CN102228499B

CN102228499B - 一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法

Info

Publication number: CN102228499B
Application number: CN 201110164992
Authority: CN
Inventors: 袁晓; 袁萍
Original assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Current assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2013-01-02
Anticipated expiration: 2031-06-20
Also published as: CN102228499A

Abstract

本发明公开了一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法，其步骤：A、将紫草干燥茎块烘干、用乙醇超声提取，超声，得到干浸膏；B、用溶剂石油醚和乙酸乙酯将乙醇干浸膏萃取，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏；C、将浸膏用等体积的乙酸乙酯超声溶解，蒸干至无乙酸乙酯气味，串联后的柱子接到中低压制备型色谱柱上；D、洗脱剂为石油醚，在中低压色谱柱的荧屏监控图下洗脱柱子，收集流份，得到化合物；E、将中低压制备色谱上串联，将化合物用甲醇溶解，化合物得纯化；F、化合物经过碱性反应产生紫色，无色亚甲蓝显色试验呈阳性。方法易行，操作简便，该方法是利用中低压制备色谱；高效分离抗癌活性成分的优化工艺，且含量在95%以上。

Description

一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法

技术领域

本发明涉及从药用植物中提取分离萘醌类成分的技术领域，更具体涉及一种从紫草抗肿瘤活性成分-萘醌类的提取方法，这些活性成分不仅有抗肿瘤的作用，还有抗炎、解热、镇痛、镇静、抗病原微生物、抗生育作用、保肝等作用，能广泛用于医药卫生行业。

背景技术

紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebaieuchroma(Royle)Johnst的干燥根，紫草中主要药效成分为萘醌类色素，包括紫草素、去氧紫草素、β，β二甲基丙烯酰紫草素、乙酰紫草素等。从紫草中分离出萘醌类有效成分，其药理作用不仅有抗病原微生物作用；抗病毒作用；抗炎作用；消化道平滑肌的作用。主要有抗癌作用，由新疆紫草中提得的紫草素(Shikonin)，510mg/kg可完全抑制腹水型肉瘤₁₈₀细胞的生长。10mg/kg可延长带瘤小鼠生命92.5%。紫草素(Shikonin)对小鼠肝癌H₂₂和Lewis肺癌的放射增敏作用。

目前，对紫草萘醌成分的提取纯化方法有较多的研究报道，但大多是传统的提取分离工艺，分离时间长，提取杂质多；溶剂耗损大；不易分离得到高纯度的药用成分。本专利提供的提取分离方法，是利用Dr FlashⅡ型中低压制备色谱快捷、高效、量大的一种优良提取分离工艺, 也能获得纯度较高的有效成分。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法，方法易行，操作简便，该方法是利用中低压制备色谱；高效分离抗癌活性成分的优化工艺，且含量在95%以上.。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法，其步骤是：

1、将紫草干燥茎块烘干、粉碎后用乙醇超声提取，乙醇的倒入量为药材重量的5~10倍。置入超声仪中超声30~50min，再将超声后的物质过滤，回收过滤溶液中的溶剂。将回收的溶剂再倒入三角瓶，继续超声，重复本步骤3~5次，得到用乙醇提取的干浸膏。

2、分别用溶剂石油醚和乙酸乙酯将乙醇干浸膏萃取，石油醚和乙酸乙酯的量为浸膏的4～7倍，反复萃取3～5次，至萃取液无色，分别将石油醚和乙酸乙酯萃取液过滤；回收过滤溶液中的溶剂，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏。

3、将以上二种浸膏用等体积的乙酸乙酯超声溶解，用其1～3倍量的400-500目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯气味；取400ml、1500mL Flash柱（也可以用玻璃和不锈钢柱）各一个，400ml的柱装拌样硅胶，1500ml的柱仅装硅胶作为分离柱。二根柱都干法上样；分别用石油醚洗脱至柱平衡，再将二根柱串联，串联后的柱子接到中低压（0.1~5兆帕）制备型色谱柱上。中低压（0.1~5兆帕）制备色谱柱的制备条件为泵压力100-200帕，流速100ml/min，检测器的监控波长为395nm，检测器的收集波长为280nm，死体积为7mL。

4、洗脱剂为石油醚含B（B是按乙酸乙酯：丙酮=4:1混合的溶剂）2%（v/v），6%（v/v），10%（v/v）的比例洗脱，每组洗脱剂中还加上0.2%（v/v）的甲酸，即，洗脱剂为1份B加49份石油醚加0.1份甲酸混合，在中低压（0.1~5兆帕）色谱柱的荧屏监控图下洗脱柱子，并收集流份，按监控图出现的谱峰收集，再以薄层色谱（TLC）检识辅助，取TLC检测紫色斑点中Rf值一致的流份，合并流分后得到六个粗的化合物。

5、将中低压（0.1~5兆帕）制备色谱上串联的2根柱子换成C₁₈柱、将六个粗品化合物分别用甲醇溶解，注入C₁₈柱中，用不同梯度的甲醇-水洗脱，收集流分，蒸干，六个化合物得到进一步的纯化，经高压液相色谱检测六个化合物的质量分数为95%以上。

6、六个化合物经过碱性反应产生紫色，无色亚甲蓝显色试验呈阳性，说明为萘醌成分（碱性反应的方法25%（w/v）Na₂CO₃水溶液；4%（v/v）HCHO水溶液；5%（v/v）邻二硝基苯的苯溶液各1滴，加微量的化合物，混合后在水浴上加热至温度在50～70℃，1～4分钟内产生紫蓝色。无色亚甲蓝显色试验，在薄层色谱TLC的板上用无色亚甲蓝溶液喷雾，板子上出现蓝色的斑点）。

7 经核磁共振谱、红外、质谱分析确证六个单体分别为去氧紫草素(deoxyshikonin)、紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、β-羟基异戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)；异丁酰紫草素

(isobuytyrlshikonin)、β，β-二甲基丙烯酰紫草素

(β，β-dimethylacrylshikonin)。并依次命名单体的化合物为ZCⅠ；ZCⅡ；ZCⅢ；ZCⅣ；ZCⅣ；ZCⅥ。经高压液相色谱测试，六个化合物的纯度分别是ZCⅠ为99.62%；ZCⅡ为99.02%；ZCⅢ为99.5%；ZCⅣ为99.31%；ZCⅤ为99.3%；ZCⅥ为99.2%。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1）与现有的常压制备技术相比：现有的制备色谱，大多数为常压制备色谱，常压制备色谱虽然有容易操作、方便，不要额外购买仪器，只要购买玻璃柱和展开剂等优点，但柱填充料的颗粒如硅胶一般在100～200目，分离效果差，大多数要2次或多次过柱，而且柱洗脱时间长，耗时耗力。而中低压（0.1~5兆帕）制备色谱，柱填充料的颗粒细，如硅胶可以用400～500目（颗粒细更容易分离单体），在中低压立下，流速会大大加快，分离时间短，达到好的分离效果。

2）与现有的高压制备技术相比：高压制备色谱（10-30兆帕）中色谱柱的材料颗粒均很细一般为5微米，制备量有限.而且成本过高，目前只用于分离实验级的毫克的量。中低压（0.1~5兆帕）制备色谱是可以制备100克级以上的单体，上样量大；运行成本低，仪器要求配置低，而且用戶可以自己裝柱；还可使用预装住，利用薄层色谱TLC可以快速的建立分离方法。

3）常压制备色谱与环境直接连接，试剂容易挥发，污染环境，而中低压制备洗脱剂可以密闭循环使用，不会对环境污染。

具体实施方式

一种紫草抗肿瘤活性成分-萘醌类的提取方法，其具体步骤是：

A、将1kg紫草干燥茎块烘干、粉碎后用乙醇超声提取,乙醇倒入量为药材重量的5~10倍。置入超声仪中超声30或34或39或44或47或50min，再将超声后的物质过滤，回收过滤溶液中的溶剂。将回收的溶剂再倒入三角瓶，继续超声，重复本步骤3或4或5次，得到用乙醇提取的干浸膏55g，得率为紫草干燥茎块重量的5.5%。

B、分别用溶剂石油醚和乙酸乙酯萃取乙醇浸膏，萃取溶剂石油醚和乙酸乙酯的量为浸膏的4或5或6或7倍，萃取至液体无色，分别将石油醚和乙酸乙酯萃取液过滤；回收过滤溶液中的溶剂，得到石油醚萃取浸膏为11g，乙酸乙酯萃取浸膏16.5g

C、将以上A、B步骤获得的二种浸膏用等体积的乙酸乙酯超声溶解，用其1或2或3倍量的400或450或500目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯气味；取400ml、1500mL Flash柱（也可以用玻璃和不锈钢柱）各一个，400ml的柱装拌样硅胶，1500ml的柱仅装硅胶作为分离柱。二根柱都干法上样；分别用石油醚洗脱至柱平衡，再将二根柱串联，串联后的柱子接到中低压制备型色谱柱上。中低压（0.1或0.5或1或2或3或4或5M bar）制备色谱柱的制备条件为泵压力100或150或200 Psi，流速100ml/min，检测器的监控波长为395nm，检测器的收集波长为280nm，死体积为7mL。

D、洗脱剂为石油醚含B（B为乙酸乙酯：丙酮=4:1）2%，6%，10%的比例洗脱，每组洗脱剂中还加上0.2%的甲酸，即洗脱剂为1份B加49份石油醚加0.1份甲酸，在中低压色谱柱的荧屏监控图下洗脱柱子，并收集流份，按监控图出现的谱峰收集，再以TCL检识辅助，取TCL检测紫色斑点中Rf值一致的流份，合并流分后得到六个粗的化合物。

E、将中低压（0.1或0.5或1或2或3或4或5M bar）制备色谱上串联的2根柱子换成C18柱、将六个粗品化合物分别用甲醇溶解，注入C₁₈柱中，用不同梯度的甲醇-水洗脱，收集流分，蒸干，六个化合物得到进一步的纯化，经高压液相色谱检测六个化合物的质量分数为95%以上。

F、六个化合物经过碱性反应产生紫色，无色亚甲蓝显色试验呈阳性，说明为萘醌成分（碱性反应的方法25%(w/v)Na₂CO₃水溶液；4%HCHO(v/v)水溶液；5%(v/v)邻二硝基苯的苯溶液各1滴，加微量的化合物，混合后在水浴上加热，在1～4分钟内产生紫蓝色。无色亚甲蓝显色试验，在薄层色谱TLC的板上用无色亚甲蓝溶液喷雾，板子上出现蓝色的斑点）。

G 经核磁共振谱、红外、质谱分析确证6个单体分别为去氧紫草素(deoxyshikonin)、紫草素(shikonin)、乙酰紫草素(acetylshikonin)、β-羟基异戊酰紫草素(β-hydroxyisovalerylshikonin)；异丁酰紫草素

(isobuytyrlshikonin)、β，β-二甲基丙烯酰紫草素

(β，β一dimethylacrylshikonin)。并依次命名单体化合物为ZCⅠ；ZCⅡ；ZCⅢ；ZCⅣ；ZCⅣ；ZCⅥ。经高压液相色谱测试，六个化合物的纯度分别是ZCⅠ为99.62%；ZCⅡ为99.02%；ZCⅢ为99.5%；ZCⅣ为99.31%；ZCⅤ为99.3%；ZCⅥ为99.2%。

Claims

1.一种从紫草中分离出萘醌类有效成分的方法，其步骤是：

A、将紫草干燥茎块烘干、粉碎后用乙醇超声提取，乙醇的倒入量为药材重量的5～10倍，置入超声仪中超声30～50min，再将超声后的物质过滤，回收过滤溶液中的溶剂，将回收的溶剂再倒入三角瓶，继续超声，重复本步骤3～5次，得到用乙醇提取的干浸膏；

B、分别用溶剂石油醚和乙酸乙酯将乙醇干浸膏萃取，石油醚和乙酸乙酯的量为浸膏的4～7倍，反复萃取3～5次，至萃取液无色，分别将石油醚和乙酸乙酯萃取液过滤；回收过滤溶液中的溶剂，得到石油醚和乙酸乙酯萃取浸膏；

C、将(A)和(B)步骤的浸膏用等体积的乙酸乙酯超声溶解，用其1～3倍量的400-500目硅胶拌样，蒸干至无乙酸乙酯气味；取400ml、1500mL Flash柱各一个，400ml的柱装拌样硅胶，1500ml的柱仅装硅胶作为分离柱，二根柱都干法上样；分别用石油醚洗脱至柱平衡，再将二根柱串联，串联后的柱子接到中低压0.1～5兆帕制备型色谱柱上，中低压0.1～5兆帕制备色谱柱的制备条件为泵压力100-200帕，流速100ml/min，检测器的监控波长为395nm，检测器的收集波长为280nm，死体积为7mL；

D、洗脱剂的配方为：石油醚∶溶剂B∶0.2％甲酸＝49∶1∶0.1，其中溶剂B为乙酸乙酯∶丙酮＝4∶1的混合物，上述比例均为体积比；按洗脱剂为2％v/v，6％v/v，10％v/v的比例，在中低压色谱柱的荧屏监控图下洗脱柱子，并收集流份，按监控图出现的谱峰收集，再以TCL检识辅助，取TCL检测紫色斑点中Rf值一致的流份，合并流分后得到六个粗的化合物；

E、将中低压0.1～5兆帕制备色谱上串联的2根柱子换成C₁₈柱、将六个粗品化合物分别用甲醇溶解，注入C₁₈柱中，用不同梯度的甲醇-水洗脱，收集流分，蒸干，六个化合物得到进一步的纯化；

F、六个化合物经过碱性反应产生紫色，无色亚甲蓝显色试验呈阳性，说明为萘醌成分：碱性反应的方法25％w/vNa₂CO₃水溶液；4％v/vHCHO水溶液；5％v/v邻二硝基苯的苯溶液各1滴，加微量的化合物，混合后在水浴上加热至温度在50～70℃，1～4分钟内产生紫蓝色；

G、经核磁共振谱、红外、质谱分析确证六个单体分别为去氧紫草素、紫草素、乙酰紫草素、β-羟基异戊酰紫草素；异丁酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素，并依次命名单体化合物为ZC I；ZCII；ZCIII；ZCIV；ZCIV；ZCVI，经高压液相色谱测试，六个化合物的纯度分别是ZC I为99.62％；ZCII为99.02％；ZCIII为99.5％；ZCIV为99.31％；ZC V为99.3％；ZCVI为99.2％。