CN102215841A - 免疫调节活性 - Google Patents

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CN102215841A CN2009801428131A CN200980142813A CN102215841A CN 102215841 A CN102215841 A CN 102215841A CN 2009801428131 A CN2009801428131 A CN 2009801428131A CN 200980142813 A CN200980142813 A CN 200980142813A CN 102215841 A CN102215841 A CN 102215841A
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Abstract

本发明涉及类异黄酮和色原烷醇的组合物以及它们用作免疫调变剂和用作T细胞或T淋巴细胞增殖的抑制剂。与T细胞的异常增殖或活性有关的疾病的治疗。化学式(I)，其中A是氢或可选取代的苯基，R1表示羟基、烷氧基、卤素或酯，以及R2-R8表示氢、羟基、烷基等。

Description

免疫调节活性
技术领域
本发明总体涉及用来调节免疫系统的方法和组合物。尤其是，本发明涉及使用类异黄酮(isoflavonoid)化合物来调节淋巴细胞的活性和/或增殖。
背景技术
脱氢雌马酚(phenoxodiol)(2H-1-苯并吡喃-7-0，3-(羟苯基)；异黄-3-烯-4′，7-二醇；PXD)是植物异黄酮染料木黄酮的合成类似物。利用各种癌细胞系进行的体外研究和在动物模型中的体内实验已经表明，PXD能够作为抗癌剂以及连同各种化疗剂(如卡铂(碳铂)、吉西他滨以及托泊特坎)一起作为化疗增敏剂(参见，例如，Alvero et al.，2007；Alvero et al.，2008)。基于这样的发现，PXD被给予由美国食品和药物管理局在2004年认可的快车道并进入人的临床试验。来自2006年的两个不同I期临床试验的结果，其中通过静脉内输注将PXD给予晚期实体癌患者，表明该药物被很好耐受，直到30mg/kg的剂量并具有轻微的副作用(Choueiri et al，2006；deSouza et al，2006)。在两个研究中，在治疗以后，一些患者经历他们的疾病长达6个月的稳定。随后PXD进入II期和III期临床试验，用于治疗激素相关癌症，包括卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌以及乳腺癌。
在免疫应答的发展中，T细胞活化和增殖是正常和基本过程。然而，异常或失调的T细胞活化和/或增殖已涉及许多病症，如炎症性疾病和自身免疫性疾病。仍然需要开发新的治疗方式(途径)来调节T细胞活化或增殖以及增殖T细胞的活性。
本发明是基于本发明人的令人惊讶的发现：强有力的化疗分子PXD能够调节特异性免疫功能，包括抑制快速增殖T细胞。这些发现打开了PXD和相关化合物的各种各样的迄今未知的和意想不到的治疗靶点，以及利用PXD和相关化合物的治疗机会。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了化学式I的化合物或其药用盐或前药作为免疫调节剂的应用，
Figure BDA0000057903030000021
其中
R1是羟基、烷氧基、卤素或OC(O)R9，
R2和R3独立地是氢、羟基、烷氧基、烷基、卤素或OC(O)R9，
A是氢或以下化学式的可选取代的苯基
R4、R5以及R6独立地是氢、羟基、烷氧基、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或OC(O)R9，
R7和R8独立地是氢、羟基、烷基、烷氧基或卤素，
R9是氢、烷基、芳基、芳烷基或氨基，以及
图样
Figure BDA0000057903030000023
表示单键或双键。
在一种实施方式中，化合物选自异黄-3-烯-4′，7-二醇、3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)色原烷-7-醇以及3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-8-甲基色原烷-7-醇。在一种具体实施方式中，化合物是异黄-3-烯-4′，7-二醇。
可以以免疫调节有效量，将化合物作为免疫调节剂给予需要其的哺乳动物。可以以药物组合物的形式给予化合物。
在一种具体实施方式中，化学式I的化合物的免疫调节活性包括抑制增殖T细胞的增殖和/或活性。通常，T细胞是异常或快速增殖T细胞。可替换地，T细胞可以是应答T细胞。化合物可以诱导或促进增殖T细胞、通常为快速或异常增殖T细胞的凋亡。活性的抑制可以包括在增殖T细胞中、通常在快速或异常增殖T细胞中抑制质膜电子传递。因此，可以以免疫调节有效量，将化合物作为免疫调节剂给予需要其的哺乳动物。哺乳动物可以患有、或易感与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症。
根据本发明的第二方面，提供了一种用于抑制增殖T细胞的活性和/或增殖的方法，该方法包括将增殖T细胞暴露于有效量的如本文描述的化学式I的至少一种化合物或其药用盐或前药。
可以在体内或体外将增殖T细胞暴露于上述至少一种化合物。
增殖T细胞可以存在于或来自受试者，该受试者患有或易感与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症。
根据本发明的第三方面，提供了一种用于在哺乳动物中调节免疫系统的方法，该方法包括给予哺乳动物免疫调节有效量的如本文描述的化学式I的至少一种化合物或其药用盐或前药。
在一种实施方式中，化合物可以抑制增殖T细胞、通常异常或快速增殖T细胞的活性和/或增殖。
根据本发明的第四方面，提供了一种用于治疗或预防与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症的方法，该方法包括给予需要其的哺乳动物免疫调节有效量的如本文描述的化学式I的化合物或其药用盐或前药。
根据本发明的第五方面，提供了如本文描述的化学式I的化合物或其药用盐或前药的应用在制备用于治疗或预防与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症的药物中的应用。
根据本发明的第六方面，提供了一种用于增强受试者的治疗方案(regime)的方法，其中上述受试者患有与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症，该方法包括给予受试者免疫调节有效量的如本文描述的化学式I的化合物或其药用盐或前药。
通常，根据上述方面和实施方式，受试者是人。在其它实施方式中，受试者可以是哺乳动物，其选自但不限于由灵长类、羊科动物、牛科动物、犬科动物、猫科动物、猪科动物、马科动物以及鼠科动物组成的组。
附图说明
现在将参照附图仅通过非限制性实施例来描述本发明。
图1.PXD抑制增殖T细胞的PMET、增殖以及生存力。(A).PMET测量为在增殖(闭合圈)和静止T细胞(开口圆)中在不同浓度的PXD存在的情况下的WST-1/PMS降低。(B)在增殖(闭合圈)和静止T细胞(开口圆)中在不同浓度的PXD存在的情况下通过MTT降低来测量增殖。(C)生存力测量为暴露于10μM PXD或对照(闭合圈)的增殖T细胞(闭合三角形)以及暴露于10μM PXD或对照(开口圆)的静止T细胞(开口三角形)的台盼蓝拒染(排阻)。对照是与在PXD处理中相同浓度的DMSO。在增殖T细胞中但并不在静止T细胞中观测到所有参数的抑制。结果表示为三个独立实验的平均值±SEM。
图2.PXD增加了增殖T细胞凋亡的程度。(A)至(D)：静止T细胞；(E)至(H)：增殖T细胞。A/E和C/G分别是用0.1％DMSO(对照)和10μMPXD处理24小时的T细胞的散点图。通过来自在相应散点图中的门控CD3+T细胞群体的AV+/PI+细胞百分比测量了凋亡的程度。B/F和D/H分别是对照和PXD处理的T细胞的AV/PI图。在增殖但不在静止T细胞中PXD增加了AV+/PI+细胞的百分比。结果表示三个独立实验。
图3.暴露于PXD会消除在HLA-错配MLR中的增殖应答T细胞。在0.1％DMSO(A和B)和10μM PXD(C和D)存在的情况下在第0天，将应答PBMC细胞暴露于HLA-错配γ-照射的刺激细胞，然后在第8天进行分析。A和C分别是经对照和PXD处理的应答PBMC的散点图。门表示CD3+T淋巴细胞群体。B和D是相应CD3+T淋巴细胞群体的增殖散点图，其示出了在经对照和PXD处理的MLR中有生存力的静止群体(CSFEhiAV-)以及在仅对照MLR中有生存力的增殖群体(CFSEloAV-)。结果代表三个独立实验。
图4.非刺激T细胞瞬态暴露于PXD并不影响它们应答HLA-错配MLR的能力。用0.1％DMSO(对照)或10μM PXD预温育应答细胞24小时，在新鲜培养基中洗涤两次，与HLA-错配γ-照射的刺激细胞(在第0天)混合并在第8天通过FACS进行分析。关于散点图的解释，参见图3。结果代表两个独立实验。
图5.静止应答T细胞瞬态暴露于PXD并不影响它们应答随后HLA-错配第三方MLR的能力。在HLA-错配MLR的第8天分选有生存力的静止应答T细胞(CD3+CSFEhiAV-)，然后再温育8天(A和B)或在第二随后第三方MLR中被再刺激，其中HLA-错配γ-照射的刺激细胞来自第三人(C和D)。仅再刺激的应答T细胞在随后MLR(CSFElo群体中显示强增殖(在D中但不在B中)。结果代表两个独立实验。
图6.不同细胞类型对PXD的敏感性。用10μM PXD温育不同细胞类型24小时，并且通过AV/PI染色来确定生存力，并报道为[在PXD暴露以后有生存力的原始细胞％]/[在0.1％DMSO暴露以后有生存力的原始细胞％]。百分比值如下：AML衍生的HL60：16±5以及HL60ρ0：54±6，ALL衍生的MOLT-4：44±4，MM衍生的U226：59±6以及RPMI 8226：12±4，原代AML原始细胞：64±5，原代ALL原始细胞：23±4，正常BM：89±5，增殖T细胞：69±4，静止T细胞：98±6。来自细胞系的结果表示为至少3个独立实验的平均值±SEM，来自骨髓样品的结果表示为单个实验(重复两次)的平均值±SD。
具体实施方式
在整个说明书以及所附的权利要求中，除非上下文中另有要求，否则措辞“包括”、以及变型诸如“包含”或“含有”将理解成是指包括所陈述的整数或步骤或整数或步骤的组，但并不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。
冠词“一个”和“一种”在本文中用来指一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。例如，“一个要素”是指一个要素或多于一个的要素。
如在本文中所使用的，术语“治疗”、“处理”以及“预防”是指任何及所有应用，其以任何方式改进病症或症状，预防病症或疾病的确立，或以其它方式预防、阻止、迟延、或逆转病症或疾病或其它不期望的症状的进展。因此，要在它们的最广泛范围内考虑术语“治疗”和“预防”等。例如，治疗并不一定意味着治疗患者直到完全恢复。相反，“治疗”包括降低特定疾病的严重性、或延迟特定疾病的发作。在一些疾病的情况下，本发明的方法涉及“治疗”疾病，这是指减少或改善与疾病有关的极不期望的事件的发生或疾病进展的不可逆转的结果，但本身并不可以预防事件或结果的初次发生。因此，治疗包括改善特定疾病的症状或预防或降低发展特定疾病的风险。
如在本文中所使用的，术语“有效量”是指化合物或包含这样的化合物的药物组合物的量或剂量，其含意包括无毒但足够量或剂量的化合物或药物组合物以便提供期望的效果。需要的确切量或剂量将随受试者不同而不同，这取决于多种因素：如待治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、待治疗病症的严重性、待给予的特定制剂以及给药模式等。因此，不可能规定确切“有效量”或“有效剂量”。然而，对于任何给定情况，本领域技术人员仅利用例行试验就可以确定适当的“有效量”或“有效剂量”。
如在本文中相对于化合物的“免疫调节有效量”所使用的，术语“免疫调节”是指化合物的量或剂量，其足以调节免疫系统或免疫应答(根据需要)。免疫调节量可以相同于或不同于化合物的“治疗量”，其中治疗量是这样的量，相对于特定疾病或病症，其足以具有非免疫调节治疗作用。例如，免疫调节量可以是亚治疗量，即，与为实现非免疫调节治疗作用所需要给予的量或剂量相比，为实现免疫调节作用所给予的化合物的较小量或剂量。
如在本文中所使用的，术语“抑制”是指迟延、预防、降低或减小。因此，在本发明的上下文中，本文描述的化合物“抑制”细胞增殖的能力是指，化合物可以减少增殖，抑制或预防持续细胞增殖，或迟延或预防增殖的引发。本领域技术人员将明了，细胞增殖的抑制，在其最广泛的意义上，还包括诱导或促进细胞死亡，通常为凋亡。增殖或活性的抑制包括全部或部分抑制；抑制的程度足以减少或消除与增殖T细胞的活性或增殖有关的不良影响。在抑制细胞的活性或增殖时，这样的抑制可以是直接或间接的。
术语“药用盐”是指有机或无机部分，其携带电荷并且其可以连同药剂一起给予，例如，作为在盐中的抗衡阳离子或抗衡阴离子。药用阳离子对于本领域技术人员来说是已知的，并且包括但不限于钠、钾、锌以及季胺。药用阴离子对于本领域技术人员来说是已知的，并且包括但不限于氯化物、乙酸盐、柠檬酸盐、碳酸氢盐以及碳酸盐。
术语“药用衍生物”或“前药”是指活性化合物的衍生物，其在给予受者以后能够直接或间接地提供母体化合物或代谢物，或其本身呈现活性。前药包括在本发明的范围内。
本申请首次描述了化学式I的类异黄酮化合物(通过PXD举例说明)的免疫调节和免疫增强能力。这样的化合物显示具有抑制淋巴细胞的子集(通常为T细胞)的异常增殖和/或活性的能力。本申请描述了本文披露的化合物的以前意想不到的活性，因而提供了用于调节免疫应答的新的机会以及用于治疗和增强治疗各种免疫相关和免疫介导疾病的新的机会。
因此，在一个方面，本发明提供了如本文描述的化学式I的化合物或其药用盐或前药作为免疫调节剂的用途。
如本文举例说明的，PXD显示出可以在增殖T细胞中抑制质膜电子传递、细胞增殖以及细胞存活，并诱导凋亡，同时对静止T细胞没有相应的影响。PXD还显示可以防止应答T细胞应答外界刺激的能力。在混合淋巴细胞反应中，在PXD存在的情况下，可以消除增殖同种异体T细胞。相反，在上述反应中，暴露于PXD的非增殖T细胞会存活下来并保留它们的应答外界刺激的能力。虽然不希望受限于任何特定的作用机制，但本文提出，PXD是优先作用于异常分裂细胞的信号转导调节剂。
因此，本发明的特定方面和实施方式提供了用于抑制T细胞的活性和/或增殖、以及治疗或预防与异常T细胞增殖或刺激有关的疾病和病症的方法。
如在本文中所使用的，如相对于与异常T细胞增殖有关的疾病和病症所使用的，术语“与...有关的”是指，疾病或病症可以由异常T细胞增殖所引起，可以引起异常T细胞增殖，或可以与异常T细胞增殖有关。通常，在本发明的上下文中，异常T细胞增殖是指异常快速增殖。这样的疾病和病症包括，通过非限制性举例，T细胞白血病、自身免疫性疾病、慢性病毒感染如HBV、以及移植或移植排斥如移植物抗宿主疾病。自身免疫性疾病包括但不限于肝硬化、银屑病、狼疮、类风湿性关节炎、结肠炎、糖尿病、艾迪生氏病、传染性单核细胞增多症、塞泽里综合症以及爱-巴病毒感染。本领域技术人员将明了，各种疾病和病症与异常T细胞增殖有关，并且本发明可应用于治疗任何这样的疾病或病症。
本文还提供了用于增强用于患有与异常T细胞增殖或刺激有关的疾病或病症的受试者的现有治疗方案的方法，该方法包括给予需要其的受试者免疫调节有效量的如本文描述的化学式I的化合物或其药用盐或前药。因此，可以预期，如本文描述的化合物可以连同现有治疗性治疗一起用于各种疾病和病症，其中增殖T细胞活性和/或增殖的降低将是有利的。即，给予免疫调节有效量的本文描述的化合物可以改善患者应答现有治疗(用于患者患有的疾病或病症)的能力。
根据本发明的实施方式可以应用的化合物具有以下通式(I)：
Figure BDA0000057903030000081
其中
R1是羟基、烷氧基、卤素或OC(O)R9，
R2和R3独立地是氢、羟基、烷氧基、烷基、卤素或OC(O)R9，
A是氢或以下化学式的可选取代的苯基
Figure BDA0000057903030000082
R4、R5以及R6独立地是氢、羟基、烷氧基、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或OC(O)R9，
R7和R8独立地是氢、羟基、烷基、烷氧基或卤素，
R9是氢、烷基、芳基、芳烷基或氨基，以及
图样
Figure BDA0000057903030000083
表示单键或双键，
或其药用盐或前药。
在一种实施方式中，烷基是C1-6-烷基、C1-4-烷基、甲基、乙基、丙基、异丙基或叔丁基。在一种具体实施方式中，烷基是甲基。
在一种实施方式中，烷氧基是C1-6-烷氧基、C1-4-烷氧基、甲氧基或乙氧基。在一种具体实施方式中，烷氧基是甲氧基。
在一种实施方式中，卤素是氟、氯、溴或碘。在一种具体实施方式中，卤素是氯或溴。
在一种实施方式中，芳基是苯基、联苯基或萘基，其可选地被一个或多个C1-C4-烷基、羟基、C1-C4-烷氧基、羰基、C1-C4-烷氧基羰基、C1-C4-烷基羰氧基、硝基或卤素取代。在一种具体实施方式中，芳基是可选地被甲基、羟基或甲氧基取代的苯基。
在一种实施方式中，芳烷基是可选地被一个或多个C1-C4-烷基、羟基、C1-C4-烷氧基、硝基或卤素取代的苄基。在一种具体实施方式中，芳烷基被甲基、羟基或甲氧基取代。
根据本发明的实施方式，在化学式(I)的化合物中，R2和R3的取代模式可以选自：
根据具体实施方式，在化学式(I)的化合物中：
R1是羟基、C1-4-烷氧基或OC(O)R9，
R2和R3之一是氢、羟基、C1-4-烷氧基、卤素或OC(O)R9，而R2和R3中的另一个是羟基、C1-4-烷氧基、卤素或OC(O)R9，
R7是氢，
R8是氢、羟基、C1-4-烷基或卤素，以及
R9是C1-4-烷基、苯基或苄基，
或其药用盐或前药。
根据具体实施方式，在化学式(I)的化合物中：
R1是羟基、甲氧基或乙酰氧基，
R2和R3之一是氢、羟基、甲氧基、溴、氯或乙酰氧基，而R2和R3中的另一个是羟基、甲氧基、溴、氯或乙酰氧基，以及
R8是氢、羟基、甲基、甲氧基、溴或氯，
或其药用盐或前药。
并且，根据具体实施方式，在化学式(I)的化合物中：
R1是羟基，
R2和R3之一是氢、羟基或甲氧基，而R2和R3中的另一个是羟基或甲氧基，以及
R8是氢或甲基，
或其药用盐或前药。
在本发明的一种具体实施方式中，绘图“
Figure BDA0000057903030000101
”表示双键，和/或A是氢。因此，根据一种具体实施方式，可用于本发明的化合物可以具有以下通式(I-a)：
Figure BDA0000057903030000102
其中R1、R2、R3、R7以及R8如上文所定义。
化学式(I-a)的化合物可以选自：
异黄-3-烯-4′，7-二醇(化合物1)；
4′-甲氧基异黄-3-烯-7，8-二醇(化合物2)；
8-甲基异黄-3-烯-4′，7-二醇(化合物3)；
异黄-3-烯-7-醇(化合物4)；
异黄-3-烯-3′，7-二醇(化合物5)；
异黄-3-烯-4′，7，8-三醇(化合物6)；
8-甲基异黄-3-烯-3′，7-二醇(化合物7)；
3′-甲氧基-8-甲基异黄-3-烯-4′，7-二醇(化合物8)；
3′-甲氧基异黄-3-烯-4′，7-二醇(化合物9)；
3′-甲氧基异黄-3-烯-7-醇(化合物10)；
8-甲基异黄-3-烯-7-醇(化合物11)；
3′，4′-二甲氧基异黄-3-烯-7-醇(化合物12)；
3′，4′-二甲氧基-8-甲基异黄-3-烯-7-醇(化合物13)；
8-溴代异黄-3-烯-4′，7-二醇(化合物14)；
异黄-3-烯-4′，5，7-三醇(化合物15)；
4′-溴代异黄-3-烯-7-醇(化合物16)；
虽然不限于此，但如本文说明的，化合物(1)还称作脱氢雌马酚或苯妥帝尔，是一种特别适用于本发明的化合物。
在本发明的另一种实施方式中，图样“
Figure BDA0000057903030000111
”表示单键。A是可选取代的苯基。因此，根据一种具体实施方式，可用于本发明的化合物可以具有以下通式(I-b)：
Figure BDA0000057903030000112
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7以及R8如上文所定义。
在化学式(I-b)的化合物中，R4、R5以及R6的取代模式可以选自：
Figure BDA0000057903030000121
根据具体实施方式，在化学式(I-b)的化合物中：
R4、R5以及R6独立地是氢、羟基、C1-4-烷氧基、C1-4-烷基、氨基、OC(O)R9，以及
R9是C1-4-烷基、苯基或苄基，
或其药用盐或前药。
根据具体实施方式，在化学式(I-b)的化合物中：
R4是氢、羟基、甲氧基、氨基或乙酰氧基，以及
R5和R6独立地是氢、羟基、甲氧基、氨基或乙酰氧基，
其中R4、R5以及R6中的至少一个不是氢，
或其药用盐或前药。
根据具体实施方式，在化学式(I-b)的化合物中：
R4和R5之一是氢、羟基、甲氧基或氨基，而R4和R5中的另一个是羟基、甲氧基或氨基，以及
R6是氢，
或其药用盐或前药。
根据具体实施方式，在化学式(I-b)的化合物中：
R4是甲氧基，以及
R5是氢，
或其药用盐或前药。
化学式(I-b)的化合物，其中R8是氢，包括：
3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)色原烷-7-醇(化合物17)；
3-(4-羟苯基)-4-苯基色原烷-7-醇(化合物18)；
3-(4-羟苯基)-4-(3-甲氧基苯基)色原烷-7-醇(化合物19)；
3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)色原烷-7-醇(化合物20)；
3-(4-羟苯基)-4-(4-甲苯基)色原烷-7-醇(化合物21)；
3-(4-甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-7-甲氧基色原烷(化合物22)；
3-(4-羟苯基)-4-(2，6-二甲氧基-4-羟苯基)色原烷-7-醇(化合物23)；
3-(4-羟苯基)-4-(2-羟苯基)色原烷-7-醇(化合物24)；
3-(4-羟苯基)-4-(3-酰基-2-羟基-4-甲氧基苯基)色原烷-7-醇(化合物25)；
3-(3-羟苯基)-4-(3-甲氧基苯基)色原烷-7-醇(化合物26)；
3-(4-羟苯基)-4-(4-羟苯基)色原烷-7-醇(化合物27)；
3-(4-溴苯基)-4-(4-甲氧基苯基)色原烷-7-醇(化合物28)；
3-(4-羟苯基)-4-(3-甲氧基苯基)色原烷-7-醇(化合物29)；
3-(4-羟苯基)-4-(3-氨基苯基)色原烷-7-醇(化合物30)；以及
3-(4-羟苯基)-4-(4-苯氧基苯基)色原烷-7-醇(化合物31)；
或它们的药用盐。
化学式(I-b)的化合物，其中R8是甲基，包括：
3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-8-甲基色原烷-7-醇(化合物32)；
3-(4-甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-甲基色原烷(化合物33)；
3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-8-甲基色原烷-7-醇(化合物34)；
3-(4-甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-8-甲基色原烷-7-醇(化合物35)；
3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-甲基色原烷(化合物36)；
3-(3-甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-8-甲基色原烷-7-醇(化合物37)；
3-(3，4-二羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-7-甲氧基-8-甲基色原烷(化合物38)；
3-(3-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-8-甲基色原烷-7-醇(化合物39)；以及
3-(3，4-二羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-8-甲基色原烷-7-醇(化合物40)；
或它们的药用盐。
用于根据本发明的应用的化学式(I-b)的化合物具有两个手性中心。预期所有对映体和非对映异构体，包括分离的或成对的对映体或非对映异构体，以及它们的以任何比例的混合物，用于根据本发明的应用。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，在化学式(I-b)的化合物中，在杂环上的芳基取代基可以相对彼此是顺式或反式。
在一种具体实施方式中，预期化合物17的顺式异构体或其药用盐：
在一种具体实施方式中，预期化合物32的顺式异构体或其药用盐：
Figure BDA0000057903030000151
类似地，在具体实施方式中，还预期顺式构象的化合物18至31和33至40。
术语“烷基”认为包括1至6个碳原子的直链和支链饱和烷基基团，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基等。烷基基团更优选包含1至4个碳原子，尤其是甲基、乙基、丙基或异丙基。烷基基团或环烷基基团可以可选地被以下一种或多种取代：氟、氯、溴、碘、羧基、C1-C4-烷氧基羰基、C1-C4-烷基氨基羰基、二(C1-C4-烷基)-氨基-羰基、羟基、C1-C4-烷氧基、甲酰氧基、C1-C4-烷基-羰氧基、C1-C4-烷硫基、C3-C6-环烷基或苯基。通常，烷基基团并不携带任何取代基。
术语“芳基”包括苯基、苄基、联苯基以及萘基并且可以可选被以下一种或多种取代：C1-C4-烷基、羟基、C1-C4-烷氧基、羰基、C1-C4-烷氧基羰基、C1-C4-烷基羰氧基、硝基或卤素。
术语“卤素”包括氟、氯、溴以及碘，优选氟和氯，更优选氟。提及例如“卤烷基”将包括单卤代、二卤代以及可达全卤代的烷基基团。典型的卤代烷基基团是，例如，三氟甲基和五氟乙基。
根据本发明，可以采用本文披露的化合物的药用盐和衍生物。药用盐是本领域技术人员众所周知的并且包括那些形成自以下酸的药用盐：乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、苯磺酸、柠檬酸、肉桂酸、乙磺酸、富马酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖酸、盐酸、氢溴酸、乳酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、萘甲酸、羟萘甲酸、萘磺酸、萘二磺酸、萘丙烯酸、油酸、草酸、草酰乙酸、磷酸、丙酮酸、对甲苯磺酸、酒石酸、三氟乙酸、三苯基乙酸、丙三羧酸、水扬酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸以及琥珀酸。
药用衍生物是本领域技术人员众所周知的并且包括溶剂化物、药用活性酯、前药等。它还包括具有生理可裂解离去基团的衍生物，其可以体内被裂解以提供本发明的化合物或它们的活性部分。离去基团可以包括酰基、磷酸盐、硫酸盐、磺酸盐，并且优选是单、双以及全酰氧基取代的化合物，其中一个或多个侧羟基基团受酰基基团，优选乙酰基基团的保护。通常，本发明的酰氧基取代的化合物可容易地裂解成相应的羟基取代的化合物。
如本文描述的化学式I的化合物被认为具有有利的活性分布和良好的生物利用度。这些化合物描述在国际专利申请PCT/AU2005/001435(公开为WO 2006/032085)、PCT/AU2005/001436(公开为WO 2006/032086)以及PCT/AU00/00103(公开为WO 00/49009)中，将其披露内容以引用方式结合于本文。
根据本发明的方法，可以通过任何适宜的途径(系统地或局部地)来给予本文披露的类异黄酮化合物和包含上述化合物的组合物。在任何给定情况下所使用的特定的给予途径将取决于许多因素，包括待治疗病症的特性、病症的严重性和程度、待递送的特定化合物的所需剂量以及化合物的潜在的副作用。例如，在需要将适当浓度的所期望的化合物直接递送到体内的待治疗部位的情况下，给予可以是局部的而不是系统的。局部给予可以提供将非常高的局部浓度的所期望的化合物递送到所需部位的能力，因此适合于达到所期望的治疗或预防效果，同时避免身体的其它器官暴露于化合物，从而潜在地减少副作用。
通过举例，可以通过任何标准途径来实施根据本发明的实施方式的给药，包括腔内、膀胱内、肌肉、动脉内、静脉内、眼内、皮下、局部或口服。
在采用本发明的方法时，可以将类异黄酮化合物配制在药物组合物中。可以按照本领域技术人员已知的方法来制备适宜的组合物并且可以包括药用稀释剂、佐剂和/或赋形剂。就相容于组合物的其它组分而论，稀释剂、佐剂以及赋形剂必须是“可接受的”，并且对其受者无害。稀释剂、佐剂或赋形剂可以是固体或液体、或两者，并且可以与化合物配制成单位剂量，例如，片剂，其可以包含按重量计0.5％至59％的活性化合物，或按重量计可达100％的活性化合物。可以将一种或多种活性化合物加入本发明的剂型中，其可以通过药剂学的任何众所周知的技术加以制备，基本上包括混合组分，可选地包括一种或多种助剂。
药用稀释剂的实例是去离子水或蒸馏水；盐水溶液；基于植物的油如花生油、红花油、橄榄油、棉子油、玉米油，麻油如花生油、红花油、橄榄油、棉子油、玉米油、麻油，花生油或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷以及甲基苯基polysolpoxane；挥发性硅酮；矿物油如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级烷撑二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；黄芪树胶或阿拉伯树胶；以及石油膏。通常，一种载体或多种载体将形成按重量计1％至99.9％的组合物。
适用于口服的剂型可以提供为离散单元，如胶囊剂、香囊、锭剂、或片剂，各自包含预定量的活性化合物；提供为散剂或颗粒剂；提供为在含水或非水液体中的溶液或悬浮液；或提供为水包油或油包水乳剂。可以通过药剂学的任何适宜方法来制备上述剂型，其包括以下步骤：结合活性化合物和适宜载体(其可以包含一种或多种如上所述的助剂)。通常，本发明的剂型通过以下来制备：均匀和密切混合活性化合物与液体或细分的固体载体、或两者，然后，如果有必要，成形获得的混合物，以形成单位剂型。例如，可以通过压制或成型包含活性化合物的散剂或颗粒剂，以及可选的一种或多种助剂来制备片剂。可以通过在适宜的机器中压制自由流动的化合物，如可选地混合于粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、和/或表面活性/分散剂的散剂或颗粒剂，来制备压制片剂。可以通过在适宜的机器中成型用惰性液体粘合剂湿润的粉末状化合物来制备成型片剂。
用于口服的固体形式可以包含在人和兽医药学实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、增香剂、包衣药剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂。适宜的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄芪树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。
适宜的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿司帕坦或糖精。适宜的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、海藻酸或琼脂。适宜的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。适宜的增香剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或覆盆子增香剂。适宜的包衣药剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米醇蛋白、虫胶或谷蛋白。适宜的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、羟苯甲酸、羟苯丙酸或亚硫酸氢钠。适宜的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。适宜的时间延迟剂包括甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
用于口服给药的液体形式可以包含除上述药剂以外的液态载体。适宜的液态载体包括水，油如橄榄油、花生油、麻油、葵花油、红花油、花生油、椰子油，液体石蜡，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，异丙醇，甘油，脂肪醇，甘油三酯或它们的混合物。
适合于口腔(舌下)给药的剂型包括：锭剂，其包含在香味基质，通常蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中的活性化合物；以及软锭剂，其包含在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的化合物。
适合于胃肠道外给药的本发明的组合物通常方便地包括活性化合物的无菌含水制剂，该制剂与期望的受者的血液可以是等渗的。通常静脉内给予这些制剂，虽然也可以通过皮下、肌肉、或皮内注射来实现给药。可以方便地通过混合化合物与水或甘氨酸缓冲液并使得获得的溶液无菌以及与血液等渗，来制备上述制剂。根据本发明的注射剂型通常包含0.1％至60％w/v的活性化合物，并以0.1ml/分钟/kg或适当的速率给予。
用于输注的剂型，例如，可以采用盐水作为载体和增溶剂如环糊精或其衍生物来制备。适宜的环糊精包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-β-环糊精、2-羟乙基-β-环糊精、2-羟丙基-环糊精、3-羟丙基-β-环糊精以及三甲基-β-环糊精。更优选地，环糊精是羟丙基-β-环糊精。环糊精的适宜的衍生物包括
Figure BDA0000057903030000181
环糊精的磺丁基醚衍生物以及其类似物，如在US 5,134,127中所描述的。
适用于直肠给予的剂型通常提供为单位剂型栓剂。它们可以通过混合活性化合物和一种或多种常规固体载体，例如，可可脂，然后成形获得的混合物来制备。
适合于局部给予皮肤的剂型或组合物可以采取以下形式：软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂、或油。可以使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、以及它们的两种或多种的混合物。活性化合物通常以0.1％至0.5％w/w，例如，0.5％至2％w/w的浓度存在。上述组合物的实例包括美容护肤霜。
可以作为喷雾组合物以溶液、悬浮液或乳状液的形式来递送适合于吸入的剂型。该吸入喷雾组合物可以进一步包含药用推进剂如二氧化碳或氧一氧化二氮或含氢的碳氟化合物如1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-七氟正丙烷或它们的混合物。
适合于透皮给予的剂型可以提供为离散贴剂，其适合于长期保持与受者表皮的亲密接触。这样的贴剂适当地包含活性化合物，作为例如，0.1M至0.2M浓度(相对于所述活性化合物)的可选缓冲的水溶液。还可以通过离子渗透法来递送适合于透皮给予的剂型(参见，例如，PharmaceuticalResearch 3(6)，318(1986))并通常具有采用活性化合物的可选缓冲的水溶液的形式。例如，适宜的剂型可以包含柠檬酸盐或bis/tris缓冲液(pH 6)或乙醇/水并且包含0.1M至0.2M活性组分。
可以以食品的形式来提供活性化合物，如将活性化合物加入、混合到、涂布于、结合于或用其它方式加入到食品中。术语食品是在尽可能广泛的意义上使用并且包括液体配方(剂型)如饮料，包括乳制品和其它食品，如健康条、甜食等。可以按照标准规程来容易地制备包含本发明的化合物的食品配方。
根据本发明，可以治疗性地或预防性地给予化合物和组合物。在治疗应用中，以足以治愈或至少部分地阻止疾病或障碍、症状和/或任何相关并发症的量，将化合物和组合物给予已患有疾病或障碍或经历症状的患者。化合物或组合物应提供一定量的足以有效治疗患者的活性化合物。
对于任何特定受试者，所给予化合物的有效剂量将取决于各种因素，包括：待治疗病症的类型和病症的阶段；所采用化合物的活性；所采用的组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别以及饮食；给予的时间；给予的途径；化合物的螯合作用的速率；治疗的持续时间；连同或与治疗同时使用的药物；以及在医学领域中众所周知的其它因素。
通过例行试验，本领域技术人员应能够确定有效的无毒剂量，其将是治疗适用病症所需要的。这些通常都是基于个案来确定的。仅通过举例，可以预期有效剂量在约0.0001mg至约1000mg/kg体重/24小时的范围内；通常，约0.001mg至约750mg/kg体重/24小时；约0.01mg至约500mg/kg体重/24小时；约0.1mg至约500mg/kg体重/24小时；约0.1mg至约250mg/kg体重/24小时；约1.0mg至约250mg/kg体重/24小时；或约10mg至约200mg/kg体重/24小时。
另外，对于本领域普通技术人员来说，显而易见的是，个体剂量的最佳量和间隔将主要取决于待治疗病症的特性和程度，给予的形式、途径以及部位，以及待治疗的个体。可以通过常规技术来确定适宜的病症。
对于本领域技术人员来说，同样显而易见的是，最佳疗程，如，对于规定数目的天数，每天给予的组合物的剂量数目，可以由本领域技术人员利用治疗确定试验的常规过程来确定。
按照本发明的方法，可以与并不削弱所期望的作用的其它活性剂、或补充所期望的作用的药剂一起，共同给予类异黄酮化合物或其药用衍生物、前药或盐。所使用的特定药剂将取决于许多因素并将通常要针对待治疗的疾病或障碍。药剂的共同给予可以是同时的或按次序的。可以通过将化合物配制在单一组合物中、或配制在同时或类似时间给予的分开的组合物中，来实施同时给予。根据需要，按次序给予可以是任何次序。
在本说明书中提及任何现有出版物(或来自它的信息)、或提及任何已知的问题，并不是、或不应看作是承认或以任何形式提示：现有出版物(或来自它的信息)或已知问题形成在本说明书所涉及的领域中的常见一般知识的一部分。
现在将参照以下具体实施例来描述本发明，其不应以任何方式看作是限制本发明的范围。
实施例
一般方法
材料
由Red Cross Blood Bank(Melbourne，澳大利亚)提供来自健康志愿者的浓缩血袋(50mL)。在获得来自Peter MacCallum Tissue ResearchManagement Committee(项目编号07/14)的伦理认可以后，骨髓样品获自在Peter MacCallum Cancer Institute的组织库。
2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐(WST-1)和1-甲氧基吩嗪硫酸甲酯(1mPMS)购买自DojindoLaboratories(Kumamoto，日本)。PXD获自Novogen Inc(NSW，澳大利亚)。人抗CD3mAb、人抗CD28mAb、碘化丙啶(PI)、APC标记小鼠抗人抗CD3mAb以及FITC标记膜联蛋白V(AV)来自Pharmingen(BectonDickinson，North Ryde，澳大利亚)。人重组IL-2获自Biological ResourcesBranch Preclinical Repository，NCI(Frederick，MD)。除非另有说明，否则所有其它试剂来自Sigma(St.Louis，Missouri.，U.S.A.)。以固体形式在氮气下存储PXD以防止氧化，并且在被稀释在Hanks平衡盐溶液(HBSS)或RPMI-1640培养基(GIBCO-BRL，Grand Island，NY)(补充有10％(v/v)胎牛血清(FCS))以前，在每次实验以前被溶解在10000x或1000x最终浓度的DMSO中。对照包括DMSO，其浓度与在PXD处理中所使用的那些浓度相同。
在37℃下、在5％CO2的加湿温育器中，在RPMI-1640培养基(GIBCO-BRL，Grand Island，NY)中生长细胞系，上述培养基补充有5％(v/v)胎牛血清、2mM谷氨酸盐、25μg/mL青霉素、25μg/mL链霉素、50μg/mL尿苷以及1mM丙酮酸盐，密度为1-2x106个细胞/mL(指数期)。
来自白细胞层的PBMC的收集、分离以及贮存
利用Ficoll梯度，从来自健康志愿者的血袋的白细胞层分离PBMC。将PBMC再悬浮在补充有10％(v/v)FCS的RPMI-1640培养基(GIBCO-BRL，Grand Island，NY)中，然后通过台盼蓝拒染来计数活细胞。以20-30x106个细胞/小瓶，将PBMC存储于在液氮中的1.5mL 90％FCS+10％DMSO中。在用于这些实验的PBMC样品中的不同细胞类型的频率是如下通过FACS分析来确定的：70-80％CD3+(T淋巴细胞)、5-15％CD19+(B淋巴细胞)、10-20％CD14+(单核细胞)、5-10％CD56+(NK细胞)、＜5％CD15+(中性粒细胞)。CD3+细胞群体由30-40％CD8+和60-70％CD4+T细胞构成。
PBMC(T细胞)的体外活化
紧接着在实验以前，解冻冷冻的PBMC，在Multifuge 3s(Heraeus)中以1400rpm离心4分钟，用RPMI+10％FCS洗涤并再悬浮在T细胞培养基(RPMI+10％FCS+10μM 2-巯基乙醇(Sigma)、1x谷氨酰胺、1x非必需氨基酸(Gibco))中，浓度为2x106个细胞/mL。通过添加10μg/mL抗CD3和5μg/mL抗CD28以及20U/mL IL-2/孔来活化细胞(2x105)。在37℃下、在5％CO2的加湿温育器中温育细胞4至5天，直到观测到大量的淋巴细胞的较大的球形凝集体或“突发”。从孔汇集活化的增殖T细胞，用于进一步实验。在仅20U/mL IL-2存在的情况下，温育静止T细胞相同的时间。
混合淋巴细胞反应(MLR)
利用不相关的HLA-错配健康供者血液样品作为供体/受体来建立混合淋巴细胞反应。用30Gy对刺激PBMC进行γ照射，如先前描述的(Zenhausen et al.，2007)。用PBS洗涤应答PBMC两次，在室温下5，6-羧基-琥珀酰亚胺基-荧光素酯(CSFE)标记(1.25μM，Sigma)5分钟，然后用PBS/10％FCS洗涤两次。在96U孔板中，在T细胞培养基中，以1∶1比率每孔添加二十万刺激和应答细胞。还单独平板接种刺激和应答细胞，并在5％CO2、37℃加湿温育器中培养所有细胞。通过流式细胞术来确定生存力、CFSE荧光以及细胞表面抗原表达。用FACS缓冲液(PBS，2％FCS)洗涤细胞两次，并再悬浮在50μL/5x105个细胞中，然后用Becton DickinsonLSRII FACS分析仪利用FlowJo(TreeStar)软件进行分析。
从AML和ALL患者的骨髓样品分离白血病原始细胞
来自AML(n＝22)和ALL(n＝8)患者的骨髓样品，其包含多于80％的原始细胞，选自组织库。解冻骨髓样品，用Multifuge 3s(Heraeus)以1400rpm离心4分钟，用RPMI洗涤两次，然后再悬浮在RPMI+10％FCS中。在0.1％DMSO(对照)或10μM PXD存在的情况下温育等分部分24小时，然后检查形态和生存力。通过AV/PI染色，凋亡百分比确定为[在PXD处理以后有生存力的原始细胞％]/[在对照样品中有生存力的原始细胞％]。
通过WST-1/PMS还原测得的PMET活性
如先前描述的(Berridge and Tan，1998)，用微量板格式来测量WST-1/PMS还原率。简单地说，用Multifuge 3s(Heraeus)以1400rpm离心指数生长细胞4分钟，洗涤并再悬浮在HBSS缓冲液中。对于每个测定，将50μL的2x106个细胞/mL细胞悬液吸移到包含50μL抑制剂/缓冲溶液的平底微量板孔中，从而导致1x106个细胞/mL的最终浓度。通过添加10μL在milliQ超纯水中的WST-1/PMS的10x储备溶液(最终浓度为500μMWST-1和20μM PMS)来引发染料还原。用BMG FLUOstar OPTIMA板读数仪，在450nm处，实时测量WST-1还原30-60分钟。
通过MTT还原测得的细胞增殖
如先前描述的(Berridge et al.，1996)，用微量板格式如下来测量MTT还原：用Multifuge 3s(Heraeus)以1400rpm离心指数生长细胞4分钟，洗涤并再悬浮在HBSS缓冲液中。对于每个测定，将50μL的2x106个细胞/mL细胞悬液吸移到包含50μL抑制剂/缓冲溶液的平底微量板孔中，从而导致1x106个细胞/mL的最终浓度。在温育48小时以后，通过向每个孔中添加10μL的5mg/mL MTT来引发染料还原。在2小时以后，添加100μL的裂解缓冲液并在用BMG FLUOstar OPTIMA板读数仪测量A570以前，利用多通道吸移管通过人工吸移溶解甲
Figure BDA0000057903030000231
晶体。
通过台盼蓝拒染测得的细胞生存力
用Multifuge 3s(Heraeus)在室温下以1400rpm离心增殖和静止PBMC四分钟，在PXD或0.1％DMSO存在的情况下再悬浮在96U孔平板中的新鲜T细胞培养基中(200μL/孔，密度为2x106个细胞/mL)，然后在5％CO2、37℃加湿温育器中温育。活细胞，如通过台盼蓝拒染所确定的，用Neubauer血细胞计数器每24小时计数若干天。
膜联蛋白V/碘化丙啶染色
用Multifuge 3s(Heraeus)在室温下以1400rpm离心细胞4分钟，用磷酸盐缓冲盐水溶液，pH 7.3(PBS)，洗涤，然后再悬浮在膜联蛋白V结合缓冲液中。将小等分部分(0.5-1x106个细胞)转移到1.5mL管中，然后用Multifuge 3s(Heraeus)以1400rpm旋转4分钟。除去大部分上清液，并将5μL PI和5LμFITC标记的AV加入到被涡旋的湿沉淀物中。在黑暗中在冰上30分钟以后，添加500μl的AV结合缓冲液，在1400rpm下离心细胞2分钟，用AV结合缓冲液洗涤一次，然后再悬浮在FACS管中的300μL的AV结合缓冲液中。通过流式细胞术，使用Becton Dickinson Canto IIFACS分析仪利用FlowJo(TreeStar)软件来分析染色。
实施例1-PXD对快速增殖T细胞的生存力的影响
PXD抑制PMET、快速增殖T细胞的细胞增殖和生存力
通过在它的专性中间电子受体1mPMS存在的情况下测量细胞不可渗透的四唑染料WST-1的还原(WST-1/PMS还原)，研究了PXD对PMET的影响(图1A)。暴露于PXD会抑制增殖T细胞的PMET(IC50为46μM)，但对于静止T细胞仅具有轻微的抑制作用(＞200μM)。通过测量四唑盐MTT的细胞内还原来确定PXD对增殖的影响(图1B)。在PXD存在的情况下，在增殖T细胞中，MTT还原受到抑制(IC50＝5.4μM)，但在静止T细胞中不会受到抑制(IC50＞200μM)。在所使用的实验条件下，增殖T细胞具有21小时的循环时间，而静止T细胞并不增殖而是保持有生存力的，而不管10μM PXD的存在(图1C)。然而，通过用10μM PXD温育会严重损害增殖T细胞的生存力。
PXD引起增殖T细胞的凋亡
在暴露于10μM PXD 24小时以后，通过AV/PI染色，确定了在静止和增殖T细胞中凋亡的程度(图2)。散点图表明，在用PXD处理以后(图2H)，未处理的较大增殖T细胞原始细胞(图2E)经历凋亡。静止T细胞不受影响(图2D)。在暴露于10μM PXD 24小时以后(图2H)，有生存力的增殖T细胞的百分比从74％(图2F)降低至51％，而有生存力的静止T细胞的百分比没有改变(图2B和D)。
短暂暴露于PXD足以杀伤增殖T细胞
为了研究细胞是否需要持续暴露于PXD以使它的效果变得明显，将增殖T细胞暴露于10μM PXD不同时间，用RPMI洗涤细胞两次并在新鲜T细胞培养基中再温育24小时。短暂暴露于10μM PXD一分钟会诱导增殖T细胞的凋亡，其程度相同于在暴露于PXD 24小时后所观测到的程度。在90％FCS或90％人血清中PXD的预温育并不影响PXD杀伤增殖T细胞的能力(表1)。
表1.暴露于PXD的时间对增殖T细胞的存活的影响
Figure BDA0000057903030000241
Figure BDA0000057903030000251
*在37℃下在不同浓度的血清中预温育100μM PXD 1小时，用RPMI洗涤两次，并加入到增殖T细胞中至10μM的最终浓度。然后再温育细胞24小时。**计算为[在暴露于PXD以后的％(AV-PI-)]/[暴露于0.1％DMSO的细胞的％(AV-PI-)]。结果表示为至少两个独立实验的平均值±SEM。
PXD消除在HLA错配MLR中的增殖应答T细胞
在HLA错配MLR中，进一步测试了PXD诱导增殖T细胞凋亡的能力。在0.1％DMSO(对照)和10μM PXD存在的情况下在第0天，混合CFSE标记的应答细胞和HLA错配的γ照射刺激细胞。在第8天分析应答细胞的增殖(CFSElo)和生存力(AV-)，以便于增殖应答细胞暴露于药物若干天。在对照MLR中观测到同种异体T细胞(CD3+CFSEloAV-群体)的强活化和增殖(46.5％，图3D)，但在经PXD处理的MLR中观测不到(2％，图3B)。相反，静止应答细胞群体(CD3+CFSEhiAV-)存在于对照和PXD处理的MLR中。
实施例2-PXD对非刺激和应答T细胞的影响
在瞬态暴露于PXD以后非刺激T细胞应答外来抗原
本发明的发明人接着确定了瞬态暴露于PXD是否影响非刺激T细胞正常应答外来抗原的能力。用10μM PXD温育非刺激T细胞24小时，洗涤两次，然后通过添加HLA错配γ照射刺激细胞加以刺激。8天后的FACS分析表明，非刺激应答T细胞瞬态暴露于PXD并不影响它们的随后的活化和增殖，如类似规模的CD3+CFSEloAV-群体所证明的(在对照MLR中为62.6％以及在PXD处理的MLR中为56.2％)(图4)。
可以在第三方MLR中再刺激静止应答T细胞
通过确定PXD暴露对应答T细胞的影响来扩展上述实验，其中上述应答T细胞已先前暴露于，但在MLR中未活化。建立MLR的两个连续集，在第0天混合应答T细胞和γ照射刺激细胞，在第5天添加10μM PXD或0.1％DMSO，并在第8天分析应答T细胞的增殖和生存力。然后通过FACS来分选有生存力的静止(CD3+CFSEhiAV-)群体并在第三方MLR的随后的集中在没有PXD的情况下加以刺激。在第二MLR期间，刺激的T细胞会增殖(CD3+CSFElo群体，在图5D中)但非刺激T细胞则不会(图5B)，这表明，PXD既不影响非增殖T细胞的生存力也不影响其功能。
实施例3-在来自骨髓样品的白血病细胞系和白血病原始细胞中PXD引起凋亡
虽然PXD已显示在许多细胞系中引起凋亡，但临床试验迄今集中于实体癌，包括卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌以及黑素瘤。本发明的发明人先前已表明，PXD杀伤AML来源的HL60细胞并且这里该发现被扩展到血液癌的小组以及扩展到来自ALL和AML患者的骨髓样品的许多原发性白血病原始细胞(图6)。这些临床样品的具体特征描述在表2中。对PXD的敏感性在细胞系与原代细胞之间有差异。有趣的是，与AML原始细胞相比，ALL原始细胞在它们对PXD的应答方面更一致并且显著更敏感(p＝0.0002)，其表明它们对PXD的敏感性的广泛的可变性(图6)。
表2.ALL和AML临床样品的特征
Figure BDA0000057903030000261
Figure BDA0000057903030000271
R＝在复发时获取的样品。D＝在诊断时获取的样品。
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Claims (19)

1.化学式I的化合物或其药用盐或前药作为免疫调节剂的应用，
Figure FDA0000057903020000011
其中
R1是羟基、烷氧基、卤素或OC(O)R9，
R2和R3独立地是氢、羟基、烷氧基、烷基、卤素或OC(O)R9，
A是氢或以下化学式的可选取代的苯基
Figure FDA0000057903020000012
R4、R5以及R6独立地是氢、羟基、烷氧基、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或OC(O)R9，
R7和R8独立地是氢、羟基、烷基、烷氧基或卤素，
R9是氢、烷基、芳基、芳烷基或氨基，以及
图样
Figure FDA0000057903020000013
表示单键或双键。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述化合物选自异黄-3-烯-4′，7-二醇、3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)色原烷-7-醇以及3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-8-甲基色原烷-7-醇。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述化合物是异黄-3-烯-4′，7-二醇。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其中，化学式I的化合物的免疫调节活性包括增殖T细胞的增殖和/或活性的抑制。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述化合物诱导或促进增殖T细胞的凋亡。
6.根据权利要求4所述的应用，其中，所述活性的抑制包括抑制在增殖T细胞中的质膜电子传递。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的应用，其中，所述增殖T细胞是快速或异常增殖T细胞。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的应用，其中，所述T细胞是应答T细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的应用，其中，以免疫调节有效量将所述化合物作为免疫调节剂给予需要其的哺乳动物。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述哺乳动物患有、或易感与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的应用，其中，所述化合物的所述免疫调节有效量小于治疗有效量，其中所述化合物具有相对于疾病或病症的治疗活性。
12.一种用于抑制增殖T细胞的增殖和/或活性的方法，所述方法包括将所述增殖T细胞暴露于有效量的根据本文描述的化学式I的化合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述增殖T细胞存在于、或来自患有或易患与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症的个体。
14.一种在哺乳动物中调节免疫系统的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物免疫调节有效量的至少一种根据本文描述的化学式I的化合物或其药用盐或前药。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述化合物抑制增殖T细胞的增殖和/或活性。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述增殖T细胞是异常或快速增殖T细胞。
17.一种用于治疗或预防与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症的方法，所述方法包括给予需要其的哺乳动物免疫调节有效量的根据本文描述的化学式I的化合物或其药用盐或前药。
18.根据本文描述的化学式I的化合物、或其药用盐或前药在制备用于治疗或预防与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症的药物中的应用。
19.一种用于增强用于受试者的治疗方案的方法，所述受试者患有与T细胞的异常增殖或刺激有关的疾病或病症，所述方法包括给予所述受试者免疫调节有效量的根据本文描述的化学式I的化合物或其药用盐或前药。
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