CN102220308A

CN102220308A - 一种质粒提取纯化柱的回收方法

Info

Publication number: CN102220308A
Application number: CN2010101498143A
Authority: CN
Inventors: 韩寒
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-04-19
Filing date: 2010-04-19
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明涉及一种物品的回收方法，尤其涉及实验用的质粒提取纯化柱的回收方法。目前常见的质粒大量抽提方法有：PEG沉淀法、溴化乙锭-氯化铯梯度离心法以及试剂盒法，其中试剂盒法较前两种方法快速并且提取的纯度高。然而，因其是一次性产品，价格昂贵，这又成为人们不得不考虑的问题。本发明一种质粒提取纯化柱的回收方法，具体如下：步骤1，质粒DNA的制备。步骤2，质粒DNA的纯化。步骤3，纯化柱再生。步骤4，鉴定回收是否彻底。步骤5，质粒DNA的纯度、含量测定及鉴定。本发明实现了质粒提取纯化柱更彻底的回收方法，避免了由于再生不彻底所造成的质粒交叉污染现象。使质粒提取纯化柱得以再生至少10次，成本降低至原价的1/10。

Description

一种质粒提取纯化柱的回收方法

技术领域

本发明涉及一种物品的回收方法，尤其涉及实验用的质粒提取纯化柱的回收方法。

背景技术

细菌质粒是一些双链闭环的DNA分子，这些质粒独立于细菌染色体之外进行复制，稳定可靠和操作简便是其优点，因此成为分子克隆的常用工具。质粒DNA提取更是分子生物学实验室最常规的操作之一。目前常见的质粒大量抽提方法有：PEG沉淀法、溴化乙锭-氯化铯梯度离心法以及试剂盒法，其中试剂盒法较前两种方法快速并且提取的纯度高。近几年各种商业性纯化试剂盒应运而生，由于这些产品使用便捷，效果好，因此倍受科研人员的青睐。然而，因其是一次性产品，价格昂贵，这又成为人们不得不考虑的问题。

发明内容

为降低实验成本，解决现有试剂盒不能反复使用的问题，本发明提出了一种试剂盒的回收方法。

本发明的方法具体如下：

步骤1，质粒DNA的制备。按常规方法挑选已构建并经鉴定的anti-senseTSK质粒进行转化、涂板，每瓶200ml摇菌、收菌。然后采用碱裂解法，用试剂P1(EDTA、DNA抑制酶)10ml悬浮菌后混合摇匀，-20度保存。使用时取出后先解冻0.5小时，至菌液变为液体时两管中各加入P2(NaOH∶SDS∶纯水＝1∶1∶8)10ml轻微摇匀几下后放置几分钟至裂解充分(菌液呈半透明)，然后加入P3(乙酸钾)10ml摇动使混匀，此时产生大量白色蛋白沉淀，放置冰中15分钟后再用力振荡至混匀，平衡后5000rpm离心30分钟后取上清液。

步骤2，质粒DNA的纯化。取纯化柱，30mLQBT液平衡柱床，然后将步骤1制取的上清液加入到纯化柱内。待上清液完全流经柱体后，加20mLQC液洗柱两次。15mLQF液洗脱DNA至放有0.7倍体积(10.5ml)异丙醇的管中，放置-20度中过夜。第二天取出，两管平衡后5000rpm离心30分钟后用小心吸去上清。400u170％乙醇洗涤沉淀三次至1.5ml离心管中，12000rpm离心10分钟，吸去上清后室温干燥沉淀，最后用水溶解质粒DNA所形成的沉淀。

步骤3，纯化柱再生。对纯化柱做好标记，每次大抽回收时分别用1M HCl(方法1)、3MNaCl(方法2)，30ml/次洗脱上述使用过的纯化柱两次，然后分别浸泡在盛有1M HCl、3M NaCl的管中封口膜封口，浸泡24-48h，再次使用时用去离子水(MQ)30ml/次，洗涤五次至流出液为中性。再用QC液30ml/次，过柱一次(洗脱蛋白等杂质)。QBT液30ml/次，过柱一次(平衡柱子)。

步骤4，鉴定回收是否彻底。采用PCR、电泳法：再次使用纯化柱时，当再次做大量抽提质粒前使纯化柱过QF液各两次，按上述收集质粒方法各收集两次后与之前收集的质粒(稀释到50ng/ul)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳法比较看是否含有质粒。

步骤5，质粒DNA的纯度、含量测定及鉴定。紫外分光光度仪测定两方法回收的柱子每次提取的样品DNA的OD260/OD280比值：水溶后的样品取6ul加入到594ul灭菌水中，稀释100倍后拿到紫外分光光度仪测定OD值，根据1ug/ul＝OD260值×5，将质粒稀释至1ug/ul，再根据加水体积即总体机，算产量(产量＝浓度×体积)。

本发明实现了质粒提取纯化柱更彻底的回收方法，避免了由于再生不彻底所造成的质粒交叉污染现象。使质粒提取纯化柱得以再生至少10次，成本降低至原价的1/10。

具体实施方式

下面对本发明做具体实施例分析：

步骤1质粒DNA的制备。

按常规方法挑选已构建并经鉴定的anti-senseTSK质粒进行转化、涂板，20瓶(200ml/瓶)摇菌、收菌。然后采用碱裂解法，每瓶用试剂P1(EDTA、DNA抑制酶)10ml悬浮菌后混合摇匀，均装在20个管中，-20度保存(保证每次抽提质粒时所用菌液相同)。每次取两管做大量抽提质粒实验，做十次。每次取出两管后先解冻0.5时，至菌液变为液体时两管中各加入P2(NaOH∶SDS∶纯水＝1∶1∶8)10ml轻微摇匀几下后放置几分钟至裂解充分(菌液呈半透明)，然后加入P3(乙酸钾)10ml摇动使混匀，此时产生大量白色蛋白沉淀，放置冰中15分钟后再用力振荡至混匀，最后两管平衡后5000rpm离心30分钟后取上清液。

步骤2，质粒DNA的纯化。

取两支QIAGEN2tip2500纯化柱，依照其说明书所述步骤进行：30mLQBT液平衡柱床，然后将上述上清液分别加入到两纯化柱内。待上清液完全流经柱体后，加20mLQC液洗柱两次。15mLQF液洗脱DNA至放有0.7倍体积(10.5ml)异丙醇的管中，放置-20度中过夜。第二天取出，两管平衡后5000rpm离心30分钟后用小心吸去上清。400u170％乙醇洗涤沉淀三次至1.5ml离心管中，12000rpm离心10分钟，吸去上清后室温干燥沉淀，最后用水溶解质粒DNA所形成的沉淀。

步骤3，纯化柱再生。

根据阴离子交换树脂的再生原理[2]，对两柱子做好标记，每次大抽回收时分别用1M HCl(方法1)、3M NaCl(方法2)，30ml/次洗脱上述使用过的纯化柱两次，然后分别浸泡在盛有1M HCl、3M NaCl的管中封口膜封口，浸泡24-48h，再次使用时用去离子水(MQ)30ml/次，洗涤五次至流出液为中性。再用QC液30ml/次，过柱一次(洗脱蛋白等杂质)。QBT液30ml/次，过柱一次(平衡柱子)，此柱即可再次使用，方法同前述。

步骤4，鉴定回收是否彻底。

PCR、电泳法：再次使用两柱子时，当再次做大量抽提质粒前使两柱子过QF液各两次，按上述收集质粒方法各收集两次后与之前收集的质粒(稀释到50ng/ul)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳法比较看是否含有质粒。

步骤5，质粒DNA的纯度、含量测定及鉴定。

紫外分光光度仪测定两方法回收的柱子每次提取的样品DNA的OD260/OD280比值：水溶后的样品取6ul加入到594ul灭菌水中，稀释100倍后拿到紫外分光光度仪测定OD值，根据1ug/ul＝OD260值×5，将质粒稀释至1ug/ul，再根据加水体积即总体机，算产量(产量＝浓度×体积)。

两方法回收的柱子十次提取的质粒取1ug跑琼脂糖凝胶电泳看条带。

表1为两方法回收的柱子所提取的质粒产量变化，通过表1可以看出十次产量变化不大；

表2为两方法回收的柱子所提取的质粒产量变化，可以看出水溶后纯度变化在允许的范围内。

表1，两方法回收的柱子所提取的质粒产量变化

表2，两方法回收的柱子所提取的质粒纯度变化(OD260/OD280)

通过上述两个表格基本可以看出，本发明的实施例很成功，达到了预期的目标，找到了新的更彻底的回收方法，避免了由于再生不彻底所造成的质粒交叉污染现象。使得纯化柱得以再生至少10次，成本降低至原价的1/10，从而使质粒纯化试剂盒可以被更广泛的接受。

Claims

1.一种质粒提取纯化柱的回收方法，其方法如下：

步骤2，质粒DNA的纯化。取纯化柱，30mLQBT液平衡柱床，然后将步骤1制取的上清液加入到纯化柱内。待上清液完全流经柱体后，加20mLQC液洗柱两次。15mLQF液洗脱DNA至放有0.7倍体积(10.5ml)异丙醇的管中，放置-20度中过夜。第二天取出，两管平衡后5000rpm离心30分钟后用吸去上清。400ul70％乙醇洗涤沉淀三次至1.5ml离心管中，12000rpm离心10分钟，吸去上清后室温干燥沉淀，最后用水溶解质粒DNA所形成的沉淀。