CN102199203A - 大豆GmFTL4蛋白和GmFTL6蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆GmFTL4蛋白和GmFTL6蛋白，其具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。过表达大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6可明显促进植物(拟南芥)开花，使开花时间缩短，生育期缩短。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及两个大豆开花基因、其编码的蛋白及其在植物光周期和开花时间调节中的应用。
背景技术
大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂等次生代谢产物的重要来源。因为大豆是短日植物，开花受光周期的严格控制，因而不同区域间的优异品种不能相互引种、生育期也受环境光周期的制约(Zhang等.，2008)。如果能降低大豆对光周期的敏感性，突破大豆开花对光周期的限制，就能解决大豆的引种问题，从而实现各区域间优质品种的相互交换，丰富各地优异种质资源，调节大豆生育期，提高大豆产量和品质。以往解决大豆光周期敏感性主要是通过杂交的方法获得新品种，但是，这种育种方法具有对亲本的依赖性强和周期长等缺点，到目前为止尚未获得大豆光周期广适应性品种。
对拟南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受极其复杂的调节网络控制的(Mouradov等.，2002；Turck等，2008)。但是，其中一个关键蛋白对开花时间的调节起着至关重要的作用，它就是FloweringLocus T(简称FT)，它在叶片中产生，通过维管组织系统运输到生长点并诱导生长点形成花(Blazquez and Weigel，2000；Lee等.，2000；Samach等，2000；Turck等，2008)。因而，FT蛋白被称为成花素(Corbesier等，2007；Jaeger and Wigge，2007；Mathieu等，2007)。该成花素的表达可以降低植物对光周期的敏感性，促进植物开花。FT基因的功能在不同的植物中有报道(Bohlenius等，2006；Hsu等，2006；Yan等，2006；Corbesier等，2007；Jaeger and Wigge，2007；Lin等.，2007；Mathieu等，2007；Tamaki等，2007；Li and Dubcovsky，2008)，但在大豆FT基因的功能及其应用未见报道。通过调节大豆开花基因表达来改变植物对光周期的敏感性和开花时间也没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供两个大豆开花基因、其编码的蛋白及其在植物光周期和开花时间调节中的应用。
本发明提供一种大豆GmFTL4蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，以及大豆GmFTL6蛋白，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还提供编码上述的大豆GmFTL4蛋白和大豆GmFTL6蛋白的基因。编码大豆GmFTL4蛋白的基因具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。编码大豆GmFTL6蛋白的基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
本发明的GmFTL4和GmFTL6(全称为Glycine max FloweringLocus T Like 4和6)是从大豆垦农18(Glycine max L.Kennong 18)中克隆到的两个基因，它们编码蛋白的氨基酸序列之间的相似性为96.5％，与拟南芥FT蛋白的氨基酸序列之间的相似性均为65.3％。并且GmFTL4和GmFTL6蛋白与拟南芥FT具有序列相近的保守域。因此，GmFTL4和GmFTL6与拟南芥FT基因具有类似促进开花的功能。但是，GmFTL4和GmFTL6的蛋白质序列与拟南芥FT蛋白有重要不同。在重要功能域中，大豆GmFTL4和GmFTL6的蛋白质第131位氨基酸残基为天冬氨酸(D)，第134位氨基酸残基为异亮氨酸(I)，第135位氨基酸残基为苏氨酸(T)，第137位氨基酸残基为谷氨酸(E)，第140位氨基酸残基是组氨酸(H)，第151位氨基酸残基为天冬酰胺(N)，而拟南芥相应部位分别是谷胺酰胺(Q)、酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、谷胺酰胺(Q)和酪氨酸(Y)。这些差异导致GmFTL4和GmFTL6的活性比拟南芥FT弱。大豆GmFTL4和GmFTL6基因主要在开花前期和开花期的叶中表达。
本发明包括通过各种方法获得的、如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质以及编码这些衍生蛋白质的基因。
本发明将GmFTL4和GmFTL6基因构建到表达载体p35S-GW上，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将p35S-GW携带的GmFTL4和GmFTL6基因转入拟南芥，获得拟南芥转化植株。结果表明，GmFTL4和GmFTL6具有降低植物对光周期的敏感性并促进拟南芥开花的作用。
本发明还包括含有GmFTL4和GmFTL6核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化植物细胞和转基因植物。
本发明具有如下有益效果：
1)提供了大豆GmFTL4和GmFTL6基因及其编码的蛋白本身；
2)通过在植物中过表达GmFTL4和GmFTL6基因缩短植物生育期，促进植物开花；
3)GmFTL4和GmFTL6基因及其编码的蛋白可以调节花期，可用于解决杂交育种中的花期不遇的问题，各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的问题以及光周期敏感性问题和引种问题；
4)大豆GmFTL4和GmFTL6基因调节花期的效应较拟南芥FT基因的效应弱，但转基因植株生长较为健壮。
附图说明
图1为本发明大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6编码蛋白的氨基酸序列与FT基因编码蛋白的氨基酸序列的比较；
图2为本发明实施例3的植物表达载体p35S-GW的结构示意图；
图3为本发明实施例4的克隆中间载体pGWCm的结构示意图；
图4显示大豆开花基因GmFTL4转化拟南芥，导致拟南芥早开花；
图5显示大豆开花基因GmFTL6转化拟南芥，导致拟南芥早开花；
图6A为本发明实施例7的大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6在不同发育时期的表达水平；
图6B为本发明实施例7的大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6在不同组织器官的表达水平；
图7A为本发明实施例8的大豆开花基因GmFTL4在转基因植物细胞核中的定位；
图7B为本发明实施例8的大豆开花基因GmFTL6在转基因植物细胞核中的定位；
其中，在图6A和图6B中，短线前面的字母表示植株的发育时期，短线后面的字母表示器官，U代表单叶；T代表复叶(T后面的数字为复叶的顺序)；F代表花；Pd代表荚；Pt代表叶柄(其后数字表示不同时期的荚)；R代表根；HH代表上胚轴；EH代表下胚轴；SAM代表生长点；St代表茎；L代表侧生叶；C代表子叶。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6的克隆
分别利用正向引物5’-ATGGCACGGGAGAACCCTCT-3’和反向引物5’-TTAATATCTCCTTCCACCGCAAC-3’以及正向引物5’-AACACAAACAATATAGTATCTAACA-3’和反向引物5’-AAAAAATCTTCATTGAACTTG-3’从大豆垦农18(Glycine max L.Kennong 18)中克隆并测序获得GmFTL4和GmFTL6基因，其基因序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
PCR反应程序为：95℃5min预变性，95℃30S，45℃35S，72℃1min，25个循环，72℃10min延伸。
实施例2大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6编码蛋白的氨基酸序列分析
大豆开花基因的GmFTL4和GmFTL6蛋白序列之间的同源性大于96.5％，C端的功能域与拟南芥相似性较高，但存在重要区别，如图1所示。大豆GmFTL4和GmFTL6的蛋白质第131位氨基酸残基为天冬氨酸(D)，第134位氨基酸残基为异亮氨酸(I)，第135位氨基酸残基为苏氨酸(T)，第137位氨基酸残基谷氨酸为(E)，第140位氨基酸残基是组氨酸(H)，第151位氨基酸残基天冬酰胺为(N)，而拟南芥相应部位分别是谷胺酰胺(Q)、酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、谷胺酰胺(Q)和酪氨酸(Y)。这些差异导致GmFTL4和GmFTL6的活性比拟南芥FT弱。
实施例3大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6的克隆载体
从实施例1中扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图3所示的pGWCm载体上。先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16℃进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩增，筛选阳性克隆并测序。
实施例4大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6的植物表达载体
分别将从实施例3中得到的大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6的克隆载体与如图2所示的植物表达载体p35S-GW等比例混合后通过LR反应(两种质粒各50ng，LR酶1μl，补H2O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将GmFTL4和GmFTL6构建在p35S-GW上，用于在植物中过表达大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6，研究其功能。植物的转化方法采用农杆菌介导法进行。植物中的筛选标记为Bar。
实施例5大豆开花基因GmFTL4促进拟南芥开花
从实施例4获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型Col对照)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m-2·s-1)下同时培育，直至转化植株开花(约20)。图4显示大豆开花基因GmFTL4转化拟南芥，导致拟南芥早开花，对光周期不敏感。如图4所示，其中左侧代表对照野生型Col，右侧代表转基因植株。说明大豆GmFTL4蛋白具有开花活性，可以促进植物开花。
实施例6大豆开花基因GmFTL6促进拟南芥开花
从实施例4获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型Col对照)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m-2·s-1)下同时培育，直至转化植株开花(约20)。图5显示大豆开花基因GmFTL6转化拟南芥，导致拟南芥较早开花，对光周期不敏感。如图5所示，其中左侧代表对照野生型Col，右侧代表转基因植株。说明大豆GmFTL6蛋白具有开花活性，可以促进植物开花。
实施例7大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6在大豆的不同发育时期及组织器官中的表达水平
利用实时定量荧光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6在大豆不同发育时期及组织器官中的表达。实时荧光定量PCR采用ABI StepOne进行，用SYBR Green I检测荧光信号。反应体系为：
SYBR Primix Ex Taq(2×)(TaKaRa)_7.5μl
上游引物(10μM) 0.3μl
下游引物(10μM) 0.3μl
ROX Reference Dye(50x) 0.3μl
cDNA 1.0μl
ddH2O(灭菌双蒸水) 5.6μl
反应参数为两步法：95℃10S，热启动；95℃5S，60℃1min，40个循环。用基因芯片数据分析软件Genesis对基因的表达进行标准化并作图。
大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6主要在开花前期和开花期的叶片中表达，GmFTL4和GmFTL6在叶柄中表达水平最高，如图6所示。
实施例8大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6编码蛋白在转基因植物中的定位
采用基因枪轰击的方法，将大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6与YFP的融合基因，转化至大豆叶片中。具体方法如下：
1)微粒子弹的制备：将10μg重组质粒DNA与6μl 50mg/ml的金粉悬液(直径为1.0μm)、4μl 0.1mol/L亚精胺(抽滤灭菌)和6μl 2.5mol/LCaCl2，涡旋振荡混匀，冰上静置15min，12,000rpm离心10s，收集金粉沉淀，用20μl无水乙醇重悬。
2)轰击受体材料：将幼嫩的洋葱表皮或大豆幼嫩叶片摆放在MS培养基上，22℃预培养4h。选用1100psi的压力膜，将20μl金粉-DNA混合物点在轰击膜中央，采用PDS 1000/He型基因枪(Bio-Rad)进行轰击，轰击距离6cm，真空度为25In.Hg。轰击后的洋葱表皮细胞22℃暗培养24h后，在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP2)下观察。
转化细胞中的GFP/YFP荧光信号表示大豆开花基因GmFTL4和GmFTL6编码蛋白的定位，如图7所示。图7显示大豆开花基因GmFTL4(图7A)和GmFTL6(图7B)编码的蛋白在大豆叶片(图7A和图7B)中主要定位于核。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业科学院作物科学研究所
<120>大豆GmFTL4蛋白和GmFTL6蛋白及其应用
<130>
<160>8
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>172
<212>PRT
<213>GmFTL4
<400>1
Met Ala Arg Glu Asn Pro Leu Val Ile Gly Gly Val Ile Gly Asp Val
1 5 10 15
Leu Asn Pro Phe Thr Ser Ser Val Ser Leu Thr Val Ser Ile Asn Asn
20 25 30
Arg Ala Ile Ser Asn Gly Leu Glu Leu Arg Pro Ser Gln Val Val Asn
35 40 45
Arg Pro Arg Val Thr Val Gly Gly Glu Asp Leu Arg Thr Phe Tyr Thr
50 55 60
Leu Val Met Val Asp Ala Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asn Pro Val Leu
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Ser Phe Gly Arg Glu Val Val Phe Tyr Glu Ser Pro Asn Pro Ser
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170
<210>2
<211>172
<212>PRT
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<210>3
<211>519
<212>DNA
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<400>3
ATGGCACGGG AGAACCCTCT TGTTATTGGT GGTGTGATTG GGGATGTTCT CAACCCTTTT 60
ACAAGCTCCG TTTCTTTGAC TGTTTCAATC AATAATAGGG CGATTAGCAA TGGCTTGGAA 120
CTCAGGCCCT CTCAAGTTGT TAATCGCCCT AGGGTTACTG TTGGTGGTGA AGACCTAAGG 180
ACCTTCTACA CTCTGGTTAT GGTGGATGCA GATGCACCTA GCCCTAGCAA CCCTGTCTTG 240
AGGGAATACC TTCACTGGAT GGTGACAGAT ATTCCAGCTA CCACAAATGC AAGCTTTGGG 300
AGAGAGGTTG TGTTTTATGA GAGCCCGAAC CCTTCAGTAG GGATTCATCG AATCGTGTTC 360
GTATTGTTCC AGCAATTGGG CAGAGACACT GTCATCACCC CAGAATGGCG CCATAATTTC 420
AATTCCAGAA ACTTTGCTGA AATTAATAAC CTTGCACCTG TTGCAGCAGC TTATGCCAAC 480
TGCCAAAGAG AGCGTGGTTG CGGTGGAAGG AGATATTAA 519
<210>4
<211>519
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ACCTTCTACA CACTGGTTAT GGTGGATGCA GATGCACCTA GCCCTAGCAA CCCTGTCTTG 240
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
AAAAAATCTT CATTGAACTT G 21
Claims (10)
1.大豆GmFTL4蛋白，其特征在于，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.大豆GmFTL6蛋白，其特征在于，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.编码权利要求1所述的大豆GmFTL4蛋白的基因。
4.编码权利要求2所述的大豆GmFTL6蛋白的基因。
5.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的基因，其特征在于，其具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
7.含有权利要求3-6任一项所述基因或其片段的载体。
8.含有权利要求7所述载体的宿主。
9.含有权利要求3-6任一项所述基因或其片段的转化植物细胞。
10.权利要求3-6任一项所述的基因或其片段在调节植物光周期和开花时间中的应用。
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