CN102216471A - 膀胱癌的尿检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及膀胱癌的诊断，且更具体涉及在移行性膀胱癌尿样品中检测。本发明的检测方法能使，通过利用为此目的设计的DNA芯片，测定检测的肿瘤等级。

Description

膀胱癌的尿检测方法
本发明涉及膀胱癌的诊断及更具体涉及移行性膀胱癌(TCC：翻译性细胞癌)的尿检测。
在移行性上皮肿瘤中见到移行性癌，其包括大致70％～90％的上皮膀胱肿瘤。它们的特征在于它们的大的形态学存活力，从而它们的预后有时难以预测。
组织学中，膀胱上皮肿瘤可为乳头或非-乳头性的高或低恶性肿瘤(组织级)，浸润或非浸润，各损伤是这3种形态学特征的组合的结果。
有几种膀胱的膀胱上皮肿瘤分类。迄今通常使用的多数分级是WHO的分级，其可追溯到1974年。其将上皮移行性癌分类为良性(外生性乳头瘤，内繁性乳头瘤)或恶性(1，2及3级移行性上皮癌)。在1998年，下列几个解剖病理学家，泌尿学家，癌学家及生物学家参与的会议，建立及确认了达成共识的膀胱上皮肿瘤分级。其为目前使用的新分级(Epstein J.I.，Am.J.Surg.Pathol.(1998)，22：1435-1448)。尽管仅稍微不同于之前的WHO分级，其在与膀胱上皮肿瘤生物学及发育潜力一致方面具有优势。
此分级后，根据不同的细胞形态学标准将膀胱肿瘤通过″级”分类为G1～G3。级越高，细胞表观越少分化，及越呈攻击性。
根据表面特征(pTa及T1)或肌肉中的侵袭性将肿瘤也分类(T2～T4)。低-级肿瘤通常是非-侵袭性或浸润浅层(阶段Ta及T1)，然而高-级肿瘤更有攻击性及常在T1或更晚期阶段检测到。
确定肿瘤细胞等级对于临床医师具有关键重要性，因其将辅助决定应使用哪种治疗性方法。
然而侵袭性3级肿瘤的存在要求膀胱及其副腺总消融，利用不同的治疗性方法(例如化学治疗，免疫治疗或BCG治疗)，多数低级/阶段肿瘤(Ta及T1)可通常局部处理，同时器官保持完整。
被低-级，非-侵袭性肿瘤感染的患者通常具有良好的预后，但由于癌复发危险程度是70％，必需周期性地随诊。随后，患者必需在治疗后定期监控，头2年是每3个月一次，及然后是每6个月一次，在复发的情况中，监控肿瘤进展非常重要。
而且，在仅10～15％的病例中，低-级Ta肿瘤侵袭肌肉，然而在30～35％的病例中，T1肿瘤过程到T2级。高-级肿瘤过程更快速，患者快速达到T2级，及在接下来的2年期间常形成远程转移。
目前，仅侵袭性临床检查(换言之，涉及活组织检查)导致肿瘤内窥镜检查可视化，或手术可致使进行肿瘤细胞等级的可靠的诊断，及实施适当的治疗。
而且，内镜检查有时不可靠及难以解释。至于活组织检查后的细胞学，各研究显示其可靠性中等，导致50％的肿瘤的错误检测(Boman，H.，et al.，2002，J.Urol.，167(1)：80-83)。
考虑到人群中(尤其是超过50岁的人中)膀胱癌的高发病率，及以改善患者的诊断及舒适性为目的，已投入可观的研究努力以开发膀胱癌的非-侵袭性，间接检测。
有关此，几个研究小组尝试利用尿样品使用常规肿瘤标记物蛋白检测泌尿学肿瘤。
不过，直到现在，这些蛋白的检测尚未发现足够特异性，以在蛋白来源及肿瘤发展阶段方面可靠。
在1999年，一个美国小组描述了通过分析含于尿的微卫星DNA序列来跟踪膀胱癌进展的可能性(Steiner et al.(1997)NatureMedicine 3：621-624)。此检测方法(其在于扩增及测量一些重复的、非编码线粒体DNA序列的变异性)基于这些序列通常在癌细胞中改变的观察。
不过，此技术不完全令人满意，因为其不有效致使测定肿瘤等级。
其他分子方法基于(其企图扩增或检测遗传标记物(例如肿瘤抑制基因中的局部突变))应用到存在于患者尿中的DNA的PCR方法。但是，这些方法要求包括20～40个核苷酸的特异性起始子，其从尺寸及人基因组的变异性来看不利于开发。此外，只要在尿中将肿瘤细胞DNA与健康细胞DNA混合，期望的扩增被后者掩盖。
由于采用移行性膀胱癌的不同的已知的遗传标记物困难，发明人更愿意使用基于同时检测TCC细胞中常遇到的几种遗传异常的创新性的方法。
对于此目的，它们列出了移行性膀胱癌中遇到的主要遗传异常，然后选定那些最有代表性的肿瘤细胞等级。此方法中，它们特别处理由染色体物理改变构成的遗传异常，例如，一般从肿瘤细胞核型分析得到的倍数或缺失。它们然后开发了能同时检测从含于患者尿的DNA选定的遗传异常的存在或缺乏创新性的工序。
更尤其，发明人选定了提供显著的荧光信号的25种人染色体座位的特异性阵列(使用关于从尿样品提取的总DNA的基于阵列的染色体杂交比较性分析技术)。
直到现在，尚未可用基于提供相同的特异性及灵敏度水平，及也能够明显区别低和高级肿瘤的尿样品的测试(Budman Ll.et al.，2008CLMJ 2(3)：212-221)。
此方法具有无需膀胱手术检查而诊断膀胱移行性癌细胞存在的惊人的能力，同时提供这些肿瘤细胞等级的良好的指示。
【附图说明】
图1：实施例中根据通常临床标准分析的肿瘤等级分级。
图2：作为使用内镜检查及细胞检查得到的结果的函数的在实施例中分析尿的患者的分级。
【发明详述】
本申请旨在提供膀胱癌检测，更尤其膀胱癌尿检测的方法。
此检测通过患者的尿中的DNA总量的标记，及在此DNA中检测包括于座位的染色体序列(其可潜在地被遗传异常影响)来得到。
这些染色体序列(其为本发明的参照DNA)可潜在地在染色体座位缺失的情况中在它们所属的染色体中缺少，或例如在三体性的情况中倍增。
膀胱癌中的肿瘤细胞常是染色体重组的来源，指示细胞肿瘤特征的某些程度。但是，被此染色体重组影响的区潜在地是多个及程度可变。事实上，尽管一些座位(尤其是编码肿瘤抑制基因或涉及细胞周期调节的座位)更系统性地改变，当不总相同的同源区之间发生染色体内和染色体间重组时产生染色体异常。
根据第一实施方式，本发明首先旨在提供体外检测患者膀胱癌的方法，其特征在于，其包括一个或多个下列步骤：
在第一步骤(A)中，使用本领于技术人员已知的多种方法之一提取含于从所述患者获取的尿样品的DNA。如上所述，本发明有利地允许基于患者尿测定膀胱的癌性病情。此方法因此必需浓缩含于尿样品的DNA，其DNA以残留的状态存在，由于其部分从存在于膀胱的细胞来源。由于DNA不是高度脆的物质，其不必需采用剧烈测量，以便保存待分析的尿样品。样品可由此在患者家中获取。提取的DNA是完全的，是指其含存在于尿的整个可回收的DNA，无关其源自肿瘤细胞。
在下列步骤(B)中，将步骤(i)中提取的DNA(优选通过超声处理)片段化成具有基本上大于500碱基对(bp)，优选大于800bp，及更优选在1000和5000bp之间的尺寸的DNA片段。或者，DNA可利用酶(例如限制酶)消化。
在下列步骤(C)中，将得到的DNA片段利用第一标记试剂均匀标记，以形成标记的DNA库。由此，其是从尿提取的总标记的DNA。所谓″均匀″是指标记以非-特异性方式发生，从而2个相同的尺寸的不同的DNA片段以相同的强度标记。为获得所述标记，优选利用偶联于荧光团(将其在复制步骤过程期间导入DNA)的核苷酸。此体外酶促复制步骤可有利地增加DNA库中可用的标记的DNA片段的数拷贝。标记的DNA库优先包括具有随机切割的片段。
在下列步骤(D)中，从标记的DNA库形成至少一种等份，所述等份能形成，根据环境，整个标记的DNA库。然后使各等份与一种(及优选几种参照DNA)接触，各这些参照DNA的均对应于包括于可能被遗传异常影响的染色体座位的不同的DNA序列。所述遗传异常优选与膀胱癌的特定发展阶段及更尤其与例如上述阶段相关。参照DNA可例如，根据从科学文献获取的数据或根据活组织检查分析结果选择。
根据本发明，参照DNA包括长度1,000和200,000个碱基对(bp)之间的，优选长度2,000和180,000bp之间，及再更优选长度5,000和160,000bp之间的人染色体的DNA序列，例如从人基因组序列构建的BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)克隆中克隆的那些。所述BAC克隆描述于与人基因组相关的公众可接近数据库，例如CNBI或UCSC。
由此，然而其证明难以基于分离的标记物(尤其是对应于能使遗传扩增测试(PCR，TMA，等)进行的短遗传序列的标记物)诊断膀胱癌，本发明的检测方法基于使用通常大于600bp的DNA序列的检测方法。
发明人建立，优选使用序列包括在选自如表1中显示的下列人染色体座位之内的参照DNA：1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，1q22-q24，5p，6q22，7，11q13，12q15，13q，15，16，17q，6q25-q27，7q，8p，10q，11p，14q22-qter，17p，19及22。优选，本发明的方法涉及包含包括于存在于人染色体的各下列座位的DNA序列的参照DNA：1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，1q22-q24，5p，6q22，7，11q13，12q15，13q，15，16，17q，6q25-q27，7q，8p，10q，11p，14q22-qter，17p，19及22。
根据本发明，标记的DNA片段和参照DNA之间的接触在能使特异性杂交的条件下，及优选在例如本申请实验部分中描述的严格条件下进行。
平行于步骤(D)，步骤(E)在于制备从一个或几个不患膀胱癌的个体获取的对照DNA库。理想情况下，此DNA源于从从人群随机选择的几个未被癌影响的个体获取的尿样品。其也可能使用商业制备的，人参照DNA。对于从患者的尿提取的DNA的情况中，对照DNA利用第二，优选荧光，标记物均匀标记。此标记物优选与用于标记患者的DNA的标记物不同。
在步骤(D)中，使一等份的标记的对照DNA与选定的参照DNA接触，其同于步骤(D)中使用的那些。此接触操作可在与步骤(D)中使用的那些相同的杂交条件下独立地或合起来进行。当接触操作合起来进行时，此暗示患者的DNA及对照DNA，优选同时，均与相同的参照DNA接触。
在下列步骤(F)中，除去在步骤(D)及(E)中不特异性地与参照DNA杂交的标记的DNA片段。此洗涤非-杂交的DNA的步骤根据本领域中已知的过程进行，无需任何特定困难。
在下列步骤(G)中，测定由与选定的参照DNA的每一个杂交的标记的片段产生的信号强度。类型及信号强度取决于使用的标记物类型。当使用的第一及第二标记物具有相当的强度时(例如酞菁3及5的情况中)，患者的DNA及对照DNA之间观察的变化直接与位于各参照DNA的杂交的DNA片段的量相关。
在下列步骤(H)中，对各参照DNA测定从患者的DNA和从对照DNA记录的信号之间的偏差。
根据本发明的优选的实施方式，将在步骤(C)中从患者获取的DNA片段分为2库，一个使用第一标记物标记，及另一个使用第二标记物第二标记。将来自步骤(D)的对照DNA片段也分为2库，一个使用第一标记物标记，及另一个使用第二标记物标记。用此过程，可用第一标记物及然后用第二标记物测定信号偏差的交叉-确定。如果对照DNA和患者的DNA之间观察的偏差为相同量级，无关标记物使用，此指示显著的偏差。
在下列步骤(I)中，从之前步中观察的偏差推导患者的癌阶段。由此，根据本发明，得到越大的偏差数，膀胱癌检测越精确。此外，偏差提供涉及的肿瘤阶段的定性指示，尤其是当同时采用指示肿瘤等级的几个座位时。
或者，如果座位被认为是肿瘤细胞恶性肿瘤的高度代表性的标记物，可从相同的座位选定几种参照DNA，以便确证源于此座位的结果。
根据本发明的方法由此，在步骤(I)中，能使几种参照DNA比较，及建立遇到的遗传异常的扩展的表。此步骤期间，其可然后发现对于衡量对各参照DNA得到的结果有用，以便考虑，例如，在给定阶段的肿瘤，在选定的座位找遗传异常的概率。当将几种参照DNA用于检测相同的座位上的异常，其也可能衡量对于参照DNA得到的偏差，由此考虑相对其他显示的座位的权重。此加权，或常数的使用，以便设定不同的座位之间的相关性，可用于设计能使基于步骤(H)期间收集的数据测定″理论阶段″的算法。
以上方法可总结为体外检测患者膀胱癌的方法，其特征在于，其包括下列步骤：
(i)提取含于从所述患者获取的尿样品中的DNA；
(ii)将步骤(i)中提取的DNA片段化；
(iii)用标记试剂均匀标记得到的DNA片段，以形成标记的DNA库；
(iv)从所述标记的DNA库形成至少一种等份及使各等份与一组参照DNA接触，所述接触在允许标记的DNA片段与所述参照DNA的特异性杂交的条件下进行；所述参照DNA包括包含于存在于人染色体的各下列座位的DNA序列：1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，1q22-q24，5p，6q22，7，11q13，12q15，13q，15，16，17q，6q25-q27，7q，8p，10q，11p，14q22-qter，17p，19及22；
(v)消除不特异性地与参照DNA杂交的标记的DNA片段；
(vi)测定由与选定的参照DNA的每一个杂交的标记的片段产生的信号强度；
(vii)对各参照DNA，测定得到的信号相比用对照DNA从健康患者得到的信号之间的偏差；
(viii)从所述观察的偏差推导患者的癌阶段。
优选被本发明的参照DNA覆盖的座位总结于表1。
参照DNA对应于包括于NCBI引用的相应序列的一个或几个序列(各染色体的基因组序列上的起点及端点位置)。
表1
参照DNA的定位
  染色体定位   基因组序列的起点   基因组序列的端点
  1p   20365560   113105490
  3q   123351123   182149547
  8q22-qter   95030146   143909236
  20   151454   57934415
  5p12-p13   1771703   9682916
  9p   14010384   37091069
  9q   70785194   137897571
  18q12   33436616   40743026
  1q22-q24   154902972   158452461
  5p   1771703   9682916
  6q22   109464089   111511071
  7   3863510   158689815
  11q13   65805698   73155080
  12q15   55617597   78745914
  13q   25467720   99788952
  15   25650963   97412048
  16   267091   88643457
  17q   26415272   77690512
  6q25-q27   160256061   170536116
  7q   62015315   158689815
  8p   345303   38886999
  10q   42335633   135251915
  11p   399850   44925329
  14q22-qter   72026416   106339461
  17p   7436433   21191536
  19   9998870   54262315
  22   20487250   48028036
相关座位的特征可进一步定义如下：
3p：具有涉及多种癌的形成的几种候选基因的区。
4：在肿瘤过程相比其起始涉及更多的区。此区中已描述靶向其他癌性的病理的肿瘤抑制基因。
5p12-p13：涉及肿瘤进攻性，尤其是转移性扩展的区。
6q：涉及侵袭肌肉的高-级肿瘤的区。注意到基因M6P/IGF2R是在6q26-q27座位中的遗传指示物。
8p：在高级侵袭性肿瘤中常缺失的区(尤其8p21-pter)，其包括肿瘤抑制基因：EXTL3，WRN及PRLTS。
9p或整个9：常在早期受影响的区。p16/MTS1/CDKN2A/INK4A及p15/MTS2/CDKN2B基因是细胞周期进程中的强的激酶抑制剂。常在pTas中受影响，p16是依赖于Rb的抗-癌基因，如将在下文讨论的。INK4A尤其是可对p53的控制点发挥作用。
10q或整个10：最小的10q11-q21及10q24-q25区：涉及许多其他癌(淋巴瘤，前列腺，结肠)。此区包括多种肿瘤-抑制基因。10q缺失可为导致不正确的预后的因素。
11p：对应于肿瘤进攻性的区，四倍性的可能的方向中的第一阈值。缺失可影响KAM基因(11p11.2)的表达，其是转移-抑制基因。EXT2，WT1，TSG101及TSSC5基因也涉及其他癌。
13q14：对应于癌的高等级及阶段中的RB1的区，RB与P53互作。RB的灭活通过调控S期的起始来辅助肿瘤进展。在q14座位外侧可涉及其他基因，由此解释通常检测到更广泛的缺失。
14q22-qter：呈现与肿瘤进展相关的区。可通过不平衡的转位导致缺失。在此座位存在至少一种肿瘤-抑制基因。
16q：与肿瘤进展相关的区。CDH1编码E钙粘蛋白，从而缺失导致肿瘤细胞的临床及生物学进攻性。另一基因编码H钙粘蛋白，其正常抑制细胞生长。
17：缺失的或突变的区，在晚期阶段出现，及与肿瘤进展而非起始相关。在17p13.1的p53的缺失导致遗传改变数的增加，由于P53蛋白的控制的缺乏。在17p13.1也可涉及HIC1基因。
18q 12或整个18：在肌肉-侵袭性肿瘤中一般改变的区(T2或更多)。Smad4/DPC4及Smad2/MADR2/hMAD2/JU18-1对RB及p15通过灭活它们发挥作用。
1q22-q25：对应于Ta和T1之间的转变的扩增的区。P73常过表达，从而通过此区中的复制潜在地改变。
3q23-q24-q25-q26-qter：已鉴定为倾向于改变的区，尽管其涉及尚未被证实。
Isochrome 5p(5p获得及相关的5q损失)：通过原-癌基因的活化改变的肌肉侵袭肿瘤中的区。
6p22：由于原-癌基因的可能的存在，可与肿瘤侵袭相关的扩增的区。
7：在7p14-p21包括ERBB1/EGFR基因的区，编码EGF(表皮生长因子)受体，其在细胞生长中起作用。在7q31，cmet基因编码另一生长受体，HGF/SF(肝细胞生长因子/散射因子)。这些区呈现涉及肿瘤的混乱的细胞生长。
8q：通过在8q22-q23区癌基因的存在而常涉及Ta-TI转变及向侵袭性及尤其转移性肿瘤进展的区。
10q22-q23：罕见扩增的区，及更通常缺失(见以上)。
11：至少有控制进入细胞周期的CCND1基因的11q13条带扩增。CCND1在许多癌中活化，但似乎与癌进展具有少的相关性。此扩增将确定与早期癌生长阶段的关系。
12q15：含MDM2基因的区，其在一些肿瘤中与p53相互作用，以便通过掩盖其活化位点抑制其作用。
13q33-q34：可能的三体性13，偶尔见于膀胱肿瘤，可导致此可能含原-癌基因的区的复制。
17q：在17q21包括ERBB2基因的通常复制的区。此异常在高等级及阶段更普遍，或与复发相关。
18q11：识别为一些罕显著的扩增的区。
20：共同的区，最常局限于20q座位。在20q11-q12座位存在熟悉形式的癌原-癌基因。在20q13，STKIS/BTAK编码诱导染色体不稳定性的蛋白。
根据本发明的优选的方面，体外膀胱癌检测方法涉及基于一种，几种，或全部下列座位测试患者的尿细胞的DNA倍数：1q22-q24，5p，6q22，7，11q13，12q15，13q，15，16，17q，6q25-q27，7q，8p，9p，9q，10q，11p，14q22-qter，17p，18q12，19及22。
根据本发明的替代性实施方式，所述方法涉及在患者的尿细胞中就一个或几个下列座位测试DNA倍数：
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12及17p；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p及11p；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p及7q；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q及1q22-24；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24及11q13；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13及8p；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p及14q22；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22及22；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22及5p；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22，5p及6q22；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22，5p，6q22及7；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22，5p，6q22，7及12q15；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22，5p，6q22，7，12q15及15；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22，5p，6q22，7，12q15，15及6q25-q27；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22，5p，6q22，7，12q15，15，6q25-q27及19；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22，5p，6q22，7，12q15，15，6q25-q27，19及13q；
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22，5p，6q22，7，12q15，15，6q25-q27，19，13q及16；及
-1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，17p，11p，7q，1q22-24，11q13，8p，14q22，22，5p，6q22，7，12q15，15，6q25-q27，19，13q，16及17q。
本发明的进一步方面涉及从以上指定的25个座位获取的一种或更参照DNA的用途，以便测定肿瘤的级及进攻性。
优选，对于实施方法有用的不同的参照DNA的数介于2和500之间，优选10和400之间，及再更优选50和400之间。
在这方面，本发明也涉及DNA微阵列或芯片，对于膀胱癌的尿检测更尤其有用，其特征在于，其在其表面包括多个彼此不同的参照DNA沉积物，这些沉积物的每一个对应于包括于一个或多个以上描述的座位的序列。此DNA微阵列或芯片，优选为玻璃载玻片，允许本发明的方法在还原的表面区上方实施，由此能使就一个，几个或全部上述座位同时比较健康DNA的正常二倍体状态中患者的DNA的单倍体或多倍体状态。
根据本发明的所述用于检测膀胱癌的DNA微阵列优选特征在于，其在其表面包括10和1000之间个参照DNA沉积物，所述参照DNA包括包括于人染色体的以上座位的每一个的序列：1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，1q22-q24，5p，6q22，7，11q13，12q15，13q，15，16，17q，6q25-q27，7q，8p，10q，11p，14q22-qter，17p，19及22。优先，各参照DNA沉积物包括包括于人染色体的以上座位的序列。
根据之前描述的方法，根据本发明的DNA微阵列在理想情况下如上定义的在其表面包括10和1000之间，优选10和400之间个DNA，及更优选300和400之间个参照DNA沉积物。就基因组范围的分析，沉积物的数相比基因组微阵列减少，以消除背景噪声。发明人认为此数就改善关于膀胱癌的检测的测试灵敏度而言是最佳的。
DNA芯片是指平的玻璃，硅或塑料基材，在其上放置已知的核苷酸DNA序列，例如本发明的参照DNA。
优选，根据本发明，放于DNA芯片上的参照DNA包括仅在座位(在其上已描述与膀胱癌相关的染色体异常)，及优选在本申请中描述的一个，几个或全部座位包括的DNA序列。
本发明也涉及含一个或多个下列元件的试剂盒：
●将前述一个或多个本发明的参照DNA优选以DNA芯片或微阵列形式附着到玻璃基材上；
●从健康患者获取的DNA对照样品；
●如前所述的总DNA标记物试剂；及
●能使患者的DNA的二倍体状态和待分析的对照DNA的正常二倍体状态之间的比较的软件程序。
将所述试剂盒优选包入盒子中，例如以内包实施本发明的方法需要的全部管，瓶及试剂。
在下列非-限制实施例中提供本发明的进一步特征及优点：
【实施例】
【I-玻璃载玻片的制备】
借助公共数据库(UCSC及NCBI)，选定一系列BAC克隆(来自人基因组的DNA部分)以覆盖表1中所列的选择的标记物。通过测序克隆的DNA的2个端点来确认这些克隆的位置，以便确证基因组中所述DNA序列的确切的位置。这些克隆的每一个形成本发明揭示的参照DNA。
总体选定的克隆涵盖选择为标记物的全部染色体座位，制备总341个BAC克隆。
从BAC提取DNA，及使用repliG技术扩增(Qiagen，德国)。放置各DNA，以在PCR板中形成341孔，各含10μg的纯化的DNA。利用生物机器人及4个针，将DNA以非常小的量放置在玻璃载玻片上。由ArrayGenomics生产的设计合并能使进行成对实验作为预防的2个杂交区。将各DNA随机放入各杂交区5次，以便获得5个独立性测量。
然后将DNA化学固定到玻璃载玻片，能使其保存3～6个月。
【II-膀胱肿瘤的遗传特征】
收集冷冻的肿瘤。使用商业试剂盒提取这些肿瘤的染色体DNA。被认为″低级″的肿瘤在阶段pTa/G2。被认为″高级″的肿瘤至少在阶段pTa/G3，pT1及pT2。根据标准临床标准分类肿瘤(图2)。
通过荧光计(QuBit系统，Invitrogen)定量从冷冻的肿瘤提取的DNA。
用于实施诊断性方法的用作对照样品的人基因组DNA是商业DNA(promega，人基因组DNA)。
【III-DNA标记及与参照DNA杂交】
【整个DNA的标记】
(1)在55μl eppendorf管中使用超声处理器(Elmasonicsonicator)将2.3μg的对照DNA通过超声处理片段化12～13秒钟。
(2)通过在0.8％琼脂糖凝胶上电泳来检查通过此手段制备的200～300ng的DNA，以便确证DNA正确片段化，及多数片段具有大于600bp的尺寸。
(3)在微-柱(NucleospinExtract II)中纯化片段。
(4)将25μl(～1μg)等份的纯化的DNA及对照DNA放入离心管，用于用Cy5及Cy3荧光团标记。
(5)将20μl的随机序列引物(管1，Enzo试剂盒)加入各管，然后涡旋及离心。
(6)将管于99℃水浴中温育10分钟。
(7)将管放入冰中5分钟，然后短暂离心及放回冰中。
(8)将5μl的用花青苷标记的核苷酸混合物加入各管(管2或3，Enzo试剂盒)。
(9)进一步添加1μl的Klenow酶片段(管4，Enzo试剂盒)。
(10)在热块中温育混合物3小时及于37℃30分钟。
(11)添加5μl的停止缓冲液(管5，Enzo试剂盒)后，将管放置于冰上。
【标记的DNA的洗涤】
(12)将200μl的NT缓冲液/100μl的DNA加入管。
(13)各管的内容物将转移到柱，及然后以11,000g离心1分钟。
(14)将600μl的NT3洗涤缓冲液放入各柱，及然后以11,000g离心1分钟。
(15)将柱以11,000g离心2分钟。
(16)将51μl的无菌水放置在柱顶部1分钟。
(17)将柱以11,000g离心1分钟，及在管中回收溶解的标记的DNA。
【杂交之前DNA的制备】
(18)将50μl的Cot-1DNA(Roche)加入各管。
(19)使用0.3M的乙酸钠(pH5～8)将体积调整到200μl。
(20)添加300μl的冷冻的乙醇。
(21)涡旋混合物及然后于70℃避光温育15分钟。
(22)将管以11,000g在4和8℃之间离心15分钟。
(23)使用真空泵除去上清。
【玻璃载玻片上的BAC制备】
将以BAC克隆形式的DNA在玻璃板上放入脱水形式，然后固定使用敏感于UV光照(350mJ)的交叉-连接试剂。
【标记的DNA/参照DNA(BAC)的杂交】
(24)将在点23中回收的残基加入5μl的ddH2O。
(25)将10μl的50μg/μl的tRNA酵母(Invitrogen，Cat#15401～011)及混合物搅拌及加热到95℃5分钟。
(26)添加预加热至70℃的15μl的杂交缓冲液(Ambion载玻片Hyb缓冲液#3)。
(27)将混合物剧烈搅拌30秒钟及以13,000rpm离心30秒钟。
(28)将混合物加热到37℃持续30分钟。
(29)将玻璃载玻片用混合物整个覆盖。
(30)将清洁的Lifterslip叶(24×32英寸)(Erie Scientific，Cat#25X601-2-4789)放置在玻璃载玻片上，以覆盖微阵列。
(31)添加20μl的水，以便使增湿封件。
(32)将闭合的杂交室(Hybridization chamber，Corning，Cat#2551)于55℃浸入水浴16小时。
【杂交后洗涤】
(33)将玻璃板在0.1％SDS 0.1×SSC的第一溶液中于50℃温育。
然后将微阵列连续放入下列洗涤溶液中(在各溶液中，搅拌着持续45秒钟及不搅拌着持续45秒钟)：
(a)0.1×SSC，0.1％SDS；
(b)0.1×SSC，0.1％SDS；
(c)0.1×SSC；
(d)0.1×SSC；
(34)将玻璃载玻片于室温浸入填充有0.1×SSC溶液的标记箱，然后浸入填充有100％乙醇(CML，Cat#BVITRI-PPL25L)的另一箱中。
(35)然后将玻璃载玻片放入圆锥形50ml管，然后离心几秒钟至干燥。
(36)将玻璃载玻片避光保存。
根据标记信号的强度调节灵敏度地使用荧光扫描仪(GENEPIX4000B)分析玻璃载玻片。
使用图像分析软件BacMagic+(由ARRAYGENOMICS开发)分析结果以便以染料交换模式图像化特征。对于各DNA，由BacMagic+输出文本文件及格式化，从而其可被seeGH软件使用。基于BacMagic+中的染料交换对称的可视化注释缺失及获得。
使用seeGH，对各组，编译注释，以便产生检测的异常及它们的频度的总体图像。在这些图中，其类似于核型表，标记代表异常(红＝损失，绿＝获得)及它们的位置。标记尺寸代表患者库中它们的检测频度。
分析图2可根据其等级及阶段创建各肿瘤组的典型的特征，然后可将其与肿瘤组的典型的特征比较。
表2
分析检测的异常后可视化的获得
  条带   总克隆   阳性最小   pTa G2   pTa G3   T1   T2
  1q22-24   4   3   2   2
  3q   6   5   2   1
  5p   7   6   2
  8q22-ter   3   2   1   2   2   1
  11q13   7   6   2
  12q21-24   5   4   1
  15   8   6   1
  16   12   10   1   2
  17q   11   9   1
  18q   10   8   2
  20q11-ter   10   8   1
  20   14   11   1   2   1
表3
分析检测的异常后可视化的缺失
  条带   总克隆   阳性最小   pTa G2   pTa G3   T1   T2
  2q35-ter   2   2   1
  4q26-ter   7   6   1
  6q25-27   5   4   1   4   3
  8p   14   11   2   2   2
  9p   6   5   1   1
  9q   12   10   3   2   2   1
  10q   14   11   1
  11p   4   3   1   3
  11q23-25   5   4   1   1   1
  13q13   3   2   2   1
  13   7   6   1   1   2
  14q23-31   3   2   2
  17p   5   4   1
  17   16   13   1   1
  18q12   3   2   1   1
  18q 12-23   11   9   4
  19   4   3   1   1
从此总结中，其呈现pTaG2相比更高等级改变少得多。一些异常似乎是低-级肿瘤的特征。如文献中所述，也发现缺失9，似乎与起始更紧密相关，及常与pTas相关。在本情况中，3q及5p获得也似乎是低等级的特征(在此处，由于无5q获得，其不是如对更高级描述的iso5p)。
对于高级的获得异常逐渐呈现：8q，1q，11q，但也16及18，它们似乎在T2阶段或以上更常发生。
对于高级的损失异常是：6q，11p，及13，但也18q，后事件因此似乎在肿瘤进展中延迟发生。
【IV-灵敏度及特异性的计算及定义】
灵敏度：检测患病患者的能力。
特异性：测试测定哪个受试者健康的能力。
借助于发明人已知的肿瘤的使用，可计算测试灵敏度。此将允许本技术检测待评估的低-级及高-级肿瘤的能力。两个组将在计算上分离，因为低-级肿瘤欠难检测。常规测试，例如尿细胞学，在它们的初始期检测仅50％的这些癌。
既有的测试的特征在于它们的灵敏度及特异性，如在科学文献(由于这些值根据各研究变化，通过最小值及最大值表达-来源：Biomarkers for detection and surveillance of bladder cancer，Lome I.Budman，MSc，Wassim Kassouf，M.D.，and Jordan R.Steinberg，MDfrom the Division of Urology，McGiII University Health Centre，Montreal，Quebec)中计算的，如以下表4所示。
表4
对于既有的测试的灵敏度及特异性：
  测试   灵敏度   特异性
  BTA Stat(Polymedco)   52.5％～78.0％   69.0％～87.1％
  BTA Trak(Polymedco)   51％～100％   73％～92.5％
  细胞学   12.1％～84.6％   78.0％～100％
  血尿浸渍片   47.0％～92.6％   51.0％～84.0％
  NMP22膀胱癌测试(Matritech)   34.6％～100％   60.0％～95.0％
  NMP22膀胱Chek(Matritech)   49.5％～65.0％   400％～89.8％
  ImmunoCyt/uCyt+(DiagnoCure)   633％～84.9％   620％～78.1％
  ImmunoCyt/uCyt+及细胞学   81.0％～89.3％   61.0％～77.7％
  UroVysion(Abbott Molecular)   68.6％～100％   65.0％～96.0％
对于给定数的标记物测定灵敏度。对于这些中的每一个，可计算灵敏度值。显然，其用仅一种遗传标记物导致可靠的解决方案是不可能的。但是，25种标记物的组合似乎显著更严谨，如表5及6中总结评定所示。
表5
基于25种标记物的总结评定
Figure BDA0000060879980000191
表6
基于25种标记物的总结评定
Figure BDA0000060879980000192
特异性：6种阴性DNA(无异常的DNA)：6/(6+0))＊100＝100％
可获取已分类于低-级组的10种异常作为在它们的起始期的肿瘤的模型，其尚未具有侵袭性。
通常，当肿瘤不具有侵袭性，但是高级时，或当其已在T1或T2阶段或以上，在本发明的标记物上检测的异常的数增加。
对于高级，方法确实确认染色体的重要性：1，7，8，11，13，14，17，及18。
但是，应注意到，各标记物的灵敏度均被认为独立地不超过36％(如在一些研究中对于细胞学或NMP22的情况)。
另一方面，发明人为本发明选定的全部遗传标记物的集合提供非常良好的灵敏度，甚至对于极低级(用本发明单独得到的结果与在某些研究中使用的lmmunoCyt/uCyt+及细胞学组合同样令人满意)。
类似地，特异性(对于正常样品或对于从患者的尿提取的DNA用阴性内镜检查及阴性随诊结果计算的)达到100％。
【V-尿检验】
在诊断或随诊下从患者获取尿样品。
进行常规内镜检查。然后将患者如图2所示分组。
以对于冷冻的肿瘤相同的方式实施方法(见部分II)。
使用BacMagic+软件分析结果以图像化染料交换模式中的特征。对于各DNA，由BacMagic+输出文本文件及格式化，从而其可被seeGH软件使用。基于BacMagic+中的染料交换对称的可视化注释缺失及获得。
使用seeGH，对各组，编译注释，以便产生检测的异常及它们的频度的总体图像。在这些图中，其类似于核型表，标记代表异常(红＝损失，绿＝获得)及它们的位置。标记尺寸代表患者库中它们的检测频度。
对于更高泌尿系统的肿瘤，可产生检测的异常的总结评定(表7及8)。
表7
检测的异常的总结评定(获得)
  条带   总克隆   阳性最小   阳性内镜检查   疑似内镜检查
  1q   10   8   1
  1q22-24   3   2   1
  3   19   1
  3q   6   5   1
  3q26-ter   3   2   1
  5p   7   6   1   1
  7p   7   6   1
  8q21-23   11   9   2   1
  11q13   7   6   1
  12   15   12   1   1
  12q   7   6   1
  13q   7   5，6   1   1
  15   8   6，4   1
  16q   5   4   1   1
  17p   5   4   1
  17q   10   8   4   1
  19   4   3   4   1
  20   17   14   1   1
表8
检测的异常的总结评定(缺失)
  条带   总克隆   阳性最小   阳性内镜检查   疑似内镜检查
  1p21-22   4   3   1
  4q12-13   6   5   1
  6q25-27   3   2   2   1
  8p   14   11   2   1
  9p   6   5   5   1
  9q   12   10   4   1
  10q22   3   2   1
  11p   10   8   1   1
  14q23-31   4   3   1
  17p   5   4   1   1
  17q   10   8   1
  18q12   3   2   1
  18q 12-23   11   9   5
  20q   10   8   1
  22q   8   6   1
对于有阳性内镜检查的患者，识别膀胱癌的异常特征，有一些变异，其在本文列出。
而且，将在努力中使用异常分布表，以测定这些检测的肿瘤的等级。
对于膀胱肿瘤，此也通过产生检测的改变的总结评定来进行。
表9
检测的异常的总结评定(获得)
  条带   总克隆   阳性最小   阳性内镜检查   疑似内镜检查(随诊)
  1q22-24   4   2   1
  3p24-ter   4   3   1
  3q   6   5
  5p   7   6   2
  8q22-ter   3   2   3   1
  10p   4   3   1
  11q13   7   6   4   2
  12q21-24   5   4
  15   8   6
  16   12   10   1
  17p   5   4   1
  17q   11   9   2   1
  18q   10   8   2
  20q11-ter   10   8   3   1
  20   14   11   1   1
表10
检测的异常的总结评定(缺失)
  条带   总克隆   阳性最小   阳性内镜检查   疑似内镜检查(随诊)
  2q35-ter   2   2
  4p   3   2   1
  4q26-ter   7   6
  6q15-24   5   4   1
  6q25-27   5   4   1   1
  8p   14   11   2   2
  9p   6   5   3   1
  9p   12   10   1   1
  10q   14   11   1
  11p   4   3   1   1
  11q23-25   5   4   1
  13q13   3   2
  13   7   6
  14q23-31   3   2
  17p   5   4
  17   16   13
  18q12   3   2   2   1
  18q12-23   11   9   1
  19   4   3
列于表9及10的结果显示，在有阳性内镜检查的患者中检测到许多特征异常。但是，疑似内镜检查显示更少改变。在未完全确定内镜检查诊断的患者中，随诊显示，这些患者已不利地进展。由此，似乎通过发明人的测试，在达到6-个月随诊之前将已澄清疑似内镜检查。
也应注意到，有阴性内镜检查的患者与12-个月随诊仍无显示的患者同样良好，显示所测区无阳性。(仅少数克隆显示变化，但这些不是期望测试的区，及对应于点到载玻片上的克隆的多态变化。这些克隆将必需在本载玻片的将出现的样式中抑制，因为它们的变化的性质及接近着丝粒的位置)。
如果对各从有阳性内镜检查的患者尿提取的DNA逐情况进行分析，可利用组合低级或高级的本发明的总结表。
【特定实施例】
DNA 34016：有阳性内镜检查的UUTT。检测9p及9q缺失，指示低级。
发明人的泌尿学家合作者在测试后进行了活组织检查。测定1或2级。
DNA 33276：有阳性内镜检查的UUTT。检测多种异常(总8种)，之中9q，11p，8p及1q22-q2是高级的特征。活组织检查后，确认G3级。
DNA 32479：有疑似内镜检查但在6个月时阳性随诊的膀胱肿瘤：仅检测到19的获得。此小的异常数及19的获得的测定不到的影响，允许发明人将此肿瘤与低级关联。活组织检查指定G1/G2级。
在此研究中测试尿的多数患者中进行活组织检查，无论它们的内镜检查是否为阳性。在进行BCA测试的时间，活组织检查的结果不可用。
此测试由此以盲式进行。可如以下表11所示对膀胱癌总结结果。
表11
膀胱肿瘤：阳性内镜检查：8个尿样品
Figure BDA0000060879980000241
应注意到，对于活组织检查的结果明晰的全部患，可预测肿瘤等级。而且，在一些情况中，改变的标记物的更精确分析提供有关肿瘤的攻击性特征，其转移性潜力及其可能的进展的信息。而且，一些太被限制的活组织检查不可分析，然而本发明能够提供有关这些肿瘤等级的清楚的结果。

Claims (13)

1.体外检测患者膀胱癌的方法，其特征在于，其包括下列步骤：
(i)提取含于从所述患者获取的尿样品中的DNA；
(ii)将步骤(i)中提取的DNA片段化；
(iii)用标记试剂均匀标记得到的DNA片段，以形成标记的DNA库；
(iv)从所述标记的DNA库形成至少一种等份及使各等份与一组参照DNA接触，所述接触在允许标记的DNA片段与所述参照DNA的特异性杂交的条件下进行；所述参照DNA包括包含于存在于人染色体的各下列座位的DNA序列：1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，1q22-q24，5p，6q22，7，11q13，12q15，13q，15，16，17q，6q25-q27，7q，8p，10q，11p，14q22-qter，17p，19及22；
(v)消除不特异性地与参照DNA杂交的标记的DNA片段；
(vi)测定由与选定的参照DNA的每一个杂交的标记的片段产生的信号强度；
(vii)对各参照DNA，测定得到的信号相比用对照DNA从健康患者得到的信号之间的偏差；
(viii)从所述观察的偏差推导患者的癌阶段。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述参照DNA包含包括于下列人染色体座位的每一个中的序列：1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，1q22-q24，5p，6q22，7，11q13，12q15，13q，15，16，17q，6q25-q27，7q，8p，10q，11p，14q22-qter，17p，19及22。
3.权利要求1及2中任一项的方法，其特征在于，所述参照DNA由长度1,000和200,000bp(碱基对)之间，优选2,000和180,000bp之间，及再更优选5,000和160,000个碱基对之间的人染色体的DNA序列构成。
4.权利要求3的方法，其特征在于，所述参照DNA由人基因组的BAC克隆构成。
5.权利要求1～4中任一项的方法，其特征在于，分别使用第一及第二标记物，以标记尿DNA提取的片段及来自健康患者的对照DNA。
6.权利要求5的方法，其特征在于，第一及第二标记物是以不同的波长发射的荧光标记物，优选Cy3及Cy5。
7.权利要求1～6中任一项的方法，其特征在于，作为对于参照DNA观察的偏差的函数测定步骤(viii)中的肿瘤细胞的等级。
8.权利要求1～7中任一项的方法，其特征在于，先于与标记的DNA片段杂交，将所述参照DNA独立地沉积于微阵列。
9.权利要求1～8中任一项的方法，其特征在于，将在步骤(iii)中从患者获取的DNA片段分为2库，一个用第一标记物标记及另一个用第二标记物标记，将步骤(vii)的对照DNA也分为2库，一个用第一标记物标记及另一个用第二标记物标记，在步骤(vii)中，在由此标记的每一个库之间进行信号偏差的交叉-测定。
10.用于检测膀胱癌的DNA微阵列，其特征在于，其在其表面包括10和1000之间个参照DNA沉积物，所述参照DNA包含包括于下列人染色体座位的每一个中的序列：1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，1q22-q24，5p，6q22，7，11q13，12q15，13q，15，16，17q，6q25-q27，7q，8p，10q，11p，14q22-qter，17p，19及22。
11.权利要求10的DNA微阵列，其特征在于，其用于膀胱癌的体外尿检测。
12.权利要求10或11的DNA微阵列，其特征在于，其在其表面包括10和400之间，优选300和400之间个所述参照DNA沉积物。
13.权利要求10～12中任一项的DNA微阵列，其特征在于，各参照DNA沉积物包含包括于人染色体的下列座位中的序列：1p，3q，8q22qter，20，5p12-p13，9p，9q，18q12，1q22-q24，5p，6q22，7，11q13，12q15，13q，15，16，17q，6q25-q27，7q，8p，10q，11p，14q22-qter，17p，19及22。
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