CN102219830A - 一种抗氧化多肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗氧化多肽及其制备方法，该方法以鲨鱼皮胶原蛋白为原料，通过对酸性蛋白酶的酶解，分离纯化得到特异性抗氧化多肽，其分子量在902Da，其氨基酸全序列为：Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly。本发明消除了天然抗氧化剂所具有的缺陷并且消除了公众对人工合成抗氧化剂的忧虑，为开发基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。

Description

一种抗氧化多肽及其制备方法

技术领域

本发明提供了一种抗氧化多肽及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

生物分子的氧化是一个自由基介导的过程，它会对食品和生物系统造成许多不利的影响。在好氧器官内，与动脉硬化、癌症等多中疾病相关的游离自由基会不可避免地随着氧代谢的过程而产生。在食品中，食品营养成分的氧化会产生过氧化物，其不仅会影响食品的营养价值，引起食品品质下降，严重的甚至还会导致摄入者的身体发生疾病。因此，寻找安全的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。由于BHT、TBHQ等化学合成抗氧化剂比天然抗氧化剂具有更好的效果和更便宜的价格，因此其已经被广泛应用于食品行业中。但是，目前有研究发现合成抗氧化剂对人体肝、脾、肺等器官具有蓄积性致癌作用，从而引起了人们对其安全性的担忧，并且开始逐渐限制其在食品中的使用。于是人们把目光转向天然抗氧化剂。α-生育酚是一种被最普遍使用的天然抗氧化剂，它能有效保持食品中油脂的稳定性，但是却不利于食品保存。因此，我们有必要寻找一种其它来源的安全的天然抗氧化剂。

现有的研究发现，很多不同来源的水解蛋白都具有一定的抗氧化能力，如酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料种子蛋白、小麦醇溶蛋白和玉米蛋白等的水解物都具有一定的抗氧化性。虽然多肽发挥抗氧化活性的机理还不是特别清楚，但是有报道称某些芳香族氨基酸和组氨酸起到了重要作用。国内外的研究发现，胶原蛋白来源的肽比其它蛋白源肽具有更高效率的抗氧化性。而鱼皮中胶原蛋白占总蛋白质的80%以上，从获得胶原蛋白的效率来看，鱼皮是获得胶原蛋白的重要来源。明胶中富含疏水性氨基酸以及其它与脂类具有较高亲和性并且可以形成稳定乳化体系的氨基酸，故被认为是制备抗氧化多肽的良好原料。因此，如何从明胶中获得具有特定氨基酸序列的高效抗氧化多肽就成为迫切的研究方向。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种抗氧化多肽及其制备方法，使抗氧化活性得以高效地实现。

本发明的一种抗氧化多肽，氨基酸序列为Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly。

本发明还提供了一种抗氧化多肽的制备方法，以鲨鱼皮为原料提取胶原蛋白，然后采用酸性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽；所述酶解条件为：pH为3.0、温度50℃、酶解时间为5h、酶-底物配比为3000U/g；所述酶为酸性蛋白酶。所述分离纯化的手段包括超滤、SP-Sephadex C-25离子交换色谱、Sephadex G-50分子筛和RP-HPLC反相高效液相色谱。

所述分离纯化的具体步骤为：

（1）酶解产物首先利用分子量截留范围为8000Da和3500Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于8000Da的组分、分子量介于3500Da和8000Da的组分、分子量小于3500Da的组分；（2）收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱进行分离，上样后洗去未吸附组分，再以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，在225nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（3）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，在225nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（4）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色谱进行进一步的分离，反相HPLC的分离以含0.1%（体积）三氟乙酸的浓度梯度为5%～40%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1mL/min，检测波长为215nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集得到抗氧化活性最高的三个组分；（5）利用RP-HPLC反相高效液相色谱对三个组分进行鉴定，以含10mM乙酸铵的浓度梯度为5%～27.5%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为20μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm，三个组分均分别分离得到单一的峰，即得到三个纯的活性组分；利用蛋白质固相序列分析仪鉴定三个肽的氨基酸序列，得到本发明的抗氧化多肽的氨基酸序列为：Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly。

为了实现上述方案，本发明采取的具体步骤如下：

(1)       胶原蛋白的提取

本发明所采用的鲨鱼皮为市售。

鲨鱼皮经水洗3次以除杂，然后捣碎(长度<1cm)，再用0.1mol/L的NaOH溶液（料液比w/v=1:6）在4℃下浸泡24h。水洗至中性后沥干水分，再加入0.03w%的HCl溶液（料液比w/v =1:6），在4℃下浸泡4h后再水洗至中性。最后，加入蒸馏水（料液比w/v =1:6），60℃水浴6h，经过滤、浓缩和冷冻干燥后得到胶原蛋白。

(2)       胶原蛋白的酶解

酶购自福州福大百特生物试剂公司（中国·福州）。

采用酸性蛋白酶酶解鲨鱼皮胶原蛋白，蛋白浓度为30mg/ml，酶解条件取pH为3.0、温度50℃、酶解时间为5h、酶与底物比为（3000U/g），用2M HCl调节pH稳定，水解5h后，沸水浴中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液备用。

(3)       酶解产物的分离、纯化

将得到的酶解产物利用分子量截留范围为8000Da和3500Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于8000Da的组分、分子量介于3500Da和8000Da的组分、分子量小于3500Da的组分；收集具有最佳抗氧化活性的组分，再经过SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱（长20cm，直径1.6cm）进行分离，以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min；收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50（长100cm，直径2.6cm）凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，反相HPLC的分离以含0.1%三氟乙酸（体积）的浓度梯度为5%～40% 的乙腈溶液进行梯度洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm，收集得到抗氧化活性最高的三个组分。

(4)       抗氧化多肽的鉴定

利用RP-HPLC反相高效液相色谱对三个组分进行鉴定，以含10mM乙酸铵的浓度梯度为5%～27.5%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为20μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm，三个组分均分别分离得到单一的峰，说明得到三个纯的活性组分，进一步鉴定肽的氨基酸序列。

(5)       抗氧化活性的测试

利用DPPH（1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）自由基清除率测定法研究抗氧化多肽。配制浓度为1×10^-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。将2ml，0.1mM 的DPPH无水乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解样品的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517 nm处测定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越强。

清除率(%)=〔1- (A_i- A_j)/A₀〕×100%

式中，A₀为未加样品的DPPH溶液的吸光值即2 mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2ml的样品溶剂，空白对照的吸光值；A_i为加完样品后的DPPH溶液的吸光值即2ml，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的样品的吸光值；A_j为DPPH溶液的溶剂和样品混合后的吸光值即2ml的无水乙醇+2 ml的样品的吸光值。

(6)       氨基酸序列测定

利用蛋白质固相序列分析仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定本发明的抗氧化多肽的氨基酸全序列为Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly，分子量为902Da。

本发明透过目前天然抗氧化剂的缺陷以及公众对人工合成抗氧化剂的忧虑，立足于寻找一种天然高效的抗氧化剂，以来自于鲨鱼皮的胶原蛋白为出发点，着眼于通过酸性蛋白酶的切割条件控制，切割为具有特定的肽链长度和结构域组成的活性多肽，而使抗氧化活性得以高效地实现。

本发明改变了现有抗氧化剂的提取与运用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化剂所可能引起的副作用，是一种天然抗氧化剂，可以取代传统的合成食品抗氧化剂。并且本发明还改善了我国对水产动物皮中胶原蛋白利用率偏低的情况，既可解决大量水产资源的再利用问题，又能解除消费者对抗氧化剂在食品安全方面的顾虑，对科技、经济和食品业的发展将具有深远的意义。

附图说明

图1为胶原蛋白酶解物经超滤分离后的DPPH自由基的清除效果；

图2为胶原蛋白酶解物的SP-Sephadex C-25洗脱图；

图3为SP-Sephadex C-25四个色谱分离组分对DPPH自由基的清除效果；

图4为组分B的Sepadex G-50洗脱图；

图5为Sepadex G-50洗脱组分对DPPH自由基的清除效果；

图6为组分B-Ⅲ的RP-HPLC洗脱图；

图7为B-Ⅲ的RP-HPLC纯化组分的DPPH自由基清除活性；

图8为抗氧化多肽B-Ⅲa的RP-HPLC鉴定图； 

图9为抗氧化多肽B-Ⅲc的RP-HPLC鉴定图；

图10为抗氧化多肽B-Ⅲd的RP-HPLC鉴定图；

图11为纯化的抗氧化多肽B-Ⅲd清除DPPH自由基的“量-效”关系曲线。

图12为纯化的抗氧化多肽B-Ⅲd清除ABTS自由基的“量-效”关系曲线。

图13为纯化的抗氧化多肽B-Ⅲd抑制Fe²⁺诱导卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化反应的“量-效”关系曲线。

具体实施方式

本发明的抗氧化多肽的氨基酸序列为Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly。

制备方法如下：

以鲨鱼皮为原料提取胶原蛋白，然后使用酸性蛋白酶对其进行酶解，蛋白浓度为30mg/ml，酶解条件是：pH为3.0、温度是50℃、酶解时间为5小时、酶-底物配比为3000U/g；将得到的酶解产物利用分子量截留范围为8000Da和3500Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于8000Da的组分、分子量介于3500Da和8000Da的组分、分子量小于3500Da的组分；收集具有最佳抗氧化活性的组分，再经过SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱（长20cm，直径1.6cm）进行分离，以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，在225nm下进行测量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50（长100cm，直径2.6cm）凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，反相HPLC的分离以含0.1%三氟乙酸（体积）的浓度梯度为5%～40% 的乙腈溶液进行梯度洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm，收集得到抗氧化活性最高的三个组分。经RP-HPLC反相高效液相色谱进一步鉴定，得到三个纯的活性组分。

本发明采用的仪器、检测手段如下：

本发明应用超滤、SP-Sephadex C-25离子交换色谱、Sephadex G-50凝胶过滤色谱、RP-HPLC反相高效液相色谱等多种分离纯化手段，实现具有显著活性的抗氧化多肽的高效分离纯化。

利用蛋白质固相测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定纯化后的抗氧化多肽的氨基酸序列。

为了进一步了解本发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例：

实施例1

称取7.5克鲨鱼皮胶原蛋白用去离子水溶解并定容至250ml，然后用2mol/L HCl将其pH调节至3.0。先将该溶液水浴加热到50℃，接着再按照酶-底物配比为3000U/g的比例加入相应量的酶，酶解时间为5小时。接着在沸水浴中灭酶15分钟，冷却后再4000rpm离心15分钟。收集上清液备用。

将上清液用分子量截留范围为8000Da和3500Da的超滤膜进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于8000Da的组分、分子量介于3500Da和8000Da的组分、分子量小于3500Da的组分，并测定其抗氧化活性（如图1所示）。可以看出，分子量小于3500Da的组分具有最好的抗氧化活性。

收集分子量小于3500Da的组分，用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱（长20cm，直径1.6cm）进行再进一步的分离，以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，洗脱峰在225nm下进行测量，见图2。收集各峰并测定抗氧化活性（如图3所示）。可以看出，组分B具有最好的抗氧化活性。

将分离出来组分B用Sepadex G-50凝胶过滤色谱（长20cm，直径1.6cm）再进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在225nm下进行测量，见图4。收集各峰并测定抗氧化活性（如图5所示）。可以看出，组分B-Ⅲ具有最好的抗氧化活性。

将分离出来的组分B-Ⅲ利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离（如图6所示），洗脱液为含0.1%三氟乙酸（体积）的浓度梯度为5%～40%的乙腈溶液，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性（如图7所示），收集得到抗氧化活性最高的三个组分，分别为B-Ⅲa、B-Ⅲc和B-Ⅲd。

利用RP-HPLC反相高效液相色谱对分离得到的三个抗氧化多肽的纯度进行鉴定，以含10mM/L乙酸铵的浓度梯度为5%～27.5%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性梯度洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为20μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm，结果显示，其为单一的峰，说明其已经达到较高纯度（如图8、图9和图10所示）。

纯化后的抗氧化多肽B-Ⅲd具有很强的抗氧化能力，由图11、图12和图13可以看出，它清除DPPH自由基、ABTS自由基以及抑制脂质过氧化反应的半抑制浓度分别为100.27mg/ml、84.58mg/ml和219.52mg/ml。

   利用蛋白质固相测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. MA, U.S.A) 测定纯化后的抗氧化多肽B-Ⅲd的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列为：Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly（分子量为902Da）。

<110> 福州大学

<120> 一种抗氧化多肽及其制备方法

<160> 1

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 1

Gly Thr Met Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly

 1             5               10

 

Claims (4)

1.一种抗氧化多肽，其特征在于：所述抗氧化多肽的氨基酸序列为Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly。

2.一种抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：以鲨鱼皮为原料提取胶原蛋白，然后采用酸性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗氧化多肽；所述酶解条件为：pH为3.0、温度50℃、酶解时间为5h、酶-底物配比为3000U/g；所述酶为酸性蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的手段包括超滤、SP-Sephadex C-25离子交换色谱、Sephadex G-50分子筛和RP-HPLC反相高效液相色谱。

4.根据权利3要求所述的抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的具体步骤为：（1）酶解产物首先利用分子量截留范围为8000Da和3500Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于8000Da的组分、分子量介于3500Da和8000Da的组分、分子量小于3500Da的组分；（2）收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱进行分离，上样后洗去未吸附组分，再以含0～0.35mol/L NaCl的0.02mol/L、pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0.5ml/min，在225nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（3）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，在225nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性；（4）收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色谱进行进一步的分离，反相HPLC的分离以含0.1%（体积）三氟乙酸的浓度梯度为5%～40%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1mL/min，检测波长为215nm，测定各吸收峰对应的洗脱液的抗氧化活性，收集得到抗氧化活性最高的三个组分；（5）利用RP-HPLC反相高效液相色谱对三个组分进行鉴定，以含10mM乙酸铵的浓度梯度为5%～27.5%的乙腈溶液作为洗脱液进行线性洗脱，所用色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为20μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm，三个组分均分别分离得到单一的峰，即得到三个纯的活性组分；利用蛋白质固相序列分析仪鉴定三个肽的氨基酸序列，得到如权利要求1所述的抗氧化多肽的氨基酸序列为：Gly-Thr-Met-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg-Gly。

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