.05-0.1mg/L的植物生长素，和琼脂，其它有机附加物基本上完全除去，但保留2mg/L的盐酸硫胺素效果更好。琼脂含量提高到0.75％以上，pH值为6.0左右。在试管苗移栽前转入光自养培养基培养。通过光自养培养，可以改善试管苗的生理状态，使之具有较强的适应性。此外，光自养培养基由于缺少微生物生长所必需的碳源和其它有机物，不利于微生物的生长。可以在培养基不污染的情况下延长练苗时间，使练苗时间长达7～10天而不污染。其它任何培养基在有菌情况下练苗3～5天培养基就会污染，练苗5天以上培养基严重污染，致使试管苗死亡。葡萄试管苗在移栽前必须打开瓶口练苗，否则不能移栽成活。在培养基不污染的情况下，练苗时间越长，试管苗的移栽成活率也就越高。

来自光自养培养基的葡萄试管苗本身的适应能力比较强，再经过7～10天练苗，大批量繁殖的移栽成活率稳定在90％以上。

GP培养基不适于长期继代培养。在GP培养基上形成的再生植株必须移栽或重新转入GS培养基上继代培养。

本发明提供一种利用光自养培养快速繁殖葡萄试管苗的方法，包括以下步骤：

a.将试管苗在继代培养基上继代培养，扩大繁殖；

b.当试管苗长出3～5个叶片时，把茎切成小段，每节一段，带一个叶片，转到继代培养基上继代培养，每天光照10～16小时，温度20～28℃；

c.当试管苗繁殖到一定数目时转到光自养培养基培养，方法同步骤2，每天光照14小时以上，光照度最好为1200～2000lux，试管苗长出3～5片叶和健壮的根后，打开瓶口在室内自然光照下练苗6天以上，最好7～10天；

d.取出练苗后的试管苗进行移栽，在湿润条件下生长3～5天，之后在自然条件下生长。本步骤中的移植最好是将试管苗移植在砂子，蛭石，草炭土或其它透气性良好的材料中。湿润条件可以是通过覆盖塑料薄膜来实现。

本方法的成苗率和植株移栽成活率均可达90％以上。如以每个试管苗平均切成3.5个茎段外植体，每月继代一次计算，一年内从1个原始的试管苗可以繁殖出3.5¹²×90％＝3.04×10⁶株葡萄试管苗。以90％的成活率计算，一年内可获得3.04×10⁶×90％＝2.73×10⁶棵成活植株。这样的繁殖系数完全适合大规模工厂化生产的需要。

本发明较现有技术有以下优点：

1.试管苗的继代繁殖周期从A.Bouquet文中微型扦插的2个月缩短为4个星期，提高了繁殖系数。

2.突破了现有技术只通过控制环境的温度和湿度来提高试管苗移栽成活率的局限性。使用了光自养培养法和与之相适应的培养基。通过改变培养基的成分来提高试管苗的适应能力，控制练苗时培养基的污染，延长练苗时间，使大批量繁中试管苗的移栽成活率达90％以上。R.Chee等在少量试管苗移栽试验中，在严格控制温度、湿度和光照的情况下，移栽成活率也只有75％。

实施例一：

(一)试验材料：先锋葡萄品种的试管苗。这些试管苗已继代多次，具有稳定的再生能力。

(二)培养基：

1.培养基的基本成分(mg/L)：

大量元素：KNO₃1250，(NH4)SO₄67，NaH₂PO₄·H₂O75，MgSO₄·7H₂O125，CaCl₂·2H₂O75。

微量元素：KI0.75，H₃BO₃3.0，MnSO₄·H₂O10，ZnSO₄·7H₂O2.0，Na₂M₀O₄·2H₂O0.25，CuSO₄·5H₂O0.025，CoCl₂·6H₂O0.025，Na₂·EDTA37.3，FeSO₄·7H₂O27.8。

2.继代培养基(GS)：基本培养基附加肌醇25mg/L，盐酸硫胺素10mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，植物生长素0.05mg/L，蔗糖20000mg/L，琼脂5000mg/L。pH调至5.6。

3.光自养培养基(GP)：

基本培养基附加盐酸硫胺素2.0mg/L，植物生长素0.05mg/L，琼脂8000mg/L。pH调至6.0。

(三)方法与结果：

1. 试管苗的继代培养与增殖

每个100ml的三角瓶装GS培养基30ml。共25瓶培养基用常规方法高压灭菌。把长出3～5个叶的试管苗每节切成一段，每段带一个叶片。把茎段外植体的形态学下端插入GS培养基，每瓶接种3个外植体。每天光照10～16小时。培养室的温度为20～28℃。培养4个星期在GS培养基上的外植体长成具有3～5个叶片和根的新的植株。

这些再生植株又可切成茎段进行下一次培养。每4个星期继代一次。培养4个星期统计结果如下：在GS培养基上的75个外植体共形成72个完整的植株，成株率为96％。

2.光自养培养与试管苗移栽

(1)取100个先锋葡萄试管苗茎段外植体接种在光自养培养基(GP)上，另取100个外植体接种在继代培养基(GS)作为对照。每瓶接2个外植体。操作方法同步骤1。每天光照16个小时，光照度为1200～2000lux。

(2)培养4个星期，两种培养基上的外植体均长出带有3～5片叶片的新茎和健壮的根。形成再生植株。光自养培养基无污染，100个外植体共形成92个完整的植株。成株率为92％。对照继代培养基污染4瓶，剩下92个外植体，其中86个外植体形成完整的植株，成株率为93.48％。两种培养基的成株率无显著差异。但是对照污染较多，实际获得的再生植株数少于光自养培养的材料。

(3)打开瓶口，两种培养基上的再生植株均在室内散射光下练苗7天。然后用自来水洗去根上的培养基，栽入盛有纯沙的花盆内置于室内。花盆浇透水，上面盖上塑料薄膜保湿。5天后去掉塑料膜。

(4)移栽20天后统计成活率和植株的生长情况。来自光自养培养基的92个植株成活87株，成活率为94.57％。来自对照的86个植株成活31株，成活率为36.05％。移栽前来自两种培养基的小植株平均株高均为4.2cm。移栽20天后来自光自养培养基的小植株平均株高达10.45cm，增高6.25cm；而来自对照的小植株平均株高只有5.71cm，仅增高1.51cm。实施例二：

(一)试验材料：先锋葡萄试管苗。

(二)培养基：GS培养基植物生长素含量为0.1mg/L，蔗糖30000mg/L；GP培养基的植物生长素含量为0.1mg/L，琼脂为12g/L。培养基的其它成分同实施例一。

(三)方法与结果：

1.继代培养与增殖

按照实施例一的方法，每瓶GS培养基接种3个外植体，25瓶共接种75个外植体。培养4周后共形成70个完整的植株，成株率为93.3％。

2.光自养培养与试管苗移栽

按照实施例一的方法把100个茎段外植体接种在GP培养基上，未设GS对照。四个星期后共形成93个完整植株，成株率为93％。经练苗把这些植株全部移栽。20天后共成活86株，成活率为92.47％。实施例三：

(一)试验材料：

先锋、巨峰和黑奥林三个葡萄品种的试管苗，其中黑奥林为脱病毒试

管苗。

(二)培养基：GS培养基含植物生长素0.1mg/L，蔗糖20000mg/L。GP培养基植物生长素0.1mg/L，琼脂8000mg/L。其它成分同实施例一。

(三)方法与结果：

在GS培养基上大量繁殖三个葡萄品种的试管苗，方法同实施例一。然后，把来自GS培养基的上述3个品种的外植体共2537个全部接种在GP培养基上进行光自养培养，一个月后共获得再生植株2312个(其中先锋1251株，巨峰579株，黑奥林482株)，成株率为91.13％。经练苗7天后把这些植株全部栽入盛有纯沙的沙床。浇水至饱和状态，上罩塑料薄膜保湿。5天后去掉塑料膜。20天后统计成活率。共成活2083株，其中先锋为1126株，巨峰523株，黑奥林434株。成活率为90.1％。上述植株在沙床上培养1个月后全部栽入苗圃。

Claims

1、一种用于葡萄试管苗繁殖的继代培养基，其特征在于，该培养基是在无机盐基础培养基中按常规量加入有机附加物——肌醇，盐酸硫胺素，烟酸，盐酸吡哆醇和琼脂后再加入生长素类物质和2％～3％的蔗糖，pH值被调整至5.6。

2、按照权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的生长素类物质为0.05～0.1mg/L的植物生长素。

3、按照权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的蔗糖浓度为2％。

4、一种用于葡萄试管苗繁殖的光自养培养基，其特征在于，该培养基是在无机盐基础培养基中仅加入0.05～0.1mg/L的植物生长素和琼脂，并将琼脂含量提高到0.75％以上，pH值调整至6.0。

5、按照权利要求4所述的培养基，其特征在于，该培养基中还含有2mg/L的盐酸硫胺素。

6、一种利用光自养培养快速繁殖葡萄试管苗的方法，包括以下步骤：

a.将试管苗在继代培养基上继代培养，扩大繁殖；

c.当试管苗繁殖到一定数目时转到光自养培养基培养，方法同步骤b，每天光照14小时以上，试管苗长出3～5片叶和健壮的根后，打开瓶口在室内自然光照下练苗6天以上；

d.取出练苗后的试管苗进行移栽，在湿润条件下生长3～5天，之后在自然条件下生长。

7、按照权利要求6所述的方法，其特征在于，在进行步骤c的培养时光照度为1200～2000lux。

8、按照权利要求6所述的方法，其特征在于，在进行步骤c的培养后练苗时间为7～10天。

9、按照权利要求7所述的方法，其特征在于，在进行步骤d中的移植是将试管苗移植进砂子，蛭石，草炭土或其它透气性良好的材料中。