JP4004628B2 - 尿を用いる膀胱癌の遺伝子検査法 - Google Patents
尿を用いる膀胱癌の遺伝子検査法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4004628B2 JP4004628B2 JP06821998A JP6821998A JP4004628B2 JP 4004628 B2 JP4004628 B2 JP 4004628B2 JP 06821998 A JP06821998 A JP 06821998A JP 6821998 A JP6821998 A JP 6821998A JP 4004628 B2 JP4004628 B2 JP 4004628B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primer
- polymorphic site
- genetic
- chromosome
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿を用いる膀胱癌のスクリーニングのための遺伝子検査法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
膀胱癌の癌化では染色体の脱落が起こり、染色体、４ｐ、８ｐ、９ｐ、９ｑ、１１ｐ、や１７ｐ部位における高頻度のヘテロ接合性の消失（loss of heterozygosity：ＬＯＨ）が報告されている（Cancer Res. 54 p784-788 Spruck III等(1994 ）、Cancer Genet. Cytogenet. 77 p118-124 Matsuya等(1994)、Lancet 342 p469-471 Dalbagni等(1993)、Cancer Res. 54 p531-538 Knowles 等(1994)、Cancer Res. 50 p7081-7083 Olumi 等(1990)）。そのような変化の検出は、有用な膀胱癌の検査方法になることが期待される。
しかしながら、この方法では膀胱癌から摘出した組織細胞を用いており、より簡便な方法が切望されている。
【０００３】
又、最近、菅野等は、蛍光ラベル化したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行った後、ＰＣＲ産物の３’末端側を平滑化処理し、蛍光自動ＤＮＡシーケンサーを用い、single-stranded conformation polymorphism 法（ＳＳＣＰ）でＬＯＨを検出する方法（blunt-end SSCP analysis ：末端平滑化ＳＳＣＰ法）を開発した（特開平９−２０１１９９、Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)、Int. J. Cancer 74 p403-406 Sugano 等(1997)）。この方法は、それぞれのアレルを分離するための解像度の向上と、シグナル強度の定量的な分析を可能にした。
【０００４】
菅野等は、末端平滑化ＳＳＣＰ法で癌抑制遺伝子ｐ５３のアレルの消失を分析し、Ｔ１ステージを越える浸潤性の膀胱癌のほとんど全ての症例で、ｐ５３のＬＯＨを検出した。また、癌組織でｐ５３遺伝子のＬＯＨを示した膀胱癌患者の７５％では、尿サンプルでも同様の遺伝子変異を示した（Int. J. Cancer 74 p403-406 Sugano 等(1997)）。膀胱癌のｐ５３のＬＯＨの検出は、ハイリスクの侵襲性膀胱癌、特に膀胱全摘が適用となる膀胱癌のリスク評価の指標として応用できる可能性が報告されている。
一方、表在性膀胱癌の多くは、乳頭状増殖を示す浸潤性の低い癌で、悪性度は低い。これらは、通常、経尿道切除術（ＴＵＲ）が適用となり、浸潤性の膀胱癌と比較し、予後は良好である。しかし、表在性膀胱癌の約１０％では、より悪性度の高い浸潤性膀胱癌に進展するものと思われるので、ＴＵＲ後、膀胱癌の術後フォローアップで、再発を早期検出する必要がある（Int. J. Urol. 4 p74-78 Tsutsumi 等(1997)）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
膀胱癌のスクリーニングには、尿を用いた細胞診が行われているが、癌細胞は尿中でしばしば変成を受けるため（特に、低異型度の癌細胞ではこの傾向が著しい）、細胞診の見逃しが多く、信頼性は低くかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記したような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、染色体の欠失を高感度に検出し、正確かつ簡便に、膀胱癌をスクリーニングする方法を見いだし、本発明に至ったものである。即ち、本発明は、尿を用いて、早期の膀胱癌をも精度高くスクリーニングする方法を提供するものである。
【０００７】
本発明の第１の要旨は、尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用いて、９番染色体（相同染色体）のいずれか一方の少なくとも一部の欠損を検出することを特徴とする膀胱癌の検査方法である。
本発明の第２の要旨は、尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用いて、９番染色体の短腕部（９ｐ）と長腕部（９ｑ）の欠失を検出し、これらを組み合わせて検査する膀胱癌の検査方法である。
本発明の第３の要旨は、染色体上の遺伝子多型の存在する部位を、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）で増幅後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ）で分析し、該遺伝子多型部位のヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を検出する方法である第１又は第２の要旨の検査方法である。
本発明の第４の要旨は、膀胱癌が、初期の膀胱癌である第１から第３の要旨の方法である。
本発明の第５の要旨は、尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用いて相同染色体の一方の少なくとも一部の欠失を、ＬＯＨにより検出し膀胱癌を検査する際に、繰り返し単位の差が１単位以上であるマイクロサテライト型多型部分を利用し、該部分の遺伝子をＰＣＲで増幅後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られたＤＮＡ断片をＳＳＣＰで分析し、該遺伝子多型部位のＬＯＨにより検出する膀胱癌の検査方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本発明における尿とは、集団検診、健康診断、ドック検診、郵送検診などの検診尿や、病院における外来・入院患者尿で、膀胱癌のスクリーニングや再発など、膀胱癌の早期発見を必要とするもの等が挙げられ、特に限定されずこれらの全てが対象となる。また、採尿方法を工夫した特殊なデバイスで、尿中に脱落してくる細胞を効率よく集めたものも対象となる。
本発明の尿中の細胞から抽出したＤＮＡとは、尿中に脱落してきた本人の細胞由来のＤＮＡを含むものであれば何でもよく、通常、尿中に脱落した新陳代謝された正常細胞及び又は癌細胞由来の遺伝子ＤＮＡを、種々の方法で効率よく抽出したものが対象となる。この抽出は公知の方法によって行なうことができる。
【０００９】
本発明の９番染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠損とは、ペアとなる９番染色体の一方が完全に欠失したり、部分的に欠失した場合や、ペアとなる染色体で、お互いに異なる遺伝子部位に部分的な欠失を起こした場合を含むものである。
本発明の９番染色体の短腕部（９ｐ）と長腕部（９ｑ）の欠失を検出しこれらを組み合わせて検査する膀胱癌の検査方法とは、９ｐの欠失の検出と９ｑの欠失の検出を行ない、これらを組み合せることにより、スクリーニングの感度を上げたり、癌の悪性度の評価をするものである。
本発明のＤＮＡを用いる検査方法としては、目的の遺伝子変異を高感度に分析できる方法であれば何れであってもよく、各種の遺伝子診断法が用いられる。通常、ＤＮＡの高感度検出のためには、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）やブランチドＤＮＡハイブリダイゼーション法（ｂ−ＤＮＡ）等の方法が利用できる。
【００１０】
本発明の遺伝子多型とは、ヒト染色体上の遺伝的多型であり、遺伝子上の塩基配列の個体差に由来する。一塩基置換型の多型は、平均して数百塩基に１ヶ所程度そのような遺伝子多型が存在すると言われている。例えば、９番染色体上のヒトのアルドラーゼＢ遺伝子（ＡＬＤＯＢ）のイントロン８における１塩基置換の遺伝子多型は、９ｑ２２上と同定され、Brooks等が報告している（Am. J. Hum. Genet. 52 p835-840 Brooks 等(1993)）。また、９ｑ３４上と同定されたＶＡＶ２遺伝子上のＴ／Ｃ置換の遺伝子多型は、コスミドクローンＬ１９６Ｃ８株の塩基配列の測定データ（Gene Bank 登録番号ＡＣ００２１１１）に基づいており、国立がんセンター中央病院で見出されたものである。４塩基単位の繰り返しのマイクロサテライト型の多型として、９番染色体上では、Ｄ９Ｓ７７５，Ｄ９Ｓ３０４とＤ９Ｓ３０３などが知られており、ゲノムデータベース（インターネット上のアドレス：http://gdbwww.gdb.prg/）から情報入手できる。
【００１１】
これらの遺伝子多型を解析することにより、父方由来の染色体（アレル）と母方由来の染色体（アレル）を区別することができる。従って、ある遺伝子多型部位のヘテロ接合体（父方と母方のアレルが異なる個体）で、一方のアレルの消失（ＬＯＨ）を測定すれば、その遺伝子の欠失を検出することができる。しかし、一塩基置換型の多型を利用する場合は、ヘテロ接合体である頻度が最大でも50％であり、１つの遺伝子の欠失を調べるためには、ヘテロ接合体の出現頻度の高い複数の遺伝子多型を組み合わせる必要がある。また、遺伝子多型には民族間差が存在するので、欠失を診断したい遺伝子のなかから、その民族で出現頻度の高い遺伝子多型部位を選択する必要がある。
【００１２】
本発明の遺伝子多型部位をＰＣＲで増幅後、このＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られたＤＮＡ断片をＳＳＣＰで分析するヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）の検出方法としては、特開平９−２０１１９９等に示されている方法が利用できる。即ち、末端平滑化処理とは、２本鎖ＤＮＡ断片の末端１本鎖部分を平滑にすることであり、KlenowフラグメントやＴ４ＤＮＡポリメラーゼのような３→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、１本鎖部分を修復する酵素で処理するか、平滑に切断する制限酵素で処理して１本鎖部分を含む末端部を取り除けばよい。３′→５′エクソヌクレアーゼ活性有する耐熱性ポリメラーゼを用いてＰＣＲ法を施行する等の方法を用いることが可能である。分析しようとする２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖とアンチセンス鎖の長さが異なったり不揃いの場合、熱変成して１本鎖にして分析すると、ＤＮＡ断片に由来するピークは分裂し、多重となる。これに対し、２本鎖ＤＮＡ断片を平滑化して分析すると単一ピークに収束し、遺伝子変異を起こしたＤＮＡ断片との識別が、極めて容易となる。ＰＣＲで増幅すべき遺伝子の領域は、１つの遺伝子多型を含む範囲であれば特に制限はないが、ＰＣＲで増幅し易い長さと範囲を選ぶ必要がある。長さは通常 100〜200bp で、範囲はＰＣＲに適したオリゴヌクレオチドプライマーの設計から決めればよい。ＤＮＡ断片の検出のためにＤＮＡ断片のラベル化をすることもできる。ＤＮＡ断片のラベル化としては、プライマーとして予めラベル化したプライマーを使用する方法、又は、ＰＣＲを実施する際にラベル化した塩基成分（例えば燐の放射性ラベル）を用いる方法、又は、ＰＣＲを実施した後にラベル化する方法がある。
ラベル化処理方法としては、ＳＳＣＰ後に検出し易いものであれば特に制限はなく、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン（酵素標識アビジンで検出）などで例えば、ＤＮＡの５’末端側を標識化すればよい。特に好ましくは、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端をあらかじめＡ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ（Ｃｙ５TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）で蛍光ラベル化したものを用いればよい。
【００１３】
本発明の初期の膀胱癌とは、一部修正して行ったＷＨＯのグレード分類ではＧ1 以下の初期癌を、ＴＭＮ分類（tumor-nodes-metastasis pathological staging system：American joint Committee on Cancer(1988)）では pＴa あるいは pＴis等の初期ステージの癌を意味している。
本発明の繰り返し単位の差が１単位以上であるマイクロサテライト型多型部分とは、例えば、繰り返し単位を特定の４塩基対とすると、遺伝子上のある特定の領域に、この塩基対の単位を多数繰り返す領域が存在し、その繰り返し数が、各アレル毎に異なっている。このため、遺伝子多型を形成する。この場合、アレル間の繰り返し単位数の差が無い場合を除き、理論的にはＬＯＨ分析は可能である。末端平滑化ＳＳＣＰ法を用いると、ピークの分離がシャープになり分析精度が向上し、繰り返し単位の差が１単位以上であれば分析できる。
【００１４】
【実施例】
以下に、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験例１
１．検体の入手
膀胱癌患者のそれぞれの検体は、次のようにして入手して処理後、ＬＯＨを分析するまで保存した。経尿道切除術（ＴＵＲ）やバイオプシィーで入手した新鮮な組織の一部は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、−８０℃で凍結保存した。尿は、内視鏡検査前に、自然排尿で、５０ｍＬの遠心チューブに採取した。この尿を、１, ０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、沈渣を集めた。この沈渣に、４０ｍＬの生理食塩水を加えて再分散し、再度１, ０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、残ったペレットを−８０℃で凍結保存した。正常組織ＤＮＡには、末梢血の白血球（ＰＢＬ）を用いた。１０ｍＬの静脈血をヘパリン入りの採血管に採取し、３, ０００ｒｐｍで１５分間遠心後、血漿を廃棄した。この採血管に、０．２％の食塩水４０ｍＬを加えて溶血し、再度３, ０００ｒｐｍで１５分間遠心後、上清液を捨て、同様の操作を２回繰り返した。残ったペレットは、−８０℃で凍結保存した。
陰性対照には、良性の尿路疾患患者２０例の尿と血液を採取し、膀胱癌患者の検体と同様に処理して、−８０℃に凍結して保存した。
【００１５】
２．尿、組織、ＰＢＬからジェノムＤＮＡの抽出
凍結保存検体からのＤＮＡの抽出は、プロテナーゼＫで消化後、フェノール・クロロフォルムで抽出するデイビスら（Basic Method in Moleular Biology, Elsevir Science Publishing 社出版）や菅野らの（Lab. Invest. 68 ｐ361-366 Sugano等(1993)）の方法で行った。要約すると、６５℃で１５分間処理した検体に、プロテナーゼＫ１ｍｇ／ｍＬ、ＥＤＴＡ１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．４％、食塩１５０ｍｍｏｌ／Ｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液を加えて３７℃で一夜インキュベート後、この反応液に等量のフェノール：クロロフォルム＝１：１溶液を加えて２回ＤＮＡを抽出した。抽出液に、０．１容の３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液と２．５容の冷無水エタノールを加え、−２０℃で２時間冷却し、ＤＮＡを沈殿させた。尿と癌組織のサンプルには、エタノール沈殿のキャリアーとして２０μｇのグリコーゲンを加え、ＤＮＡの回収率を向上させた。この溶液を遠心して沈殿物を集め、さらに、１ｍＬの８０％エタノールを加えて洗浄後、真空遠心濃縮機で沈殿を乾固した。このＤＮＡを含む沈殿物は、ＴＥ緩衝液で再溶解した。
【００１６】
３．蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーの調製
第９染色体上の遺伝子多型マーカー増幅用のプライマー鎖、ＰＣＲ増幅及び末端平滑化ＳＳＣＰ法の条件と、それぞれのマーカーに対するヘテロ接合性の割合を、表１にまとめた。
【００１７】
【表１】
【００１８】
Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄTM（Ｃｙ５TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）を用いて、前向きと後ろ向きのＰＣＲ用プライマーの５’末端側のそれぞれを、indodicarbocyanine（Ｃｙ５）蛍光色素で標識した。第９染色体上のアレル消失のマーカーとして、５つの遺伝子多型を用いた。このうちの３つは、４塩基繰り返しの、２つは１塩基置換の多型であった。３つの４塩基の繰り返しのマイクロサテライト型マーカー、Ｄ９Ｓ７７５，Ｄ９Ｓ３０４とＤ９Ｓ３０３は、それぞれ、９ｐ２３−ｐ２２、９ｐ２１、９ｑ１３−ｑ２２．３と同定され、ゲノムデータベース（インターネット上のアドレス：http://gdbwww.gdb.prg/）から入手した。ヒトのアルドラーゼＢ遺伝子（ＡＬＤＯＢ）のイントロン８における１塩基置換の遺伝子多型は、９ｑ２２上と同定され、Brooks等から報告された（Am. J. Hum. Genet. 52 p835-840 Brooks 等(1993)）。９ｑ３４上と同定されたＶＡＶ２遺伝子上のＴ／Ｃ置換の遺伝子多型は、コスミドクローンＬ１９６Ｃ８株の塩基配列の測定データ（Gene Bank 登録番号ＡＣ００２１１１）に基づいており、国立がんセンターで見出されたものである。
【００１９】
４．ＰＣＲ
組織や血球より抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型） 0.1μg 、各プライマーを1.6 ｐＭずつ、各ヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を10ｎＭずつ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ 8.3）10μＭ、ＫＣｌ 50 ｍＭ、ＭｇＣｌ2 1.5 ｍＭ、ゼラチン 0.001％(w/v) 、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer社）1.25 unit を加え、全液量を 25 μl とした。この溶液について、表１に示した条件でＰＣＲを行った。最初の変成条件のみは95℃で５分間、その後は、それぞれ次の反応条件下で増幅反応を行った。変成条件は95℃で30秒間、アニーリングは、Ｄ９Ｓ７７５とＶＡＶ２に対しては55℃で30秒間、Ｄ９Ｓ３０３、Ｄ９Ｓ３０４とＡＬＤＯＢについては57℃で30秒間、延長反応は72℃で30秒間のサイクルを３０回繰り返し、最後に、72℃で７分間の延長反応を行った。
【００２０】
５．ＰＣＲ産物の３’末端平滑化
ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントは、Klenow fragment （宝酒造（株）製）で処理し、末端を平滑化した。５μL のＰＣＲ産物に、0.5 units の Klenow fragmentを加え、37℃で30分間反応した（Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
【００２１】
６．末端平滑化ＳＳＣＰ解析
分析には、Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄTMＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ファルマシア社）を用いた。前記の末端平滑化したＰＣＲ反応液１μL を、10μL のローディング液（組成は、ＥＤＴＡ 20 ｍＭ、ブロムフェノールブルー 0.05 ％を含む脱塩した90％ホルムアミド溶液）で希釈した。80℃で５分間加熱変成後、このうちの１μL を、トリス・グリシン緩衝液（トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭ）を含む15％アクリルアミド（ビスアクリルアミド／アクリルアミド＝１／30）ゲル（高さ 300mm×幅 350mm×厚さ 0.52mm 、１回の泳動で最大４０検体の分析が可能）にアプライし分析した。電気泳動は、ゲルと同一の緩衝液系で、表１に示した条件、20Ｗ又は30Ｗで1,000 分間、恒温水槽で18℃又は28℃に保ちながら行った。測定データの解析には、解析用のソフトはＦｒａｇｍｅｎｔ ＭａｎａｇｅｒTM（ファルマシア社）を用いた（Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
【００２２】
７．癌細胞割合の定量化とＬＯＨのカットオフ値
健常対象者の父方と母方アレルのシグナル（ピーク高さ）を比較して、一方のアレルのピーク高さが著しく減少した場合、ＬＯＨと定義された。サンプル中の癌由来ＤＮＡの割合、即ち、癌細胞の割合は、次の式で推定できた（Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
Ａ１とＡ２アレルを持つヘテロ接合性のヒトで、Ａ１アレルが失われたとすると、Ｔは、癌患者の組織又は尿サンプルからのシグナルのピーク高さを、Ｎは、正常対象者からのシグナルのピーク高さを示す。
測定の再現性は、健常者のＰＢＬからのＤＮＡサンプルを、同時に繰り返し測定した場合、２つのアレルからのシグナル比の変動係数（ＣＶ）として評価した。さらに、尿路疾患患者２０例の尿を分析し、それぞれのマーカーの癌細胞割合のカットオフ値を決めるための、陰性コントロールとして用いた。
【００２３】
８．組織病理学的診断
膀胱癌患者の尿とバイオプシーの検体の一部は、通常の細胞診や組織病理診断を行った。癌組織の病理診断のグレードは、ＷＨＯ分類を一部修正して、ステージは、ＴＭＮ分類（tumor-nodes-metastasis pathological staging system：American joint Committee on Cancer(1988)）に従って分類した。
【００２４】
実験例２ ＬＯＨに対する測定の再現性とカットオフ値
１人のドナーの同じＰＣＲ産物、又は、同じ遺伝子型を持つ複数のドナーからのＰＣＲ産物の末端平滑化ＳＳＣＰ分析値からアレルのシグナル比を計算して、正常な二倍体（一対の染色体）ＤＮＡのＣＶ値を求めた。同一ドナーの遺伝子上の各々の位置における同時再現性のＣＶ値は、それぞれ、Ｄ９Ｓ７７５が０．９％（ｎ＝９）、Ｄ９Ｓ３０４が４．９％（ｎ＝１４）、Ｄ９Ｓ３０３が１．２％（ｎ＝１６）、ＡＬＤＯＢが３．０％（ｎ＝１３）、ＶＡＶ２が１．４％（ｎ＝１６）であった。また、複数のドナーからのＰＣＲ産物の同時測定時のＣＶ値は、それぞれ、Ｄ９Ｓ７７５が３．７％（ｎ＝７）、Ｄ９Ｓ３０４が３．６％（ｎ＝７）、Ｄ９Ｓ３０３が３．９％（ｎ＝１２）、ＡＬＤＯＢが２．７％（ｎ＝８）、ＶＡＶ２が２．５％（ｎ＝７）であった。良性尿路疾患患者の尿サンプルを用いて同様の測定を行い、アレル比の異常の程度を、癌細胞割合として計算した。遺伝子の各位置におけるＬＯＨ陽性（癌陽性）のカットオフ値を、この良性尿路疾患群の癌細胞割合の＋３ＳＤ（標準偏差）とした。癌細胞割合のそれぞれのカットオフ値は、Ｄ９Ｓ７７５が１３％（ｎ＝１５）、Ｄ９Ｓ３０４が１９％（ｎ＝１８）、Ｄ９Ｓ３０３が１２％（ｎ＝１７）、ＡＬＤＯＢが１０％（ｎ＝８）、ＶＡＶ２が１３％（ｎ＝１１）であった。このカットオフ値を用いると、良性尿路疾患でＬＯＨ陽性となるものは、全く無かった（表３）。
【００２５】
実施例１ 膀胱癌患者９番染色体のＬＯＨの分析
膀胱癌患者３４例の尿と組織を対象として、９番染色体上の５ヶ所の遺伝子多型部位、Ｄ９Ｓ７７５、Ｄ９Ｓ３０４、Ｄ９Ｓ３０３、ＡＬＤＯＢ、ＶＡＶ２を、実験例１の方法で分析した。分析例として、膀胱癌の症例Ｎｏ３３の電気泳動パターンを図１に示した。それぞれ、ＢはＰＢＬでの、Ｔは癌組織での、Ｕは尿でのパターンを示す。また、各遺伝子多型部位でのピーク高さの比から計算した、癌組織と尿での癌細胞割合（％）を括弧内に示した。この例では、分析した全ての遺伝子多型部位で、尿と組織の両方ともＬＯＨが陽性であった。
【００２６】
全例の分析結果をまとめ、図２に示した。Ｔは癌組織での、Ｕは尿での結果を示す。それぞれ、●はＬＯＨ陽性、○は保持（ＬＯＨ陰性）、ＮＡはＰＣＲ不能、縦線はホモ接合体で遺伝子多型の解析が不能を示す。９番染色体上の５つの遺伝子多型マーカーを組み合わせることで、少なくとも１つ以上の遺伝子多型部位が有効（情報供給可能：ヘテロ接合性で、父方と母方でピークの位置がずれ、ＬＯＨの分析に使える）となった。有効な遺伝子多型部位は、３／３４（８．８％）が１ヶ所のみ、５／３４（１４．７％）が２ヶ所、残りの２６／３４（７６．５％）が３ヶ所以上であった。９番染色体のＬＯＨは、癌組織では２６／３４（７６％）が陽性、尿サンプルからでは２４／３３（７２．７％）が陽性であった（表２〜３）。
【００２７】
癌サンプルにおけるＬＯＨ陽性の頻度と、癌のステージ、組織学的グレードとの相関をまとめ、表２に示した。各遺伝子多型部位におけるＬＯＨ陽性の頻度は６０．０％（Ｄ９Ｓ７７５とＶＡＶ２）から６６．７％（Ｄ９Ｓ３０３）で、分析した９番染色体上の５つの多型部位のＬＯＨを組み合わせると２６／３４（７６．５％）がＬＯＨ陽性であった。癌のステージ毎のＬＯＨをみると、 pＴa が１２／１５（８０％）、 pＴ1 が１０／１４（７１．４％）、 pＴ2 以上４／５（８０％）であった。また、グレード別では、Ｇ1 が７／１０（７０％）、Ｇ2 が８／１０（８０％）、Ｇ3 が１１／１４（７８．６％）であった。
【００２８】
【表２】
【００２９】
同じ患者からの癌組織と尿検体のアレルの状態を比較した（図２）。尿検体では、癌患者３４例のうち３３例が分析可能で、２４／３３（７２．７％）がＬＯＨ陽性であった。尿を分析した場合のＬＯＨ陽性の頻度と、癌のステージ、組織学的グレードの間の相関を、表３にまとめた。各遺伝子多型部位におけるＬＯＨ陽性の頻度は４６．７％（ＶＡＶ２）から６９．２％（Ｄ９Ｓ３０３）で、分析した９番染色体上の５つの多型部位のＬＯＨを組み合わせると２４／３３（７２．７％）がＬＯＨ陽性であった。癌のステージ毎のＬＯＨは、 pＴa が１１／１５（７３．３％）、 pＴ1 が８／１３（６１．５％）、 pＴ2 以上５／５（１００％）であった。また、グレード別では、Ｇ1 が６／１０（６０％）、Ｇ2 が６／９（６６．７％）、Ｇ3 が１２／１４（８５．７％）であった。１７番染色体上の癌抑制遺伝子ｐ５３中の遺伝子多型部位のＬＯＨを分析した場合、初期の膀胱癌は検出できなかった（特開平９−２０１１９９）が、９番染色体の欠失を検出することにより、 pＴa ステージ、Ｇ1 グレードの初期の膀胱癌まで高率に検出できるようになった。
【００３０】
【表３】
【００３１】
尿と癌組織とも測定できた症例で比較すると、２２／３３（６６．７％）が両方ともＬＯＨ陽性で、５例（１５％）が、尿、癌組織ともＬＯＨ陰性で、９番染色体は保持されていた。診断精度は８１．７％であった。癌組織では２６例が、尿では２４例がそれぞれＬＯＨ陽性であった。２例（患者Ｎｏ. １とＮｏ. ３０）では、尿のみＬＯＨ陽性であった（表４）。
【００３２】
【表４】
【００３３】
実施例２ 尿のＬＯＨと細胞診の感度の比較
膀胱患者３３例の尿の細胞診を行い、実施例１の尿のＬＯＨ分析結果と比較した（表５）。尿の９番染色体のＬＯＨでは２４例が陽性であるのに対し、細胞診では１２例が陽性で、尿ＬＯＨ分析法の僅か５０％であった。また、ＬＯＨ陰性の９例のうち、２例（２２％）が細胞診で陽性であった。癌組織で９番染色体のＬＯＨ陽性の２６例をみると、２２例（８５％）は尿のＬＯＨが陽性で、４例（１５％）がＬＯＨ陰性であった。この尿ＬＯＨ陽性２２例のうちで、僅か１１例（５０％）が細胞診陽性であった。また、この尿ＬＯＨ陰性４例の全ては、細胞診でも陰性だった。１７番染色体上の癌抑制遺伝子ｐ５３中の遺伝子多型部位のＬＯＨを用いた場合、尿の細胞診より膀胱癌のスクリーニング性能は劣っていた（特開平９−２０１１９９）が、９番染色体の欠失を検出することにより、スクリーニング性能は大幅に向上した。
【００３４】
【表５】
【００３５】
【発明の効果】
本発明の尿を検体とする染色体の欠失を検出する膀胱癌の遺伝子検査法を用いると、膀胱癌を、初期の段階から効率よくスクリーニングできるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】膀胱癌症例の末端平滑化ＳＳＣＰ分析の電気泳動パターン
【図２】膀胱癌患者の癌組織と尿について、９番染色体上のＬＯＨの分析結果
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿を用いる膀胱癌のスクリーニングのための遺伝子検査法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
膀胱癌の癌化では染色体の脱落が起こり、染色体、４ｐ、８ｐ、９ｐ、９ｑ、１１ｐ、や１７ｐ部位における高頻度のヘテロ接合性の消失（loss of heterozygosity：ＬＯＨ）が報告されている（Cancer Res. 54 p784-788 Spruck III等(1994 ）、Cancer Genet. Cytogenet. 77 p118-124 Matsuya等(1994)、Lancet 342 p469-471 Dalbagni等(1993)、Cancer Res. 54 p531-538 Knowles 等(1994)、Cancer Res. 50 p7081-7083 Olumi 等(1990)）。そのような変化の検出は、有用な膀胱癌の検査方法になることが期待される。
しかしながら、この方法では膀胱癌から摘出した組織細胞を用いており、より簡便な方法が切望されている。
【０００３】
又、最近、菅野等は、蛍光ラベル化したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行った後、ＰＣＲ産物の３’末端側を平滑化処理し、蛍光自動ＤＮＡシーケンサーを用い、single-stranded conformation polymorphism 法（ＳＳＣＰ）でＬＯＨを検出する方法（blunt-end SSCP analysis ：末端平滑化ＳＳＣＰ法）を開発した（特開平９−２０１１９９、Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)、Int. J. Cancer 74 p403-406 Sugano 等(1997)）。この方法は、それぞれのアレルを分離するための解像度の向上と、シグナル強度の定量的な分析を可能にした。
【０００４】
菅野等は、末端平滑化ＳＳＣＰ法で癌抑制遺伝子ｐ５３のアレルの消失を分析し、Ｔ１ステージを越える浸潤性の膀胱癌のほとんど全ての症例で、ｐ５３のＬＯＨを検出した。また、癌組織でｐ５３遺伝子のＬＯＨを示した膀胱癌患者の７５％では、尿サンプルでも同様の遺伝子変異を示した（Int. J. Cancer 74 p403-406 Sugano 等(1997)）。膀胱癌のｐ５３のＬＯＨの検出は、ハイリスクの侵襲性膀胱癌、特に膀胱全摘が適用となる膀胱癌のリスク評価の指標として応用できる可能性が報告されている。
一方、表在性膀胱癌の多くは、乳頭状増殖を示す浸潤性の低い癌で、悪性度は低い。これらは、通常、経尿道切除術（ＴＵＲ）が適用となり、浸潤性の膀胱癌と比較し、予後は良好である。しかし、表在性膀胱癌の約１０％では、より悪性度の高い浸潤性膀胱癌に進展するものと思われるので、ＴＵＲ後、膀胱癌の術後フォローアップで、再発を早期検出する必要がある（Int. J. Urol. 4 p74-78 Tsutsumi 等(1997)）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
膀胱癌のスクリーニングには、尿を用いた細胞診が行われているが、癌細胞は尿中でしばしば変成を受けるため（特に、低異型度の癌細胞ではこの傾向が著しい）、細胞診の見逃しが多く、信頼性は低くかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記したような問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、染色体の欠失を高感度に検出し、正確かつ簡便に、膀胱癌をスクリーニングする方法を見いだし、本発明に至ったものである。即ち、本発明は、尿を用いて、早期の膀胱癌をも精度高くスクリーニングする方法を提供するものである。
【０００７】
本発明の第１の要旨は、尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用いて、９番染色体（相同染色体）のいずれか一方の少なくとも一部の欠損を検出することを特徴とする膀胱癌の検査方法である。
本発明の第２の要旨は、尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用いて、９番染色体の短腕部（９ｐ）と長腕部（９ｑ）の欠失を検出し、これらを組み合わせて検査する膀胱癌の検査方法である。
本発明の第３の要旨は、染色体上の遺伝子多型の存在する部位を、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）で増幅後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ）で分析し、該遺伝子多型部位のヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を検出する方法である第１又は第２の要旨の検査方法である。
本発明の第４の要旨は、膀胱癌が、初期の膀胱癌である第１から第３の要旨の方法である。
本発明の第５の要旨は、尿中の細胞から抽出したＤＮＡを用いて相同染色体の一方の少なくとも一部の欠失を、ＬＯＨにより検出し膀胱癌を検査する際に、繰り返し単位の差が１単位以上であるマイクロサテライト型多型部分を利用し、該部分の遺伝子をＰＣＲで増幅後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られたＤＮＡ断片をＳＳＣＰで分析し、該遺伝子多型部位のＬＯＨにより検出する膀胱癌の検査方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。先ず、本発明における尿とは、集団検診、健康診断、ドック検診、郵送検診などの検診尿や、病院における外来・入院患者尿で、膀胱癌のスクリーニングや再発など、膀胱癌の早期発見を必要とするもの等が挙げられ、特に限定されずこれらの全てが対象となる。また、採尿方法を工夫した特殊なデバイスで、尿中に脱落してくる細胞を効率よく集めたものも対象となる。
本発明の尿中の細胞から抽出したＤＮＡとは、尿中に脱落してきた本人の細胞由来のＤＮＡを含むものであれば何でもよく、通常、尿中に脱落した新陳代謝された正常細胞及び又は癌細胞由来の遺伝子ＤＮＡを、種々の方法で効率よく抽出したものが対象となる。この抽出は公知の方法によって行なうことができる。
【０００９】
本発明の９番染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠損とは、ペアとなる９番染色体の一方が完全に欠失したり、部分的に欠失した場合や、ペアとなる染色体で、お互いに異なる遺伝子部位に部分的な欠失を起こした場合を含むものである。
本発明の９番染色体の短腕部（９ｐ）と長腕部（９ｑ）の欠失を検出しこれらを組み合わせて検査する膀胱癌の検査方法とは、９ｐの欠失の検出と９ｑの欠失の検出を行ない、これらを組み合せることにより、スクリーニングの感度を上げたり、癌の悪性度の評価をするものである。
本発明のＤＮＡを用いる検査方法としては、目的の遺伝子変異を高感度に分析できる方法であれば何れであってもよく、各種の遺伝子診断法が用いられる。通常、ＤＮＡの高感度検出のためには、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ）やブランチドＤＮＡハイブリダイゼーション法（ｂ−ＤＮＡ）等の方法が利用できる。
【００１０】
本発明の遺伝子多型とは、ヒト染色体上の遺伝的多型であり、遺伝子上の塩基配列の個体差に由来する。一塩基置換型の多型は、平均して数百塩基に１ヶ所程度そのような遺伝子多型が存在すると言われている。例えば、９番染色体上のヒトのアルドラーゼＢ遺伝子（ＡＬＤＯＢ）のイントロン８における１塩基置換の遺伝子多型は、９ｑ２２上と同定され、Brooks等が報告している（Am. J. Hum. Genet. 52 p835-840 Brooks 等(1993)）。また、９ｑ３４上と同定されたＶＡＶ２遺伝子上のＴ／Ｃ置換の遺伝子多型は、コスミドクローンＬ１９６Ｃ８株の塩基配列の測定データ（Gene Bank 登録番号ＡＣ００２１１１）に基づいており、国立がんセンター中央病院で見出されたものである。４塩基単位の繰り返しのマイクロサテライト型の多型として、９番染色体上では、Ｄ９Ｓ７７５，Ｄ９Ｓ３０４とＤ９Ｓ３０３などが知られており、ゲノムデータベース（インターネット上のアドレス：http://gdbwww.gdb.prg/）から情報入手できる。
【００１１】
これらの遺伝子多型を解析することにより、父方由来の染色体（アレル）と母方由来の染色体（アレル）を区別することができる。従って、ある遺伝子多型部位のヘテロ接合体（父方と母方のアレルが異なる個体）で、一方のアレルの消失（ＬＯＨ）を測定すれば、その遺伝子の欠失を検出することができる。しかし、一塩基置換型の多型を利用する場合は、ヘテロ接合体である頻度が最大でも50％であり、１つの遺伝子の欠失を調べるためには、ヘテロ接合体の出現頻度の高い複数の遺伝子多型を組み合わせる必要がある。また、遺伝子多型には民族間差が存在するので、欠失を診断したい遺伝子のなかから、その民族で出現頻度の高い遺伝子多型部位を選択する必要がある。
【００１２】
本発明の遺伝子多型部位をＰＣＲで増幅後、このＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られたＤＮＡ断片をＳＳＣＰで分析するヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）の検出方法としては、特開平９−２０１１９９等に示されている方法が利用できる。即ち、末端平滑化処理とは、２本鎖ＤＮＡ断片の末端１本鎖部分を平滑にすることであり、KlenowフラグメントやＴ４ＤＮＡポリメラーゼのような３→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、１本鎖部分を修復する酵素で処理するか、平滑に切断する制限酵素で処理して１本鎖部分を含む末端部を取り除けばよい。３′→５′エクソヌクレアーゼ活性有する耐熱性ポリメラーゼを用いてＰＣＲ法を施行する等の方法を用いることが可能である。分析しようとする２本鎖ＤＮＡ断片のセンス鎖とアンチセンス鎖の長さが異なったり不揃いの場合、熱変成して１本鎖にして分析すると、ＤＮＡ断片に由来するピークは分裂し、多重となる。これに対し、２本鎖ＤＮＡ断片を平滑化して分析すると単一ピークに収束し、遺伝子変異を起こしたＤＮＡ断片との識別が、極めて容易となる。ＰＣＲで増幅すべき遺伝子の領域は、１つの遺伝子多型を含む範囲であれば特に制限はないが、ＰＣＲで増幅し易い長さと範囲を選ぶ必要がある。長さは通常 100〜200bp で、範囲はＰＣＲに適したオリゴヌクレオチドプライマーの設計から決めればよい。ＤＮＡ断片の検出のためにＤＮＡ断片のラベル化をすることもできる。ＤＮＡ断片のラベル化としては、プライマーとして予めラベル化したプライマーを使用する方法、又は、ＰＣＲを実施する際にラベル化した塩基成分（例えば燐の放射性ラベル）を用いる方法、又は、ＰＣＲを実施した後にラベル化する方法がある。
ラベル化処理方法としては、ＳＳＣＰ後に検出し易いものであれば特に制限はなく、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン（酵素標識アビジンで検出）などで例えば、ＤＮＡの５’末端側を標識化すればよい。特に好ましくは、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端をあらかじめＡ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ（Ｃｙ５TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）で蛍光ラベル化したものを用いればよい。
【００１３】
本発明の初期の膀胱癌とは、一部修正して行ったＷＨＯのグレード分類ではＧ1 以下の初期癌を、ＴＭＮ分類（tumor-nodes-metastasis pathological staging system：American joint Committee on Cancer(1988)）では pＴa あるいは pＴis等の初期ステージの癌を意味している。
本発明の繰り返し単位の差が１単位以上であるマイクロサテライト型多型部分とは、例えば、繰り返し単位を特定の４塩基対とすると、遺伝子上のある特定の領域に、この塩基対の単位を多数繰り返す領域が存在し、その繰り返し数が、各アレル毎に異なっている。このため、遺伝子多型を形成する。この場合、アレル間の繰り返し単位数の差が無い場合を除き、理論的にはＬＯＨ分析は可能である。末端平滑化ＳＳＣＰ法を用いると、ピークの分離がシャープになり分析精度が向上し、繰り返し単位の差が１単位以上であれば分析できる。
【００１４】
【実施例】
以下に、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実験例１
１．検体の入手
膀胱癌患者のそれぞれの検体は、次のようにして入手して処理後、ＬＯＨを分析するまで保存した。経尿道切除術（ＴＵＲ）やバイオプシィーで入手した新鮮な組織の一部は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、−８０℃で凍結保存した。尿は、内視鏡検査前に、自然排尿で、５０ｍＬの遠心チューブに採取した。この尿を、１, ０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、沈渣を集めた。この沈渣に、４０ｍＬの生理食塩水を加えて再分散し、再度１, ０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、残ったペレットを−８０℃で凍結保存した。正常組織ＤＮＡには、末梢血の白血球（ＰＢＬ）を用いた。１０ｍＬの静脈血をヘパリン入りの採血管に採取し、３, ０００ｒｐｍで１５分間遠心後、血漿を廃棄した。この採血管に、０．２％の食塩水４０ｍＬを加えて溶血し、再度３, ０００ｒｐｍで１５分間遠心後、上清液を捨て、同様の操作を２回繰り返した。残ったペレットは、−８０℃で凍結保存した。
陰性対照には、良性の尿路疾患患者２０例の尿と血液を採取し、膀胱癌患者の検体と同様に処理して、−８０℃に凍結して保存した。
【００１５】
２．尿、組織、ＰＢＬからジェノムＤＮＡの抽出
凍結保存検体からのＤＮＡの抽出は、プロテナーゼＫで消化後、フェノール・クロロフォルムで抽出するデイビスら（Basic Method in Moleular Biology, Elsevir Science Publishing 社出版）や菅野らの（Lab. Invest. 68 ｐ361-366 Sugano等(1993)）の方法で行った。要約すると、６５℃で１５分間処理した検体に、プロテナーゼＫ１ｍｇ／ｍＬ、ＥＤＴＡ１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）０．４％、食塩１５０ｍｍｏｌ／Ｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液を加えて３７℃で一夜インキュベート後、この反応液に等量のフェノール：クロロフォルム＝１：１溶液を加えて２回ＤＮＡを抽出した。抽出液に、０．１容の３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液と２．５容の冷無水エタノールを加え、−２０℃で２時間冷却し、ＤＮＡを沈殿させた。尿と癌組織のサンプルには、エタノール沈殿のキャリアーとして２０μｇのグリコーゲンを加え、ＤＮＡの回収率を向上させた。この溶液を遠心して沈殿物を集め、さらに、１ｍＬの８０％エタノールを加えて洗浄後、真空遠心濃縮機で沈殿を乾固した。このＤＮＡを含む沈殿物は、ＴＥ緩衝液で再溶解した。
【００１６】
３．蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーの調製
第９染色体上の遺伝子多型マーカー増幅用のプライマー鎖、ＰＣＲ増幅及び末端平滑化ＳＳＣＰ法の条件と、それぞれのマーカーに対するヘテロ接合性の割合を、表１にまとめた。
【００１７】
【表１】
Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄTM（Ｃｙ５TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）を用いて、前向きと後ろ向きのＰＣＲ用プライマーの５’末端側のそれぞれを、indodicarbocyanine（Ｃｙ５）蛍光色素で標識した。第９染色体上のアレル消失のマーカーとして、５つの遺伝子多型を用いた。このうちの３つは、４塩基繰り返しの、２つは１塩基置換の多型であった。３つの４塩基の繰り返しのマイクロサテライト型マーカー、Ｄ９Ｓ７７５，Ｄ９Ｓ３０４とＤ９Ｓ３０３は、それぞれ、９ｐ２３−ｐ２２、９ｐ２１、９ｑ１３−ｑ２２．３と同定され、ゲノムデータベース（インターネット上のアドレス：http://gdbwww.gdb.prg/）から入手した。ヒトのアルドラーゼＢ遺伝子（ＡＬＤＯＢ）のイントロン８における１塩基置換の遺伝子多型は、９ｑ２２上と同定され、Brooks等から報告された（Am. J. Hum. Genet. 52 p835-840 Brooks 等(1993)）。９ｑ３４上と同定されたＶＡＶ２遺伝子上のＴ／Ｃ置換の遺伝子多型は、コスミドクローンＬ１９６Ｃ８株の塩基配列の測定データ（Gene Bank 登録番号ＡＣ００２１１１）に基づいており、国立がんセンターで見出されたものである。
【００１９】
４．ＰＣＲ
組織や血球より抽出したゲノムＤＮＡ（鋳型） 0.1μg 、各プライマーを1.6 ｐＭずつ、各ヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）を10ｎＭずつ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ 8.3）10μＭ、ＫＣｌ 50 ｍＭ、ＭｇＣｌ2 1.5 ｍＭ、ゼラチン 0.001％(w/v) 、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer社）1.25 unit を加え、全液量を 25 μl とした。この溶液について、表１に示した条件でＰＣＲを行った。最初の変成条件のみは95℃で５分間、その後は、それぞれ次の反応条件下で増幅反応を行った。変成条件は95℃で30秒間、アニーリングは、Ｄ９Ｓ７７５とＶＡＶ２に対しては55℃で30秒間、Ｄ９Ｓ３０３、Ｄ９Ｓ３０４とＡＬＤＯＢについては57℃で30秒間、延長反応は72℃で30秒間のサイクルを３０回繰り返し、最後に、72℃で７分間の延長反応を行った。
【００２０】
５．ＰＣＲ産物の３’末端平滑化
ＰＣＲで増幅したＤＮＡフラグメントは、Klenow fragment （宝酒造（株）製）で処理し、末端を平滑化した。５μL のＰＣＲ産物に、0.5 units の Klenow fragmentを加え、37℃で30分間反応した（Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
【００２１】
６．末端平滑化ＳＳＣＰ解析
分析には、Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄTMＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ファルマシア社）を用いた。前記の末端平滑化したＰＣＲ反応液１μL を、10μL のローディング液（組成は、ＥＤＴＡ 20 ｍＭ、ブロムフェノールブルー 0.05 ％を含む脱塩した90％ホルムアミド溶液）で希釈した。80℃で５分間加熱変成後、このうちの１μL を、トリス・グリシン緩衝液（トリス25ｍＭ、グリシン 192ｍＭ）を含む15％アクリルアミド（ビスアクリルアミド／アクリルアミド＝１／30）ゲル（高さ 300mm×幅 350mm×厚さ 0.52mm 、１回の泳動で最大４０検体の分析が可能）にアプライし分析した。電気泳動は、ゲルと同一の緩衝液系で、表１に示した条件、20Ｗ又は30Ｗで1,000 分間、恒温水槽で18℃又は28℃に保ちながら行った。測定データの解析には、解析用のソフトはＦｒａｇｍｅｎｔ ＭａｎａｇｅｒTM（ファルマシア社）を用いた（Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
【００２２】
７．癌細胞割合の定量化とＬＯＨのカットオフ値
健常対象者の父方と母方アレルのシグナル（ピーク高さ）を比較して、一方のアレルのピーク高さが著しく減少した場合、ＬＯＨと定義された。サンプル中の癌由来ＤＮＡの割合、即ち、癌細胞の割合は、次の式で推定できた（Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
測定の再現性は、健常者のＰＢＬからのＤＮＡサンプルを、同時に繰り返し測定した場合、２つのアレルからのシグナル比の変動係数（ＣＶ）として評価した。さらに、尿路疾患患者２０例の尿を分析し、それぞれのマーカーの癌細胞割合のカットオフ値を決めるための、陰性コントロールとして用いた。
【００２３】
８．組織病理学的診断
膀胱癌患者の尿とバイオプシーの検体の一部は、通常の細胞診や組織病理診断を行った。癌組織の病理診断のグレードは、ＷＨＯ分類を一部修正して、ステージは、ＴＭＮ分類（tumor-nodes-metastasis pathological staging system：American joint Committee on Cancer(1988)）に従って分類した。
【００２４】
実験例２ ＬＯＨに対する測定の再現性とカットオフ値
１人のドナーの同じＰＣＲ産物、又は、同じ遺伝子型を持つ複数のドナーからのＰＣＲ産物の末端平滑化ＳＳＣＰ分析値からアレルのシグナル比を計算して、正常な二倍体（一対の染色体）ＤＮＡのＣＶ値を求めた。同一ドナーの遺伝子上の各々の位置における同時再現性のＣＶ値は、それぞれ、Ｄ９Ｓ７７５が０．９％（ｎ＝９）、Ｄ９Ｓ３０４が４．９％（ｎ＝１４）、Ｄ９Ｓ３０３が１．２％（ｎ＝１６）、ＡＬＤＯＢが３．０％（ｎ＝１３）、ＶＡＶ２が１．４％（ｎ＝１６）であった。また、複数のドナーからのＰＣＲ産物の同時測定時のＣＶ値は、それぞれ、Ｄ９Ｓ７７５が３．７％（ｎ＝７）、Ｄ９Ｓ３０４が３．６％（ｎ＝７）、Ｄ９Ｓ３０３が３．９％（ｎ＝１２）、ＡＬＤＯＢが２．７％（ｎ＝８）、ＶＡＶ２が２．５％（ｎ＝７）であった。良性尿路疾患患者の尿サンプルを用いて同様の測定を行い、アレル比の異常の程度を、癌細胞割合として計算した。遺伝子の各位置におけるＬＯＨ陽性（癌陽性）のカットオフ値を、この良性尿路疾患群の癌細胞割合の＋３ＳＤ（標準偏差）とした。癌細胞割合のそれぞれのカットオフ値は、Ｄ９Ｓ７７５が１３％（ｎ＝１５）、Ｄ９Ｓ３０４が１９％（ｎ＝１８）、Ｄ９Ｓ３０３が１２％（ｎ＝１７）、ＡＬＤＯＢが１０％（ｎ＝８）、ＶＡＶ２が１３％（ｎ＝１１）であった。このカットオフ値を用いると、良性尿路疾患でＬＯＨ陽性となるものは、全く無かった（表３）。
【００２５】
実施例１ 膀胱癌患者９番染色体のＬＯＨの分析
膀胱癌患者３４例の尿と組織を対象として、９番染色体上の５ヶ所の遺伝子多型部位、Ｄ９Ｓ７７５、Ｄ９Ｓ３０４、Ｄ９Ｓ３０３、ＡＬＤＯＢ、ＶＡＶ２を、実験例１の方法で分析した。分析例として、膀胱癌の症例Ｎｏ３３の電気泳動パターンを図１に示した。それぞれ、ＢはＰＢＬでの、Ｔは癌組織での、Ｕは尿でのパターンを示す。また、各遺伝子多型部位でのピーク高さの比から計算した、癌組織と尿での癌細胞割合（％）を括弧内に示した。この例では、分析した全ての遺伝子多型部位で、尿と組織の両方ともＬＯＨが陽性であった。
【００２６】
全例の分析結果をまとめ、図２に示した。Ｔは癌組織での、Ｕは尿での結果を示す。それぞれ、●はＬＯＨ陽性、○は保持（ＬＯＨ陰性）、ＮＡはＰＣＲ不能、縦線はホモ接合体で遺伝子多型の解析が不能を示す。９番染色体上の５つの遺伝子多型マーカーを組み合わせることで、少なくとも１つ以上の遺伝子多型部位が有効（情報供給可能：ヘテロ接合性で、父方と母方でピークの位置がずれ、ＬＯＨの分析に使える）となった。有効な遺伝子多型部位は、３／３４（８．８％）が１ヶ所のみ、５／３４（１４．７％）が２ヶ所、残りの２６／３４（７６．５％）が３ヶ所以上であった。９番染色体のＬＯＨは、癌組織では２６／３４（７６％）が陽性、尿サンプルからでは２４／３３（７２．７％）が陽性であった（表２〜３）。
【００２７】
癌サンプルにおけるＬＯＨ陽性の頻度と、癌のステージ、組織学的グレードとの相関をまとめ、表２に示した。各遺伝子多型部位におけるＬＯＨ陽性の頻度は６０．０％（Ｄ９Ｓ７７５とＶＡＶ２）から６６．７％（Ｄ９Ｓ３０３）で、分析した９番染色体上の５つの多型部位のＬＯＨを組み合わせると２６／３４（７６．５％）がＬＯＨ陽性であった。癌のステージ毎のＬＯＨをみると、 pＴa が１２／１５（８０％）、 pＴ1 が１０／１４（７１．４％）、 pＴ2 以上４／５（８０％）であった。また、グレード別では、Ｇ1 が７／１０（７０％）、Ｇ2 が８／１０（８０％）、Ｇ3 が１１／１４（７８．６％）であった。
【００２８】
【表２】
同じ患者からの癌組織と尿検体のアレルの状態を比較した（図２）。尿検体では、癌患者３４例のうち３３例が分析可能で、２４／３３（７２．７％）がＬＯＨ陽性であった。尿を分析した場合のＬＯＨ陽性の頻度と、癌のステージ、組織学的グレードの間の相関を、表３にまとめた。各遺伝子多型部位におけるＬＯＨ陽性の頻度は４６．７％（ＶＡＶ２）から６９．２％（Ｄ９Ｓ３０３）で、分析した９番染色体上の５つの多型部位のＬＯＨを組み合わせると２４／３３（７２．７％）がＬＯＨ陽性であった。癌のステージ毎のＬＯＨは、 pＴa が１１／１５（７３．３％）、 pＴ1 が８／１３（６１．５％）、 pＴ2 以上５／５（１００％）であった。また、グレード別では、Ｇ1 が６／１０（６０％）、Ｇ2 が６／９（６６．７％）、Ｇ3 が１２／１４（８５．７％）であった。１７番染色体上の癌抑制遺伝子ｐ５３中の遺伝子多型部位のＬＯＨを分析した場合、初期の膀胱癌は検出できなかった（特開平９−２０１１９９）が、９番染色体の欠失を検出することにより、 pＴa ステージ、Ｇ1 グレードの初期の膀胱癌まで高率に検出できるようになった。
【００３０】
【表３】
尿と癌組織とも測定できた症例で比較すると、２２／３３（６６．７％）が両方ともＬＯＨ陽性で、５例（１５％）が、尿、癌組織ともＬＯＨ陰性で、９番染色体は保持されていた。診断精度は８１．７％であった。癌組織では２６例が、尿では２４例がそれぞれＬＯＨ陽性であった。２例（患者Ｎｏ. １とＮｏ. ３０）では、尿のみＬＯＨ陽性であった（表４）。
【００３２】
【表４】
実施例２ 尿のＬＯＨと細胞診の感度の比較
膀胱患者３３例の尿の細胞診を行い、実施例１の尿のＬＯＨ分析結果と比較した（表５）。尿の９番染色体のＬＯＨでは２４例が陽性であるのに対し、細胞診では１２例が陽性で、尿ＬＯＨ分析法の僅か５０％であった。また、ＬＯＨ陰性の９例のうち、２例（２２％）が細胞診で陽性であった。癌組織で９番染色体のＬＯＨ陽性の２６例をみると、２２例（８５％）は尿のＬＯＨが陽性で、４例（１５％）がＬＯＨ陰性であった。この尿ＬＯＨ陽性２２例のうちで、僅か１１例（５０％）が細胞診陽性であった。また、この尿ＬＯＨ陰性４例の全ては、細胞診でも陰性だった。１７番染色体上の癌抑制遺伝子ｐ５３中の遺伝子多型部位のＬＯＨを用いた場合、尿の細胞診より膀胱癌のスクリーニング性能は劣っていた（特開平９−２０１１９９）が、９番染色体の欠失を検出することにより、スクリーニング性能は大幅に向上した。
【００３４】
【表５】
【発明の効果】
本発明の尿を検体とする染色体の欠失を検出する膀胱癌の遺伝子検査法を用いると、膀胱癌を、初期の段階から効率よくスクリーニングできるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】膀胱癌症例の末端平滑化ＳＳＣＰ分析の電気泳動パターン
【図２】膀胱癌患者の癌組織と尿について、９番染色体上のＬＯＨの分析結果
Claims (7)
- 膀胱の遺伝子検査法であって、尿中の細胞から抽出したＤＮＡより、９番染色体の多型部位Ｄ９Ｓ３０４、多型部位Ｄ９Ｓ３０３、多型部位ＡＬＤＯＢ、多型部位Ｄ９Ｓ７７５、又は多型部位ＶＡＶ２の少なくとも２つ以上を解析してＬＯＨを解析し、９番染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠損を検出する方法であって、多型部位Ｄ９Ｓ３０４、多型部位Ｄ９Ｓ３０３、多型部位ＡＬＤＯＢ、多型部位Ｄ９Ｓ７７５、又は多型部位ＶＡＶ２を解析するために、それぞれ、多型部位Ｄ９Ｓ３０４を含む遺伝領域を複製できる第１のプライマーセット、多型部位Ｄ９Ｓ３０３を含む遺伝領域を複製できる第２のプライマーセット、多型部位ＡＬＤＯＢを含む遺伝領域を複製できる第３のプライマーセット、多型部位Ｄ９Ｓ７７５を含む遺伝領域を複製できる第４のプライマーセット、又は多型部位ＶＡＶ２を含む遺伝領域を複製できる第５のプライマーセットを用い、該第１から第５のプライマーセットは、それぞれ以下に記載する遺伝子検査用試薬セットからなる、膀胱の遺伝子検査法：
第１のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第１プライマー；
(a) 5’GTG CAC CTC TAC ACC CAG AC 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第２プライマー；
(b) 5’TGT GCC CAC ACA CAT CTA TC 3’の塩基配列からなる；
第２のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第３プライマー；
(a) 5’CAA CAA AGC AAG ATC CCT TC 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第４プライマー；
(b) 5’ TAG GTA CTT GGA AAC TCT TGG C 3’の塩基配列からなる；
第３のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第５プライマー；
(a) 5’ GGG CTT GAC TTT CCA ACA CG 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第６プライマー；
(b) 5’ TCT AGC CTC AAT CCT CAT AC 3’の塩基配列からなる；
第４のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第７プライマー；
(a) 5’ AAA GTA GCC ATC CGT GTG T 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第８プライマー；
(b) 5’ GCT TTC TTT GAT GGT TTA CAG 3’の塩基配列からなる；
第５のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第９プライマー；
(a) 5’ GTG TCT GCA CTG GCC ACA CT 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第１０プライマー；
(b) 5’ TCC AAA GGA CCT TCT CCA AA 3’の塩基配列からなる。 - 請求項１記載の遺伝子検査法であって、複数の多型部位に対応した複数のＬＯＨ分析結果を同時に表示する方法。
- 請求項２記載の遺伝子検査法であって、膀胱組織から抽出したＤＮＡにおける９番染色体の多型部位のＬＯＨ分析結果を、尿中の細胞から抽出したＤＮＡにおける９番染色体の多型部位のＬＯＨ分析結果と同時に表示する方法。
- 多型部位Ｄ９Ｓ３０４を含む遺伝領域を複製できる第１のプライマーセット、多型部位Ｄ９Ｓ３０３を含む遺伝領域を複製できる第２のプライマーセット、多型部位ＡＬＤＯＢを含む遺伝領域を複製できる第３のプライマーセット、多型部位Ｄ９Ｓ７７５を含む遺伝領域を複製できる第４のプライマーセット、又は多型部位ＶＡＶ２を含む遺伝領域を複製できる第５のプライマーセットの少なくとも２つ以上含み、所定の多型部位を含む遺伝領域を複製し、膀胱の９番染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠損を検出する遺伝子検査用試薬セットであって、該第１から第５のプライマーセットは、それぞれ以下に記載する遺伝子検査用試薬セットからなる、膀胱の９番染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠損を検出する遺伝子検査用試薬セット：
第１のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第１プライマー；
(a) 5’GTG CAC CTC TAC ACC CAG AC 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第２プライマー；
(b) 5’TGT GCC CAC ACA CAT CTA TC 3’の塩基配列からなる；
第２のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第３プライマー；
(a) 5’CAA CAA AGC AAG ATC CCT TC 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第４プライマー；
(b) 5’ TAG GTA CTT GGA AAC TCT TGG C 3’の塩基配列からなる；
第３のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第５プライマー；
(a) 5’ GGG CTT GAC TTT CCA ACA CG 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第６プライマー；
(b) 5’ TCT AGC CTC AAT CCT CAT AC 3’の塩基配列からなる；
第４のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第７プライマー；
(a) 5’ AAA GTA GCC ATC CGT GTG T 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第８プライマー；
(b) 5’ GCT TTC TTT GAT GGT TTA CAG 3’の塩基配列からなる；
第５のプライマーセットが以下のプライマーを含む遺伝子検査用試薬セット；
以下の(a)の第９プライマー；
(a) 5’ GTG TCT GCA CTG GCC ACA CT 3’の塩基配列からなる；
以下の(b)の第１０プライマー；
(b) 5’ TCC AAA GGA CCT TCT CCA AA 3’の塩基配列からなる。 - 尿中の細胞から抽出したＤＮＡより、９番染色体の多型部位Ｄ９Ｓ３０４、多型部位Ｄ９Ｓ３０３、多型部位ＡＬＤＯＢ、多型部位Ｄ９Ｓ７７５、又は多型部位ＶＡＶ２の少なくとも２つ以上を解析してＬＯＨを解析し、９番染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠損を検出する、膀胱の遺伝子検査法であって、
多型部位Ｄ９Ｓ３０４は、９番染色体における、以下の(a)及び(b)の塩基配列の間に存在する４塩基繰り返しの遺伝子多型であり、
(a) 5’ GTG CAC CTC TAC ACC CAG AC 3’
(b) 5’ TGT GCC CAC ACA CAT CTA TC 3’
多型部位Ｄ９Ｓ３０３は、９番染色体における、以下の(a)及び(b)の塩基配列の間に存在する４塩基繰り返しの遺伝子多型であり、
(a) 5’ CAA CAA AGC AAG ATC CCT TC 3’
(b) 5’ TAG GTA CTT GGA AAC TCT TGG C 3’
多型部位ＡＬＤＯＢは、９番染色体における、以下の(a)及び(b)の塩基配列の間に存在する１塩基変異の遺伝子多型であり、
(a) 5’ GGG CTT GAC TTT CCA ACA CG 3’
(b) 5’ TCT AGC CTC AAT CCT CAT AC 3’
多型部位Ｄ９Ｓ７７５は、９番染色体における、以下の(a)及び(b)の塩基配列の間に存在する４塩基繰り返しの遺伝子多型であり、
(a) 5’ AAA GTA GCC ATC CGT GTG T 3’
(b) 5’ GCT TTC TTT GAT GGT TTA CAG 3’
多型部位ＶＡＶ２は、９番染色体における、以下の(a)及び(b)の塩基配列の間に存在する１塩基変異の遺伝子多型である。
(a) 5’ GTG TCT GCA CTG GCC ACA CT 3’
(b) 5’ TCC AAA GGA CCT TCT CCA AA 3’ - 請求項５記載の遺伝子検査法であって、複数の多型部位に対応した複数のＬＯＨ分析結果を同時に表示する方法。
- 請求項６記載の遺伝子検査法であって、膀胱組織から抽出したＤＮＡにおける９番染色体の多型部位のＬＯＨ分析結果を、尿中の細胞から抽出したＤＮＡにおける９番染色体の多型部位のＬＯＨ分析結果と同時に表示する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06821998A JP4004628B2 (ja) | 1998-03-18 | 1998-03-18 | 尿を用いる膀胱癌の遺伝子検査法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06821998A JP4004628B2 (ja) | 1998-03-18 | 1998-03-18 | 尿を用いる膀胱癌の遺伝子検査法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11341999A JPH11341999A (ja) | 1999-12-14 |
| JP4004628B2 true JP4004628B2 (ja) | 2007-11-07 |
Family
ID=13367486
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06821998A Expired - Lifetime JP4004628B2 (ja) | 1998-03-18 | 1998-03-18 | 尿を用いる膀胱癌の遺伝子検査法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4004628B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4347609B2 (ja) | 2003-05-28 | 2009-10-21 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 膀胱癌検査キット |
| FR2938269B1 (fr) * | 2008-11-13 | 2012-09-28 | Array Genomics | Procede de detection urinaire du cancer de la vessie |
-
1998
- 1998-03-18 JP JP06821998A patent/JP4004628B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11341999A (ja) | 1999-12-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1185693B1 (en) | Methods for improving sensitivity and specificity of screening assays for cancer and precancer | |
| JP2003508083A (ja) | 疾患検出のための方法 | |
| US5578450A (en) | Tumor-specific genomic instability as a prognostic indicator | |
| JP2000500346A (ja) | Ｋｉ−ｒａｓ突然変異の検出方法および該検出方法を実施するためのキット | |
| JPH10506527A (ja) | 組織中の高変異可能な核酸配列の検出 | |
| CA2372667A1 (en) | Methods of detecting colorectal disease by conduction an assay to detect a mutation in a bat-26 locus | |
| FR2810677A1 (fr) | Procede de diagnostic in vitro du cancer de la prostate et kit de mise en oeuvre | |
| US20040259101A1 (en) | Methods for disease screening | |
| KR101803108B1 (ko) | 방광암의 비뇨기적 검출 방법 | |
| JP4004628B2 (ja) | 尿を用いる膀胱癌の遺伝子検査法 | |
| US20130022979A1 (en) | 3.4kb MITOCHONDRIAL DNA DELETION FOR USE IN THE DETECTION OF CANCER | |
| KR101449562B1 (ko) | 암 검출에 사용하기 위한 3.4 케이비 미토콘드리아 디엔에이 결실 | |
| CN113430272B (zh) | 一种食管癌或癌前病变的诊断或辅助诊断的试剂、试剂盒及其应用 | |
| JP4347609B2 (ja) | 膀胱癌検査キット | |
| US9920376B2 (en) | Method for determining lymph node metastasis in cancer or risk thereof and rapid determination kit for the same | |
| JP4042826B2 (ja) | Ｄｎａ変異の検出法 | |
| EP4299762A1 (en) | Oral cancer detection kit, use of reagent, reagent, oral cancer detection device, information acquisition method, and program | |
| Guo et al. | Allelic imbalance on chromosomes 3p, 9p and 17p in malignant progression of laryngeal mucosa | |
| JP4587715B2 (ja) | 再構成された遺伝子の単クローン性を判定する方法、及びこれを利用した腫瘍性病変の鑑別方法 | |
| TW202146658A (zh) | 用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法、其套組、其分析器及其生物標誌 | |
| CN118064582A (zh) | 检测snp标志物的试剂在制备肺癌诊断、治疗和判断肺癌预后产品中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 19980319 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20030512 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20031031 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20031023 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20031226 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040519 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040519 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070209 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070406 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070511 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070709 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070803 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070822 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110831 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120831 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120831 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130831 Year of fee payment: 6 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |