CN102230941A - 自动酯化反应装置和血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种自动酯化反应装置，包括反应器、与该反应器相连的酸供应装置、溶剂供应装置、醇供应装置、惰性气体供应装置、用于对反应器进行加热和冷却的温控装置以及用于控制上述各部件运作的计算机控制单元，所述计算机控制单元能够按设定程序控制自动完成酯化反应的加样、温控以及取样等操作过程，因此不仅省去了实验人员的操作麻烦，也使反应的可控性和稳定性得到了提高。本发明还涉及一种血液中ω -3 多不饱和脂肪酸的检测方法，该方法采用上述的自动酯化反应装置自动完成红细胞膜的甲酯化过程，不仅能够提高检测效率、减少试剂损耗和节省人力成本，还能大大提高检测过程的稳定性，使样品检测的重现性更好。

Description

自动酯化反应装置和血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法

技术领域

本发明涉及一种自动酯化反应装置和一种血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法。

背景技术

人体血液中红细胞膜脂肪酸的组分直接关系到红细胞的功能。当今对红细胞膜脂肪酸的构成及其相互之间的含量的研究变得越来越重要，因为红细胞膜的组成，包括ω-6和ω-3多不饱和脂肪酸的含量及其之间的比例，可以有效反映人体脂肪酸饮食的变化，甚至已成为脂类相关疾病的生物指标之一。因此，直接检测和定期明确血液中ω-3多不饱和脂肪酸的含量不仅可以减低人体患心脏类疾病的风险、减低疾病的发病率等，还能直观的指导医生用药，从而让患者及时的摄入ω-3多不饱和脂肪酸，达到提早预防和有效治疗各类疾病的目的；同时，也可以让老百姓增强自我保健能力，根据血液中ω-3多不饱和脂肪酸的含量高低，来决定是否需要通过药物或者食物等及时补充ω-3多不饱和脂肪酸，从而降低心血管疾病、高血压等疾病的危险。

目前国内外对于血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测通常包括四步：①血液样品中红细胞膜的分离和提取：包括血样采集、红细胞膜的离心分离、用Tris-HCl缓冲液对红细胞膜的洗涤以及红细胞膜的离心抽提等；②红细胞膜的甲酯化：使抽提所得的红细胞膜样品与甲醇发生甲酯化反应，得到甲酯化的红细胞膜；③红细胞膜的后处理：包括对甲酯化的红细胞膜进行多步萃取和离心；④ω-3多不饱和脂肪酸的含量测定：将经后处理的红细胞膜通入气象色谱仪进行色谱分析，对其中的ω-3多不饱和脂肪酸进行含量测定等。该检测方法操作步骤多而繁琐，其中第②步红细胞膜中ω-3多不饱和脂肪酸的甲酯化过程就非常复杂，需用到多种有机试剂，且需多步加样，目前大部分实验室进行此步处理时还是人工操作，因此甲酯化过程存在试剂损耗大、样品重现性差、处理速度慢等很多问题，而且人工操作也增加了人力成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种自动酯化反应装置，它能够通过计算机控制单元自动完成酯化反应的加样-反应-取样全过程，反应可控性好，自动化程度高，使用非常方便。

本发明还要提供一种血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法，其采用本发明的自动酯化反应装置自动完成红细胞膜的甲酯化过程，在减少试剂损耗和节省人力成本的同时，还能大大提高检测过程的稳定性。

为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案是：

一种自动酯化反应装置，包括：

至少一个反应单元，该反应单元包括具有惰性气体入口、惰性气体出口、至少一个加样口和取样口的反应器，通过加样口与反应器相连通用于向反应器内分别加入酸、溶剂和醇的酸供应装置、溶剂供应装置和醇供应装置，以及通过取样口与反应器相连通的取样装置；

温控装置，其用于对反应器进行加热或冷却；

惰性气体供应装置，其通过惰性气体入口与所述反应器相连通，用于向反应器内提供惰性气体；

计算机控制单元，其用于控制酸供应装置、溶剂供应装置、醇供应装置、取样装置和惰性气体供应装置按照设定的程序进行加样、取样或供气，以及用于控制温控装置根据酯化反应的需要调节温度。

优选地，所述反应单元有多个。

更进一步优选地，多个所述反应单元独立地由计算机控制单元控制，这样可以同时进行多个不同的酯化反应，提高实验效率。

优选地，所述温控装置也有多个，且多个温控装置与多个反应单元的反应器一一对应。

上述自动酯化反应装置可以用来进行ω-3多不饱和脂肪酸的甲酯化反应，使繁琐的步骤通过计算机控制单元自动控制完成，方便省事。

一种血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法，其包括①血液样品中红细胞膜的分离和提取；②红细胞膜的甲酯化；③红细胞膜的后处理以及④ω-3多不饱和脂肪酸的含量测定四步，其中的步骤②采用上述的自动酯化反应装置来进行，从步骤①提取的红细胞膜由酸供应装置加入到反应器中，甲酯化所需要的甲醇由醇供应装置加入到反应器中。

作为本发明的进一步改进方案，反应器的加样口有两个，分别为与酸供应装置相连的第一加样口和同时与溶剂供应装置、醇供应装置相连的第二加样口。在条件允许的情况下设置多个加样口，使不同的试剂通过不同的加样口加入反应器中，其目的是为了避免各种试剂沾染在加样口上造成加样口的污染。

进一步地，步骤②由自动酯化反应装置的计算机控制单元控制自动完成，其操作过程如下：

a从酸供应装置往反应器中加入步骤①提取的红细胞膜；

b从溶剂供应装置往反应器中加入溶剂；

c从醇供应装置往反应器中加入强酸/甲醇溶液；

d控制惰性气体供应装置往反应器中通惰性气体，然后关闭惰性气体入口和惰性气体出口；

e启动温控装置，对反应器进行加热，控制反应器温度在95℃~105℃之间，保温1小时，然后逐渐降温至室温；

f控制取样装置从反应器中取样。

优选地，所述溶剂为正己烷，所述强酸/甲醇溶液包括三氟化硼/甲醇溶液、硫酸/甲醇溶液或盐酸/甲醇溶液等。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的自动酯化反应装置，将酯化反应的反应器、试剂供应装置和温控装置等通过计算机联系在一起，由计算机控制单元控制自动完成酯化反应的加样、温控以及取样等操作过程，不仅省去了实验人员的操作麻烦，也使反应的可控性和稳定性得到了提高。

本发明血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法，采用上述的自动酯化反应装置自动完成红细胞膜的甲酯化过程，不仅能够提高检测效率、减少试剂损耗和节省人力成本，还能大大提高检测过程的稳定性，使样品检测的重现性更好。

附图说明

下面结合附图和具体的实施方式对本发明做进一步详细的说明：

图1为本发明自动酯化反应装置的结构示意图；

其中：1、反应器；10、惰性气体入口；11、第一加样口；12、第二加样口；13、惰性气体出口；14、取样口；2、温控装置；3、酸供应装置；4、溶剂供应装置；5、醇供应装置；6、取样装置；7、惰性气体供应装置；8、计算机控制单元。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但不限于这些实施例。

实施例1

如图1所示，按照本实施例的自动酯化反应装置包括：

反应单元，该反应单元包括具有惰性气体入口10、惰性气体出口13、第一加样口11、第二加样口12和取样口14的反应器1，通过第一加样口11与反应器1相连通用于向反应器1内加入酸的酸供应装置3，共用第二加样口12并与反应器1相连通用于向反应器1内分别加入溶剂和醇的溶剂供应装置4和醇供应装置5，以及通过取样口14与反应器1相连通的取样装置6；

温控装置2，其用于对反应器1进行加热或冷却；

惰性气体供应装置7，其通过惰性气体入口10与反应器1相连通，用于向反应器1内提供惰性气体；

计算机控制单元8，其用于控制酸供应装置3、溶剂供应装置4、醇供应装置5、取样装置6和惰性气体供应装置7按照设定的程序进行加样、取样或供气，以及用于控制温控装置2根据酯化反应的需要调节温度。

根据需要，反应单元可以设置多个，它们均由计算机控制单元8控制；多个反应单元可以共用一个温控装置，每个反应单元也可以单独对应一个温控装置，这样每个反应单元独立地由计算机控制单元8控制，能够同时进行多个相同的酯化反应，也可以同时进行多个不同的酯化反应，提高实验效率。

实施例2

本实施例提供一种血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法，其中的甲酯化过程利用实施例1的自动酯化反应装置进行，该检测方法的具体操作步骤如下：

（1）红细胞膜的分离和提取：取体检人员血液，肝素抗凝，然后取肝素抗凝静脉血0.5 mL，4℃下以3000 r/min离心20 min，使红细胞沉淀后，用吸管小心吸尽血浆及沉淀在红细胞表层的绒毛状沉淀层。用生理盐水（4℃）稀释红细胞沉淀，离心（3 000 r/min×10 min），弃上层清液及沉淀在红细胞表层的白细胞、血小板等，得下层的红细胞沉淀。然后，准确移取100 μL 红细胞沉淀物按1:40 比例加入预冷的pH7.4，10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，摇匀，使之悬浮溶血，于4℃，12000r/min, 离心15min，重复洗涤离心4 次得乳白色红细胞膜悬液。N ₂ 干燥，低温保存。

（2）红细胞膜的甲酯化：取步骤（1）所得干燥的红细胞膜沉淀物作为样品置于实施例1的自动酯化反应装置的酸供应装置3中，并往溶剂供应装置4中加满溶剂正己烷，往醇供应装置5中加满BF ₃ /MeOH（三氟化硼/甲醇）溶液，该溶液中三氟化硼的质量分数为14%；保证惰性气体供应装置7能够提供足量的氮气；

启动计算机控制器8，计算机控制器8按程序设定依次自动进行如下操作：

a从酸供应装置3经第一加样口11往反应器1中加入红细胞膜沉淀物；

b从溶剂供应装置4经第二加样口12往反应器1中加入正己烷1ml；

c从醇供应装置5经第二加样口12往反应器1中加入1ml14%的BF ₃ /MeOH溶液；

d开启惰性气体供应装置7上的进气阀，通氮气一段时间，使氮气充满反应器空间，然后关闭惰性气体入口10和惰性气体出口13；

e启动温控装置2，对反应器1进行加热，控制反应器1的温度在100℃，加热时间为1小时，然后逐渐降温至室温；

f取样装置6通过取样口14从反应器1中取样，完成甲酯化过程。通常取样口14处的取样管应伸入反应器1底部，位于反应液面以下，以便于取样。

（3）对步骤（2）甲酯化后所得的样品进行离心和萃取等后处理。

（4）将经步骤（3）后所得样品通入气相色谱（GC）分析仪，进行气相色谱分析，得到ω-3多不饱和脂肪酸的含量等检测结果。

其中，步骤（2）中的三氟化硼/甲醇溶液也可以用其他酸性与三氟化硼相当的强酸/甲醇溶液替代，如硫酸/甲醇溶液或盐酸/甲醇溶液等，在使用不同的酸时只要按比例适当调整溶液中酸的浓度即可。

本实施例的检测方法，实现了红细胞中ω-3多不饱和脂肪酸的自动化甲酯化，加样-反应-取样等均通过电脑控制和操作，并能通过多个反应单元并行实现多个不同样品的同时处理，因此大大提高了样品处理的效率以及样品检测的稳定性和重现性，同时减少了试剂损耗和人力成本。

另外需要说明的是，本发明的计算机控制单元8是采用常规的计算机控制手段，如按需要的试验步骤进行编程设定等来控制各部件的运作的。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种自动酯化反应装置，其特征在于：所述自动酯化反应装置包括：

至少一个反应单元，所述反应单元包括具有惰性气体入口（10）、惰性气体出口（13）、至少一个加样口和取样口（14）的反应器（1），通过所述加样口与所述反应器（1）相连通用于向所述反应器（1）内分别加入酸、溶剂和醇的酸供应装置（3）、溶剂供应装置（4）和醇供应装置（5），以及通过所述取样口（14）与所述反应器（1）相连通的取样装置（6）；

温控装置（2），其用于对所述反应器（1）进行加热或冷却；

惰性气体供应装置（7），其通过所述惰性气体入口（10）与所述反应器（1）相连通、用于向所述反应器（1）内提供惰性气体；

计算机控制单元（8），其用于控制所述酸供应装置（3）、溶剂供应装置（4）、醇供应装置（5）、取样装置（6）和惰性气体供应装置（7）按照设定的程序进行加样、取样或供气，以及用于控制所述温控装置（2）根据酯化反应的需要调节温度。

2.根据权利要求1所述的自动酯化反应装置，其特征在于：所述反应单元有多个。

3.根据权利要求2所述的自动酯化反应装置，其特征在于：多个所述反应单元独立地由所述计算机控制单元（8）控制。

4.根据权利要求2所述的自动酯化反应装置，其特征在于：所述温控装置（2）也有多个，且多个所述温控装置（2）与多个所述反应单元的反应器（1）一一对应。

5.一种ω-3多不饱和脂肪酸的甲酯化反应的方法，其特征在于：该方法采用权利要求1至4中任一项权利要求所述的自动酯化反应装置来进行。

6.一种血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法，其包括①血液样品中红细胞膜的分离和提取；②红细胞膜的甲酯化；③红细胞膜的后处理以及④ω-3多不饱和脂肪酸的含量测定，其特征在于：步骤②中，所述红细胞膜的甲酯化采用权利要求1至4中任一项所述的自动酯化反应装置来进行，从步骤①提取的红细胞膜由所述酸供应装置（3）加入到反应器（1）中，甲酯化所需要的甲醇由所述的醇供应装置（5）加入到反应器（1）中。

7.根据权利要求6所述的血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法，其特征在于：所述反应器（1）的加样口有两个，分别为与所述酸供应装置（3）相连的第一加样口（11）和同时与所述溶剂供应装置（4）、醇供应装置（5）相连的第二加样口（12）。

8.根据权利要求6所述的血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法，其特征在于：步骤②由所述自动酯化反应装置的计算机控制单元（8）控制自动完成，其操作过程如下：

a从酸供应装置（3）往反应器（1）中加入步骤①提取的红细胞膜；

b从溶剂供应装置（4）往反应器（1）中加入溶剂；

c从醇供应装置（5）往反应器（1）中加入强酸/甲醇溶液；

d控制惰性气体供应装置（7）往反应器（1）中通惰性气体，然后关闭惰性气体入口（10）和惰性气体出口（13）；

e启动温控装置（2），对反应器（1）进行加热，控制反应器（1）温度在95℃~105℃之间，保温1小时，然后逐渐降温至室温；

f控制取样装置（6）从反应器（1）中取样。

9.根据权利要求8所述的血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法，其特征在于：所述溶剂为正己烷。

10.根据权利要求8所述的血液中ω-3多不饱和脂肪酸的检测方法，其特征在于：所述强酸/甲醇溶液为三氟化硼/甲醇溶液、硫酸/甲醇溶液或盐酸/甲醇溶液。

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