CN117144003A - 用于mrd检测的癌种特异核心探针组的设计方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种用于MRD检测的癌种特异核心探针组的设计方法及其应用。本发明的癌种特异核心探针组的设计方法纳入了目标癌种高证据等级的用药突变以及目标癌种的高频突变位点，用于MRD监测能够起到监测肿瘤进化的作用，在一定程度上克服了肿瘤的时空异质性；并且经过多个数据库验证对多种实体瘤实现了全面覆盖；经临床样本验证，本发明的探针组合捕获效率优异，均一性良好。
Description
技术领域
本发明属于核酸测序领域，具体地，本发明涉及一种癌种特异核心探针组的设计方法及其应用。
背景技术
手术切除是早期实体瘤受试者的首要治疗方法，但是相当多的受试者在手术后仍然出现局部复发或远处转移。目前，癌症的预后分层主要是基于临床病理参数，如TNM分期、病理亚型、肿瘤分级等。但是，通过这些指标进行预后分层的灵敏度和特异性有限，迫切需要更有效的方法来识别复发风险高和/或有可能从辅助治疗中获益的受试者。研究表明，在肿瘤进展阶段可释放肿瘤细胞和DNA至外周血，形成循环肿瘤DNA(ctDNA)，其携带有肿瘤特异性遗传学改变的自由基因组片段，与肿瘤发生发展、抵抗性耐药及复发转移等具有相关性，对于肿瘤的诊断、治疗及预后评估具有重要价值，检测肿瘤受试者血液中ctDNA可以提供快速、高效、相对无创性的“液体活检”。
分子/微小残留病灶(Molecular/Minimal Residue Disease，MRD)是指肿瘤患者接受根治性治疗后疾病达到影像学完全缓解，但体内仍存在影像学方法无法检出的残留肿瘤细胞或者微小病灶，可通过液体活检发现的癌来源分子异常，代表着癌症的持续存在和临床进展可能。这阶段残留的肿瘤细胞数量可能非常很少，未达到影像学可观测到的水平，属于肿瘤进展的隐匿阶段，可能暂时不会引起任何的体征或症状，却是肿瘤复发或转移的潜在隐患。分子/微小残留病灶的检测具有良好的预后价值。基于循环肿瘤DNA(ctDNA)的MRD检测可以发现这种分子异常，用于复发风险分层、治疗反应评估和疾病监测，为临床治疗决策提供重要参考。
基于高通量测序的MRD检测方法主要分为群体定制策略和个性化定制策略。个性化定制策略的MRD检测方法具有高灵敏度、高特异性和高性价比等优点，但是无法监测肿瘤进化产生的耐药突变。本领域亟需一种覆盖用药以及人群高发生率突变的癌种特异性核心探针组。
发明内容
本发明提供了一种用于MRD检测的癌种特异核心探针组的设计方法及其应用。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种癌种特异核心探针组的设计方法，所述癌种特异核心探针组基于如下的一种或者多种基因和/或突变设计：指南或专家共识级别的用药突变；具有明确临床价值，且有强生物标志物预测价值的非指南/非共识级的基因和突变；目标癌种中的驱动基因突变；目标癌种的热点及高频突变基因/区域。
在一些实施方案中，所述的癌种特异核心探针组按照以下优先顺序来选择所述基因和/或突变：等级1包括指南或专家共识级别的用药突变；等级2包括具有明确临床价值，且有强生物标志物预测价值的非指南/非共识级的基因和突变；等级3包括目标癌种中的驱动基因突变；等级4包括目标癌种的高人群发生率的基因/区域。
在一些实施方案中，所述的高人群发生率的基因/区域计算方法按照如下步骤进行：
(1)从目标癌种数据库中获得每个患者/样本的突变信息，并根据突变信息注释出对应的转录本和外显子信息；
(2)计算覆盖目标外显子探针的突变密度系数：
目标外显子探针突变密度系数＝(a/m)/length，
a：目标外显子在人群中的突变总数，
m：人群中的所有突变数量，
length：覆盖目标外显子的探针长度，通过外显子的长度进行估算：
外显子≤40bp，探针长度:120bp，外显子两端延伸长度≥40bp，
外显子>40bp，探针长度：外显子长度+80bp，外显子两端各向外延伸40bp；
(3)携带突变的外显子人群发生率计算：
携带突变的外显子人群发生率＝b/n，
b：目标外显子中携带突变的患者数，
n：患者总数；
(4)先根据目标外显子探针突变密度系数降序排序，再根据携带突变的外显子人群发生率降序排序，排序靠前的基因/区域优先级更高。
在一些实施方案中，所述的高人群发生率计算方法使用的目标癌种数据库包括但不限于：TCGA数据库、MSK数据库等常用的癌症基因组数据库。
在一些实施方案中，所述的指南或专家共识级别的用药突变为目标癌种的NCCN指南推荐的I类用药突变，和/或CSCO指南I级推荐的用药突变，和/或目标癌种中FDA或NMPA批准的用药突变，国内外专家共识推荐的用药靶点。
在一些实施方案中，步骤3中的癌种特异固定核心探针组中肺癌、肠癌、乳腺癌或者泛癌种探针组的探针数目范围为40-100条，优选为40条、50条、60条、70条、80条、90条、100条。
在一些实施方案中，步骤3中的癌种特异固定核心探针组的探针长度为80-160个碱基对，优选为80、90、100、110、120、130、140、150、160个碱基对长度。
在一些实施方案中，所述的目标癌种为肺癌，并且所述的癌种特异核心探针组的监测位点包括下述基因：EGFR、ERBB2、MET、BRAF、KRAS、ALK、PIK3CA、TP53。
在一些实施方案中，所述的目标癌种为肠癌，并且所述的癌种特异核心探针组的监测位点包括下述基因：BRAF、KRAS、NRAS、TP53、PIK3CA、APC。
在一些实施方案中，所述的目标癌种为乳腺癌，癌种特异核心探针组的监测位点包括下述基因：PIK3CA、AKT1、ESR1、ERBB2、TP53、PTEN、GATA3。
在一些实施方案中，所述的目标癌种为除肺癌、肠癌、乳腺癌之外的其他泛实体瘤，癌种特异的核心探针组的监测位点包括下述基因：BRAF、KRAS、PIK3CA、CDKN2A、TP53。
在一些实施方案中，所述的癌种特异核心探针组可用于对受试者的生物样本进行MRD的检测，优选地，所述的对受试者进行MRD检测还包括癌种特异核心探针组与其他探针组的任意组合。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种如上所述的方法用于癌种特异核心探针组监测位点的筛选系统，所述的系统包括以下模块：
排序模块，用于对突变或基因进行排序；
癌种特异核心探针组监测位点确定模块，用于确定目标癌种的癌种特异核心探针组的监测位点。
在一些实施方案中，所述的筛选系统，其用于执行如上所述的筛选方法。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种存储介质，其记载了用于运行如上所述的方法或者如上所述的系统。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种如上所述的方法得到的癌种特异核心探针组。
附图说明
图1示出了本公开的不同大小的探针组(panel)的捕获效率。
图2示出了本公开的癌种特异核心探针组对各个癌种的人群覆盖度。
图3示出了本公开的癌种特异核心探针组在不同癌种患者中的突变检出数目分布。
图4示出了本公开的癌种特异核心探针组的捕获效率。
图5A示出了本公开的癌种特异核心探针组中≥0.2倍平均测序深度的探针比例。
图5B示出了本公开的癌种特异核心探针组中≥0.5倍平均测序深度的探针比例。
图6示出了本公开的癌种特异核心探针组的探针深度系数。
具体实施方式
在本申请中，术语“MRD”可以是三个术语的缩写，分别是分子残留病灶(molecularresidual disease)、可测量残留病灶(measurable residual disease)和微小残留病灶(minimal residual disease)。MRD反映了肿瘤病灶的残留状况。经过治疗后，肿瘤受试者体内可能还会有少量的肿瘤细胞残留，而这些肿瘤细胞数量可能少到不引起任何症状体征，通过细胞学镜检或血清学检查等传统手段通常无法检测到，检测需要借助灵敏度高的现代前沿技术如流式细胞术、PCR、NGS等。
在本申请中，术语“Panel”是高通量基因检测和基因测序发展起来后用的一个词语，它是指在检测中不只是检测一个位点、一个基因。而是同时检测多个基因、多个位点。这些位点和基因需要按照一个标准进行选择和组合，从而构成一个检测Panel。因此基因检测Panel可以理解为基因组合、基因集合或探针组合。
在本申请中，术语“深度测序”是指针对序列的每个区域的大量重复读数的一般概念。
在本申请中，“测序数据”是指技术人员已知的关于核酸分子的任何序列信息。序列数据可以包括有关必须转换成核酸序列的DNA或RNA序列、修饰的核酸、单链或双链序列、或可替代地氨基酸序列的信息。序列数据可以另外包括关于测序设备、获取日期、读段长度、测序方向、已测序实体的来源、相邻序列或读段、重复的存在或本领域技术人员已知的任何其它合适的参数的信息。序列数据可以本领域技术人员已知的任何合适的格式、档案、编码或文档来呈现。
在本申请中，术语“肿瘤”是指团块或赘生物，其本身被定义为细胞的异常新生长，这种细胞通常比正常细胞生长更快，并且如果不治疗将会继续生长，有时会导致对邻近结构的损害。肿瘤大小可能相差很大。肿瘤可以是实体的或液体填充的。肿瘤可以指良性(非恶性，通常无害)或恶性(能够转移)的生长。一些肿瘤可能包含良性赘生性细胞(例如原位癌)，同时还包含恶性癌细胞(例如腺癌)。应该理解为包括位于全身多个位置的赘生物。因此，出于本公开的目的，肿瘤包括原发性肿瘤、淋巴结、淋巴组织和转移性肿瘤。
在本申请中，所述癌症的非限制性实例包括胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结肠直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉性结肠直肠癌、结肠直肠腺癌、胃肠间质瘤(GIST)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食管癌、食管鳞状细胞癌、食管腺癌、眼黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、肾母细胞瘤、肝癌、肝上皮癌、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、鼻咽癌(NPC)、成神经细胞瘤、口腔癌、口腔鳞状细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状肿瘤、腺泡细胞癌、前列腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、小肠癌、胃癌、胃上皮癌、子宫癌或子宫肉瘤。
在一些实施方案中，所述测序技术包括但不限于Illumina、华大智造、吉因加。
在本申请中，术语“受试者”是指任何动物、哺乳动物或人。受试者患有、可能患有或怀疑患有一种或多种疾病。受试者可能患有癌症，受试者可能表现出与癌症相关的症状，受试者可能并未表现与癌症相关的症状，或者受试者可能并未被诊断出患有癌症。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在本申请中，术语“CSCO指南”是指中国临床肿瘤学会(Chinese Society ofClinical Oncology)发布的各种恶性肿瘤临床实践指南。
在本申请中，术语“TCGA数据库”中TCGA(The Cancer Genome Atlas Program)即癌症基因组图谱计划。目前收录了来自20000个病人，33个癌症的数据。包括了基因组，转录组，表观遗传，蛋白组等各个组学数据，以及临床样本信息。
在本申请中，术语“MSK数据库”是一个由美国纪念斯隆·凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center，简称MSKCC)提供的数据目录，收录了该中心的科研人员和合作伙伴所产生的各种生物医学数据，包括基因组、转录组、蛋白质组、代谢组、临床试验等数据。
本发明的癌种特异核心探针组的设计方法纳入了目标癌种高证据等级的用药突变以及目标癌种的高频突变位点，可以和个性化探针组叠加用于MRD监测，起到监测肿瘤进化的作用，在一定程度上克服了肿瘤的时空异质性。
本发明的癌种特异核心探针组经TCGA数据库和吉因加数据库验证，对多种实体瘤实现了全面覆盖，在符合中国人群肿瘤突变特征的吉因加数据库中，肠癌、肺癌和乳腺癌的覆盖度分别为98.22％、89.95％和85.96％。在肠癌和卵巢癌中检出突变中位数为2，在肺癌、乳腺癌、食管癌等癌症中的检出突变中位数为1。经临床样本验证，本发明的探针组合捕获效率优异(中位＞40％)，均一性良好。
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
实施例1：核心探针筛选和性能测试
核心探针用于监测肿瘤进化。
1.1.癌种特异核心探针组大小的确定
对不同大小探针组的捕获效率统计后发现，随着探针组增大，捕获效率逐渐增加，然后趋于平稳(图1)。探针组大小达到5kb时，捕获效率基本稳定在30％以上，可满足检测要求。更小的探针组会导致更低的捕获效率，最终影响检测性能。综上所述，癌种特异核心探针组的大小设置为5kb。
1.2.按照以下规则进行核心探针区域的筛选
1.筛选等级1：目标癌种NCCN指南推荐的I类用药突变，CSCO指南I级推荐的用药突变；目标癌种中美国食品药品监督管理局(FDA)或中国药品监督管理局(NMPA)批准的用药突变；目标癌种国内外专家共识推荐的用药靶点。
针对肺癌、结直肠癌和乳腺癌设计单独核心探针，针对其他癌种设计泛癌种核心探针。见表1。
表1：针对肺癌、结直肠癌、乳腺癌、泛癌的探针设计
2.筛选等级2：文献报道的目标癌种中具有明确临床价值，且有强生物标志物预测价值的非指南/非共识级的基因和突变；等级3：文献报道的目标癌种中的驱动基因突变；等级4：TCGA数据库、MSK数据库和Cosmic数据库中，目标癌种的高人群发生率的基因/区域。见表2。
从上述根据优先级排序好的基因/突变中选择出优先级靠前的非指南级别的基因/突变，将这些突变和1中筛选出的突变合并，直至达到预期的panel大小(5kb)。
表2：筛选出的符合等级2-等级4规则的突变
1.3.核心探针的覆盖评估
为了评估核心探针在人群中的覆盖度，统计核心探针在吉因加数据库和TCGA数据库中单点覆盖情况(≥1个位点)。
(1)单癌种核心探针覆盖度
肺癌核心探针在在吉因加数据库和TCGA数据库中覆盖度分别为89.95％和80.20％；肠癌核心探针在吉因加数据库人群覆盖为98.22％，在TCGA数据库中覆盖度为92.53％；乳腺癌分别为85.96％和71.93％(图2)。
吉因加和TCGA数据库覆盖度差异可能与人种、地域等因素有关，吉因加数据库人群主要为中国人群。总体来说核心探针人群覆盖度优异。
(2)泛实体瘤种核心探针覆盖度
泛实体瘤核心探针检测范围包括食管癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、尿路上皮癌等11种癌种。泛癌核心探针在TCGA数据库食管癌人群中的覆盖比例为95.33％，在吉因加数据库食管癌人群覆盖为88.65％；在TCGA数据库胰腺癌人群中的覆盖比例为93.79％，在吉因加数据库胰腺癌人群覆盖为80.54％；在TCGA数据库卵巢癌人群中的覆盖比例为90.68％，在吉因加数据库卵巢癌人群覆盖为88.86％；在TCGA数据库子宫内膜癌人群中的覆盖比例为76.79％，在吉因加数据库子宫内膜癌人群覆盖为77.8％；在TCGA数据库胃癌人群中的覆盖比例为75.95％，在吉因加数据库胃癌人群覆盖为66.82％；在TCGA数据库尿路上皮癌人群中的覆盖比例为71.52％，在吉因加数据库卵巢癌人群覆盖为61.34％(图2)。
1.4.核心探针的检出突变数评估
对核心探针在TCGA和吉因加数据库中的检出突变数目进行统计：肠癌位点突变数中位均为2，肺癌突变数中位值均为1，乳腺癌突变数中位值均为1；其他实体瘤中食管癌、胰腺癌突变数中位值均为1，卵巢癌突变中位2(图3)。在同一癌种中，吉因加数据库和TCGA数据库检出突变数目中位值相同，说明核心探针包含的基因在不同人群中实现了很好的覆盖。
1.5.核心探针对临床样本的捕获效率、均一性评估
使用临床样本对上述设计的4种核心探针的性能进行测试，包括肺癌、肠癌、乳腺癌、泛实体瘤样本各4例，每例样本重复检测2次。
(1)探针捕获效率
根据临床样本信息整理癌种特异核心探针的捕获效率，肠癌核心探针捕获效率中位数为44.5％(30.12％-56.62％)，肺癌核心探针捕获效率中位数为43.4％(34.88％-48.99％)，乳腺癌核心探针中位数为41.51％(38.62％-49.04％)，泛实体瘤核心探针捕获效率中位数为40.08％(36.23％-43.66％)，探针捕获性能良好(图4)。
(2)探针均一性
根据临床样本信息，汇总≥0.2倍平均深度的样本比例(图5A)，≥0.5倍平均深度样本比例(图5B)的结果。在≥0.2倍平均深度的样本比例结果中，除肠癌核心探针的中位数为99.98％外，其他3探针的中位数均为100％；在≥0.5倍平均深度的样本比例结果中，4个癌种特异核心探针的中位数均在97％以上。结果表明，4种癌种特异核心探针的均一性较高，表现良好。
(3)探针深度系数
4种核心探针深度系数0.2-2之间，肠癌探针系数范围0.28-1.47之间，中位值1.03；肺癌探针系数范围0.56-1.87，中位值1.22；乳腺癌探针系数范围0.4-1.78，中位值1.04；泛癌探针系数范围0.37-1.83，中位值1.10(图6)。整体探针深度系数良好。
Claims (12)
1.一种用于MRD检测的癌种特异核心探针组的设计方法，所述癌种特异核心探针组基于如下的一种或者多种基因和/或突变设计：指南或专家共识级别的用药突变；具有明确临床价值，且有强生物标志物预测价值的非指南/非共识级的基因和突变；目标癌种中的驱动基因突变；目标癌种的高人群发生率的基因/区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的癌种特异核心探针组按照以下优先顺序来选择所述基因和/或突变：等级1包括指南或专家共识级别的用药突变；等级2包括具有明确临床价值，且有强生物标志物预测价值的非指南/非共识级的基因和突变；等级3包括目标癌种中的驱动基因突变；等级4包括目标癌种的高人群发生率的基因/区域。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高人群发生率的基因/区域按照如下步骤进行计算：
(1)从目标癌种数据库中获得每个患者/样本的突变信息，并根据突变信息注释出对应的转录本和外显子信息；
(2)计算覆盖目标外显子探针的突变密度系数：
目标外显子探针突变密度系数＝(a/m)/length，
a：目标外显子在人群中的突变总数，
m：人群中的所有突变数量，
length：覆盖目标外显子的探针长度，通过外显子的长度进行估算：
外显子≤40bp，探针长度:120bp，外显子两端延伸长度≥40bp，
外显子>40bp，探针长度：外显子长度+80bp，外显子两端各向外延伸40bp；
(3)携带突变的外显子人群发生率计算：
携带突变的外显子人群发生率＝b/n，
b：目标外显子中携带突变的患者数，
n：患者总数；
(4)先根据目标外显子探针突变密度系数降序排序，再根据携带突变的外显子人群发生率降序排序，排序靠前的基因/区域优先级更高。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的指南或专家共识级别的用药突变为目标癌种的NCCN指南推荐的I类用药突变，和/或CSCO指南I级推荐的用药突变，和/或目标癌种中FDA或NMPA批准的用药突变，国内外专家共识推荐的用药靶点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标癌种为肺癌，并且所述的癌种特异核心探针组的监测位点包括下述基因：EGFR、ERBB2、MET、BRAF、KRAS、ALK、PIK3CA、TP53。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标癌种为肠癌，并且所述的癌种特异核心探针组的监测位点包括下述基因：BRAF、KRAS、NRAS、TP53、PIK3CA、APC。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标癌种为乳腺癌，癌种特异核心探针组的监测位点包括下述基因：PIK3CA、AKT1、ESR1、ERBB2、TP53、PTEN、GATA3。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标癌种为除肺癌、肠癌、乳腺癌之外的其他泛实体瘤，癌种特异的核心探针组的监测位点包括下述基因：BRAF、KRAS、PIK3CA、CDKN2A、TP53。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的癌种特异核心探针组可用于对受试者的生物样本进行MRD的检测，优选地，所述的对受试者进行MRD检测还包括癌种特异核心探针组与其他探针组的任意组合。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法用于癌种特异核心探针组设计的系统，其特征在于，包括以下模块：
排序模块，用于对突变或基因进行排序；
癌种特异核心探针组监测位点确定模块，用于确定目标癌种的癌种特异核心探针组的监测位点。
11.根据权利要求10所述的系统，其用于执行权利要求1-9中任一项所述的方法。
12.一种存储介质，其记载了用于运行权利要求1-9中任一项所述的方法或权利要求10-11中任一项所述的系统。
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