CN102229965A

CN102229965A - 一种产黑色素的海洋细菌及发酵生产天然黑色素方法

Info

Publication number: CN102229965A
Application number: CN2011101299017A
Authority: CN
Inventors: 杜宗军; 邢翔; 陈冠军
Original assignee: Shandong University Weihai
Current assignee: Shandong University Weihai
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2011-11-02

Abstract

本发明属于微生物研究技术领域。本发明涉及一种产黑色素的海洋细菌及发酵生产天然黑色素方法。从一种海洋细菌培养物中提取黑色素，该菌须在含有酪氨酸(L-Tyr)，同时含有葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏或牛肉粉，陈海水，控制初始pH为6.1-7.8条件下进行培养；培养物采用高速离心去除菌体，调整清夜pH为2-4，室温孵育后离心去杂质，烘至恒重，有机溶剂洗脱得黑色素纯品即天然黑色素。该菌隶属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp)，其保藏号为CGMCC No.1782。该天然黑色素具有抗辐射、抗氧化作用，生产方法低成本、产量高，应用广泛。

Description

一种产黑色素的海洋细菌及发酵生产天然黑色素方法

技术领域：

本发明属于微生物研究技术领域。涉及一种产黑色素的海洋细菌及发酵生产天然黑色素方法。该天然黑色素具有抗辐射、抗氧化作用，生产方法低成本、产量高，应用广泛。

背景技术

色素在人类的生产生活中被广泛应用在食品、印染、化妆品、医药、塑料、颜料等方面。由于化学合成色素对人体的毒性作用屡见报道，比之合成色素，天然色素所具有得环保、无污染、对人体无危害的特点。因此，天然色素的研究与应用受到广泛的关注，社会可接受性极强。同时海洋生物资源的开发利用日益受到国家的重视，海洋生物由于特殊的生境能产生陆地生物所不具有的活性物质，已得到科技界的公认。为此，科学界已把寻找资源的目标转向海洋微生物。

黑色素(Melanin)是广泛存在与动物、植物和微生物体中结构复杂多样的黑色难溶性色素的总称。这种色素能提高生物生存、竞争的能力。天然的黑色素不仅能吸收大部分可见光，还能吸收紫外线、x射线、γ射线等多种辐射，因此，它具有保护体内细胞免受辐射损伤的功能。基于天然黑色素这一性质，目前国外已将其应用与生产防晒和各类防辐射眼镜等，但国内尚未有这方面的应用。黑色素还具有清除自由基、抗氧化的功能。由酪氨酸酶催化产生的黑色素阻止心磷脂脂质体的氧化。可溶性黑色素在体外实验显示具有抑制艾滋病病毒感染宿主细胞的作用，并认为此类黑色素可能成为一种有效的抗病毒类新药。黑色素还能用来治疗某些与黑色素缺乏有关的神经系统疾病，如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等。

一般自生物种分离纯化产黑色素条件要求高，生长周期长，色素产量低，稳定性差，国内应用较少。利用海洋微生物发酵生产天然色素，具有成本低廉、产出高等优势，应用前景广阔。

发明内容：

本发明涉及一种产黑色素的海洋细菌及发酵生产天然黑色素方法。

1、一种天然黑色素的生产方法，其特征在于其从一种海洋细菌培养物中提取黑色素，该菌须在含有酪氨酸(L-Tyr)，同时含有葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏或牛肉粉，陈海水，控制初始pH为6.1-7.8条件下进行培养；培养物采用高速离心去除菌体，调整清夜pH为2-4，室温孵育后离心去杂质，烘至恒重，有机溶剂洗脱得黑色素纯品即天然黑色素。

2、一种高产黑色素的海洋细菌，其特征在于该菌隶属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp)，其保藏号为CGMCC 1782。

本发明目的是提供了一种以添加酪氨酸为底物利用海洋细菌发酵生产黑色素的新工艺。

一种以添加酪氨酸为底物利用海洋细菌发酵生产黑色素的方法及提纯工艺，在温度28±2℃，葡萄糖为碳源0.1％-0.2％，蛋白胨为主要氮源0.4％-0.6％，另添加CaCl₂0.01％-0.02％，并以L-酪氨酸(L-Tyr)0.15％-0.3％g为高产黑色素底物，以天然海水作为培养基用水，调节初始pH为7.0，作为发酵生产黑色素条件。

黑色素的提取和纯化是将以上条件下将菌培至48h，发酵液过滤离心后除菌，以盐酸调节清液pH为2～3，静置12h，12000rpm高速离心，弃清夜将沉淀物置100℃烘干至恒重，即得到黑色素粗品，再经三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇分别洗涤粗品并利用旋转蒸发，最后以100℃干燥既得黑色素纯品，纯品黑色素色泽饱满，对光、热均有较好稳定性，产量高。

本发明的另一个目的为提供一种产黑色素的海洋细菌。

一种高产黑色素的海洋细菌，其代号为DH-166，本发明所提供的海洋细菌DH-166已于2006年8月16日在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行了保藏，地址为北京市中关村北一条13号中科院微生物研究所，邮政编码：100080，保藏号为CGMCC 1782。

该菌为革兰氏阴性，菌体为短杆菌，侧生两根鞭毛，未观察到芽孢产生，有运动性，为严格好氧菌。葡萄糖产气试验阴性，不产气，淀粉酶试验阴性，明胶酶试验阳性，卵磷脂酶试验阳性，氧化酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，柠檬酸盐利用试验阴性，H2S产生试验阳性，精氨酸双水解试验阴性，经16srDNA序列分析为Pseudoalteromonas sp.。

该菌株在15℃-35℃均能生长，28±2℃为最适生长温度。在盐度0％-8％范围内均能生长，控制培养基盐度为2％-3％情况下生长状况较佳。

色素产生菌对培养条件有一定的要求，在以葡萄糖0.1％-0.2％，蛋白胨0.4％-0.6％，L-Ty0.2％-0.4％，CaCl₂0.01％-0.02％，天然海水为培养基用水，琼脂1.5％-20％(液体培养无需添加)，初始pH为6.1-7.8的培养条件下可快速生长并可见黑色素产出，该条件可通过发酵系统实现。

具体实施方式

本发明所述的涉及一株高产黑色素海洋细菌及色素提取方法包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

具体实施案例1

1、菌株的活化与纯化：DH166在初始pH7.2，陈海水为培养基用水的2216E培养基上生长情况尚可，菌落呈黑色，表面光滑，直径2～3mm，菌落周围的培养基有较为明显黑色素产生。挑取周围呈现明显黑色的菌落，进一步培养。

2、菌株的液体培养：控制牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，海水为培养基用水配制液体培养基，控制培养基盐度为3％，分装至容量为1000ml三角瓶中，调节pH为7.2，以摇床控制培养条件为28℃，生长状况较佳。

3、发酵设备高密度培养：发酵罐高密度培养；以葡萄糖0.15％，蛋白胨0.56％，L-Ty，2.5％，CaCl₂0.01％，天然海水为培养基用水，初始pH为7.2的培养条件下可快速生长并可见黑色素产出，经二级扩培，扩大至7升发酵罐进行连续培养，控制转速150rpm，温度28.5℃，罐压0.003MPa。

4、黑色素的提取：经60h培养，下罐获取发酵液，添加0.5％的明矾作为絮凝剂，经24h冷藏沉淀，取上清液以盐酸调节pH为2，4℃-6℃低温静置10小时，12000rpm高速离心，弃清夜将沉淀物置80℃烘干至恒重，即得到黑色素粗品，再经三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇分别洗涤粗品并利用旋转蒸发，最后以80℃干燥既得黑色素纯品，产量可达1.275g/L。

具体实施案例2

1、菌株的活化与纯化：DH166在初始pH7.6，陈海水为培养基用水的2216E培养基上生长情况尚可，菌落呈黑色，表面光滑，直径2～3mm，菌落周围的培养基有较为明显黑色素产生。挑取周围呈现明显黑色的菌落，进一步培养。

2、菌株的液体培养：控制牛肉膏0,5％，蛋白胨0.5％，海水为培养基用水配制液体培养基，控制培养基盐度为3％，分装至容量为1000ml三角瓶中，调节pH为7.6，以摇床控制培养条件为28℃，生长状况较佳。

3、发酵设备高密度培养：发酵罐高密度培养；以葡萄糖0.15％，蛋白胨0.56％，L-Ty，2.5％，CaCl₂0.01％，天然海水为培养基用水，初始pH为7.6的培养条件下可快速生长并可见黑色素产出，经二级扩培，扩大至7升发酵罐进行连续培养，控制转速150rpm，温度28.5℃，罐压0.003MPa。

海洋细菌的分离纯化及16S鉴定实验

自东海海水中分离出一株高产胞外黑色素的细菌DH166。利用PCR技术对其16S rDNA进行扩增，测序后将所得的序列进行相似性搜索，结果显示与其相似度最高的菌为Pseudoalteromonas sp.JL-300，其相似度为96.18％.初步鉴定DH166属假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)的一个新种。序列已提交到GenBank，序列收录号为：DQ493656。DH166具有产黑色素速度快，产量高且大量向培养基分泌等优点。鉴于DH166的产黑色素特性，将成为该属的一个新的菌种资源

DH166在海水配制的牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好，菌落呈黑色，表面光滑，直径2～3mm，由于细菌向培养基中分泌色素，菌落周围的培养基呈现黑色。该菌株在15℃-35℃均能生长，28±2℃为最适生长温度。在盐度0％-8％范围内均能生长，控制培养基盐度为2％-3％情况下生长状况较佳。

在酪氨酸培养基中，可以观察到细菌向周围的培养基中分泌黑色色素，酪氨酸对于色素的产量具有明显的促进作用。

经生理生化实验，结果显示该菌为革兰氏阴性，菌体为短杆菌，侧生两根鞭毛，未观察到芽孢产生，有运动性，为严格好氧菌。葡萄糖产气试验阴性，不产气，淀粉酶试验阴性，明胶酶试验阳性，卵磷脂酶试验阳性，氧化酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，柠檬酸盐利用试验阴性，H2S产生试验阳性，精氨酸双水解试验阴性。

将细菌接种在平板上，28℃培养过夜。取单一菌落悬浮于50μL无菌蒸馏水中，于100℃水浴加热5min，8000rpm离心，取上清作为PCR模板DNA。

扩增16S rRNA基因的正向引物为27F：5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’(对应于E.coli 16S rRNA基因的第8～27个碱基位置)，反向引物1492R：5’-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’(对应于E.coli 16S rRNA基因的第1492～1510个碱基位置)。在100μL的PCR反应体系中含有：10×PCR Buffer(Mg2+Plus)10μL，dNTP Mixture 8μL，引物各2μL，Taq DNA聚合酶0.6μL(5U/μL)，DNA模板2μL。PCR反应条件为：96℃预变性6min；接94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃温育6min。PCR扩增产物交由上海生物工程技术公司进行序列测定。经16srDNA序列分析为Pseudoalteromonassp.。

摇瓶培养高产黑色素条件优化；黑色素产生菌对培养条件有一定的要求，在以葡萄糖0.1％，蛋白胨0.4％，L-Ty，2.5％，CaCl₂0.01％，天然海水为培养基用水，琼脂1.5％(液体培养无需添加)，初始pH为7.0的培养条件下可快速生长并可见黑色素产出，该条件可通过发酵系统实现。

黑色素提纯；将已培养至48h的发酵液过滤离心后除菌，以盐酸调节清液pH为2，静置10小时，12000rpm高速离心，弃清夜将沉淀物置100℃烘干至恒重，即得到黑色素粗品，再经三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇分别洗涤粗品并利用旋转蒸发，最后以100℃干燥既得黑色素纯品，纯品黑色素色泽饱满，对光、热均有较好稳定性。

Claims

1.一种天然黑色素的生产方法，其特征在于其从一种海洋细菌培养物中提取黑色素，该菌须在含有酪氨酸，同时含有葡萄糖、蛋白胨、牛肉浸膏或牛肉粉，陈海水，控制初始pH为6.1-7.8条件下进行培养；培养物采用高速离心去除菌体，调整清夜pH为2-4，室温孵育后离心去杂质，烘至恒重，有机溶剂洗脱得黑色素纯品即天然黑色素。

2.权利要求1所述的一种天然黑色素的生产方法的海洋细菌，其特征在于该菌隶属于假交替单胞菌属Pseudoalteromonas sp，其保藏号为CGMCC 1782。