CN102197044B - 具有抗糖尿病活性的肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有降低高血糖患者血糖值的作用，从而用来降低该患者的血糖值的组合物(血糖升高抑制剂)。本发明还提供基于上述作用来用于预防或治疗由高血糖所引起的疾病，特别是糖尿病和糖尿病并发症的组合物(预防或治疗由高血糖所引起的疾病的组合物，抗糖尿病剂)。本发明的特征在于使用由Leu-Ser-Glu-Leu氨基酸序列组成的肽作为有效成分。

Description

具有抗糖尿病活性的肽及其用途
技术领域
本发明涉及具有血糖值升高抑制作用和胰岛素分泌增强作用的新型肽。进一步地，本发明涉及具有上述药理作用的肽的用途。 
背景技术
体内血糖值由胰岛素的降血糖作用与肾上腺素、胰高血糖素、糖皮质激素等的升血糖作用之间的平衡控制。更具体地，胰岛素抑制肝脏中的糖原分解和糖原异生，从而抑制葡萄糖的生成并降低肝脏向血液中释放的葡萄糖量；同时，胰岛素增加骨骼肌和白色脂肪组织中的葡萄糖摄取，从而降低血糖值。相反，肾上腺素、胰高血糖素等促进肝脏中的糖原分解和糖原异生，并增强葡萄糖从其中的释放，从而升高血糖值。 
糖尿病是代谢性疾病，其中由胰岛素作用的急性或慢性下降引起持续的高血糖状态，导致糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢等的紊乱。 
糖尿病分为胰岛素依赖型或非胰岛素依赖型。对于治疗胰岛素分泌能力下降或丧失的胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)的患者，饮食治疗和口服降血糖药物是无效的，施用胰岛素是唯一的治疗方法。相反，对于治疗占糖尿病患者90％的非胰岛素依赖型糖尿病患者，虽然他们的胰岛素作用较正常人弱，但是并不总是需要施用胰岛素，通常可以食物疗法和运动疗法。当这些治疗不足时，则同时采用降血糖药物的化学疗法。 
如上所述，糖尿病是持续高血糖状态造成的代谢紊乱所引起的疾病。所以，糖尿病是棘手的疾病，其可能伴随眼、肾、神经系统、心血管系统、皮肤等处的许多并发症。一般认为，此种并发症可通过将血糖值控制到近正常水平来减少(非专利文献(NPL)1)。 
改善高血糖状态的已知药物制剂包括胰岛素制剂、磺酰脲制剂、双胍制剂、胰岛素抵抗改良剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂等。胰岛素制剂是胰岛素依赖型糖尿病的治疗剂。虽然胰岛素制剂可靠地降低血糖值， 但有引起低血糖症的风险。磺酰脲制剂是通过经刺激胰腺β-细胞增强内源性胰岛素分泌来降低血糖值的药物。不论血糖值如何，磺酰脲制剂都可引起由胰岛素分泌引起的低血糖症副作用。双胍制剂是通过抑制肝脏中的糖原异生、增大骨骼肌等中的糖消耗、并抑制肠内的糖吸收来降低血糖值的药物。双胍制剂的优点是在正常受验者或糖尿病患者中均不会引起低血糖症，但它有可能引起相当严重的乳酸性酸中毒。胰岛素抵抗改良剂(例如，噻唑烷衍生物等)是通过增强胰岛素作用和活化胰岛素受体激酶来降低血糖值的药物。然而，已指出胰岛素抵抗改良剂存在下列问题：发生消化系统症状、浮肿等副作用；红细胞、血细胞比容和血红蛋白的量减少；以及LDH的量增大(非专利文献(NPL)2)。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过延缓糖类在胃肠道中的消化和吸收而表现出抑制餐后血糖值升高的作用，但问题在于诸如肿胀感、腹鸣和腹泻的成问题的副作用(非专利文献(NPL)3)。 
因而，有效治疗或防止糖尿病和糖尿病并发症的决定性方法还有待建立。 
最近，具有抑制血糖值升高的作用(即，血糖值升高抑制作用)和增强胰岛素分泌的作用(胰岛素分泌增强作用)的肽受到关注。例如，专利文献(PTL)1至3建议使用此种肽作为抗糖尿病药物的有效成分。 
引用文献
专利文献 
PTL1：日本未审查专利公开第2007-524584号 
PTL2：WO2003/030936 
PTL3：日本未审查专利公开第2008-519758号 
非专利文献 
NPL1：“Saishin Igaku Daijiten”，1988，p.1211，Ishiyaku Publishers Inc.，Japan 
NPL2：“Atarashii Tonyobyo Chiryoyaku(New Diabetic Medicines)”，pp.90-99，1994，Iyaku(Medicine and Drug)Journal Co.，Ltd.，Japan 
NPL3：Joslin's Diabetes mellitus，13th ed.，pp.521-522. 
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供具有血糖值升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用的新型肽。本发明的另一目的在于提供一种药物组合物、食品组合物、或饲料组合物，其包含上述肽作为有效成分，从而表现出血糖值升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用。本发明的进一步目的在于提供如下组合物：抑制血糖值升高的组合物、增强胰岛素分泌的组合物、或者治疗或预防糖尿病或糖尿病并发症的组合物。 
解决问题的方案
本发明人进行了广泛的研究从而实现上述目的。本发明人发现，当给人为诱发高血糖的小鼠施用四肽(Leu-Ser-Glu-Leu)时，其血糖值显著降低且高血糖得以改善。本发明人进行进一步研究，证实该LSEL肽对血糖升高的抑制作用是由胰岛素分泌增强作用引起的。 
基于上述发现，本发明人证实，该LSEL肽抑制和改善糖尿病患者或临界糖尿病患者，即前驱糖尿病患者的高血糖症(降低高血糖症的血糖值)，并对于预防或治疗由高血糖引起的疾病，如糖尿病和糖尿病并发症有效。本发明是基于这些发现完成的。 
更具体地，本发明包括以下实施方式。 
(I)新型肽
由以Leu-Ser-Glu-Leu表示的氨基酸序列组成的肽。 
(II)组合物
(II-1)包括项(I)所述的肽作为有效成分的药物组合物、食品组合物、或饲料组合物。 
(II-2)抑制血糖值升高的组合物，所述组合物包括项(I)所述的肽作为有效成分。 
(II-3)增强胰岛素分泌的组合物，所述组合物包括项(I)所述的肽作为有效成分。 
(II-4)预防或治疗高血糖引起的疾病的组合物，所述组合物包括项(I)所述的肽作为有效成分。 
(II-5)根据项(II-4)所述的组合物，其中所述由高血糖引起的疾病是糖尿病或糖尿病并发症。 
(II-6)根据项(II-5)所述的组合物，其中所述糖尿病并发症是选自糖尿病酸中毒、糖尿病性黄瘤、糖尿病性肌萎缩、糖尿病性酮症、糖尿病性昏迷、糖尿病性胃障碍、糖尿病性坏疽、糖尿病性溃疡、糖尿病有关的并发症、糖尿病性腹泻、糖尿病性微血管病变、糖尿病性子宫体硬化、糖尿病性心肌病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性大疱症、糖尿病性白内障、糖尿病性皮肤病、糖尿病性硬肿症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性类脂质渐进性坏死、和糖尿病性血液循环障碍的至少一种疾病。 
(II-7)根据项(II-5)或(II-6)所述的组合物，其中所述糖尿病是2型糖尿病。 
(III)治疗或预防由高血糖引起的疾病的方法。
(III-1)治疗或预防由高血糖引起的疾病的方法，包括向罹患由高血糖引起的疾病的患者施用项(II-1)至(II-7)中任一项所述的组合物。 
(III-2)根据项(III-1)所述的方法，其中所述由高血糖引起的疾病是糖尿病或糖尿病并发症。 
(III-3)根据项(III-2)所述的方法，其中所述糖尿病并发症是糖尿病酸中毒、糖尿病性黄瘤、糖尿病性肌萎缩、糖尿病性酮症、糖尿病性昏迷、糖尿病性胃障碍、糖尿病性坏疽、糖尿病性溃疡、糖尿病有关的并发症、糖尿病性腹泻、糖尿病性微血管病变、糖尿病性子宫体硬化、糖尿病性心肌病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性大疱症、糖尿病性白内障、糖尿病性皮肤病、糖尿病性硬肿症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性类脂质渐进性坏死、和糖尿病性血液循环障碍。 
(III-4)根据项(III-2)或(III-3)所述的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。 
(IV)肽的用途
(IV-1)由以Leu-Ser-Glu-Leu表示的氨基酸序列组成的肽在生产预防或治疗由高血糖引起的疾病的组合物中的用途。 
(IV-2)根据项(IV-1)所述的用途，其中所述由高血糖引起的疾病是糖尿病或糖尿病并发症。 
(IV-3)根据项(IV-2)所述的用途，其中所述糖尿病并发症是选自糖尿病酸中毒、糖尿病性黄瘤、糖尿病性肌萎缩、糖尿病性酮症、糖尿病性昏迷、糖尿病性胃障碍、糖尿病性坏疽、糖尿病性溃疡、糖尿病有关的并发症、糖尿病性腹泻、糖尿病性微血管病变、糖尿病性子宫体硬化、糖尿病性心肌病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性大疱症、糖尿病性白内障、糖尿病性皮肤病、糖尿病性硬肿症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性类脂质渐进性坏死、和糖尿病性血液循环障碍的至少一种疾病。 
(IV-4)根据项(IV-2)或(IV-3)所述的用途，其中所述糖尿病是2型糖尿病。 
(IV-5)由以Leu-Ser-Glu-Leu表示的氨基酸序列组成的、用于预防或治疗由高血糖引起的疾病的肽。 
(IV-6)根据项(IV-5)所述的肽，其中所述由高血糖引起的疾病是糖尿病或糖尿病并发症。 
(IV-7)根据项(IV-6)所述的肽，其中所述糖尿病并发症是选自糖尿病酸中毒、糖尿病性黄瘤、糖尿病性肌萎缩、糖尿病性酮症、糖尿病性昏迷、糖尿病性胃障碍、糖尿病性坏疽、糖尿病性溃疡、糖尿病有关的并发症、糖尿病性腹泻、糖尿病性微血管病变、糖尿病性子宫体硬化、糖尿病性心肌病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性大疱症、糖尿病性白内障、糖尿病性皮肤病、糖尿病性硬肿症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性类脂质渐进性坏死、和糖尿病性血液循环障碍的至少一种疾病。 
(IV-8)根据项(IV-6)或(IV-7)所述的肽，其中所述糖尿病是2型糖尿病。 
具体实施方式
(1)肽(Leu-Ser-Glu-Leu)
本发明提供由以Leu-Ser-Glu-Leu表示的氨基酸序列组成的四肽(下文有时称为“LSEL肽”或“本发明的肽”)。当口服或肠胃外施用时，这种肽表现出血糖值升高抑制作用和胰岛素分泌增强作用，如在下面示例性实施例中利用人为诱发高血糖的小鼠糖尿病模型和正常 小鼠所证明。更具体地，该肽是具有血糖值升高抑制作用和胰岛素分泌增强作用的生物活性肽。 
本发明的肽可以按照氨基酸序列通过通用化学合成法合成。此种化学合成法包括常用的液相和固相法。更特别地，肽合成方法的实例包括按照本发明提供的氨基酸序列信息使单个氨基酸一个接一个连续结合的逐步延伸法；和预先合成各个由数个氨基酸组成的片段然后通过反应偶联的片段缩合法。本发明的肽可以通过上述任一种方法合成。 
已知的缩合法可用来合成该肽。缩合法的实例包括叠氮化物法、混合酸酐法、DCC法、活性酯法、氧化还原法、DPPA(叠氮磷酸二苯酯)法、DCC-添加剂(1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺等)法、Woodward法等。可在上述方法中使用的溶剂可以从众所周知用在这类肽缩合反应中的一般溶剂当中适当地选择。此种溶剂的实例包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、六磷酰胺(hexaphosphoramide)、二噁烷、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、及此种溶剂的混合物。 
该肽或氨基酸中不参与肽合成反应的羧基一般可以通过酯化保护，例如下列酯的形式：低级烷基酯如甲酯、乙酯和叔丁酯，芳烷基酯如苄酯、对甲氧基苄酯、对硝基苄酯和芳烷基酯等。从此种被保护的氨基酸、肽和本发明的最终产品肽中除去保护基团的反应也可以通过已知方法进行，如催化还原法，或利用液氨/钠、氢氟酸、氢溴酸、盐酸、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸等的方法。 
如此获得的本发明的肽可以按照肽化学领域中通常使用的方法适当地纯化，如离子交换树脂法、分配色谱、凝胶色谱、亲和色谱、高效液相色谱(HPLC)、和逆流分配法。 
除了上述化学合成法之外，本发明的肽还可以通过包含上面氨基酸序列(Leu-Ser-Glu-Leu)的多肽或蛋白质的酶促降解或水解制造。此种多肽或蛋白质的来源没有特别限制，并可以为任何动物、鱼类、贝虾类和植物。作为参考，图1示出包含含有该氨基酸序列(Leu-Ser-Glu-Leu)的多肽或蛋白质的动物、鱼类、贝虾类和植物的列表，这是利用日本DNA Databank拥有的氨基酸序列数据库“FASTA”获得的检索结果。 
如上所述，当口服或肠胃外施用时，该LSEL肽表现出生物活性作用(药理作用)，即血糖值升高抑制作用和胰岛素分泌增强作用。所以，该LSEL肽适合用作药物组合物、食品组合物、或饲料组合物的有效成分。 
下面描述包含该LSEL肽作为有效成分的药物组合物、食品组合物、或饲料组合物。 
(2)药物组合物
本发明的药物组合物的特征是包含该LSEL肽作为有效成分。 
根据本发明提供的药物组合物包括抑制血糖值升高的组合物(血糖升高抑制剂)；增强胰岛素分泌的组合物(胰岛素分泌增强剂)；以及预防或治疗由高血糖引起的疾病的组合物(由高血糖引起的疾病的预防剂或治疗剂)。 
抑制血糖值升高的组合物的特征是，包含对预防或治疗糖尿病患者或临界糖尿病患者亦即前驱糖尿病患者的高血糖(抑制血糖值升高)有效的量的LSEL肽。增强胰岛素分泌的组合物的特征是，包含对增强糖尿病患者或临界糖尿病患者的胰岛素分泌有效的量的LSEL肽。进一步地，预防或治疗由高血糖引起的疾病的组合物的特征是，包含对表现出血糖升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用、从而预防或治疗疾病有效的量的LSEL肽。 
只要本发明的药物组合物包含对表现出血糖值升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用有效的量的LSEL肽，该组合物可以完全由该LSEL肽组成。然而，本发明的药物组合物通常与药学上可接受的载体和/或添加剂在一起进行制备。 
载体的实例包括赋形剂、稀释剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、崩解抑制剂、吸收促进剂、润滑剂、增溶剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、以及根据药物组合物(制剂)的剂型通常使用的类似物。添加剂的实例包括稳定剂、防腐剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH调节剂、表面活性剂、着色剂、芳族化学药品、调味剂、增甜剂、以及根据制剂的剂型通常使用的类似物。 
本发明的药物组合物的单位剂型(药物制剂的剂型)可以根据施用途径适当地选择。该药物组合物大体上可以分成口服药剂或肠胃外 药剂(例如，经肺药剂、经鼻药剂、舌下药剂、注射剂、滴剂等)。该药物组合物可以根据已知方法配制、成形或制备成固体剂型如片剂、丸剂、细粉、粉末、颗粒和胶囊；以及液体剂型如溶液、悬浮液、乳液、糖浆和酏剂。该药物组合物可以制备成干燥产品的形式，其在使用时可通过加入合适的载体液化。该药物组合物可以根据已知方法制备成此种剂型中的任何一种。 
LSEL肽在本发明的药物组合物中的量没有特别地限制。根据剂型，该药物组合物可以通常形成包含约0.1wt％至约80wt％量的LSEL肽的药物制剂。 
以此方式获得的药物组合物的剂量可以根据以下因素加以适当地选择：药物组合物的目的(抑制血糖值升高、增强胰岛素分泌、预防或治疗由高血糖引起的疾病)；施用该组合物的方法；剂型；患者的年龄、体重和症状(糖尿病的严重性)；以及其他因素。一般地，该LSEL肽优选以每日约10mg至约1,000mg的剂量施用给成年人。 
该药物组合物不必每天以单剂量施用，可以每天以3至4个分别的剂量施用。前述剂型的此种药物制剂以适合该剂型的途径施用。例如，可注射剂型的药物制剂可以通过静脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内等施用；而固体剂型的药物制剂可以通过口服等施用。 
如下面实验实施例所证明，本发明的药物组合物由于该LSEL肽而具有胰岛素分泌增强作用，可改善由胰岛素作用的减弱或缺乏引起的高血糖，从而表现出血糖值升高抑制作用。所以，本发明的药物组合物可以有效地用作预防或治疗由胰岛素作用的减弱或缺乏造成的高血糖所引起的各种疾病的组合物。 
此种疾病包括糖尿病和糖尿病并发症。目标糖尿病优选为非胰岛素依赖型(2型)糖尿病。 
根据日本糖尿病学会的指南(1999)，当患者具有以下血糖值中的至少一种时可以被诊断为糖尿病：随时血糖值为200mg/dL或更高、空腹血糖值为126mg/dL或更高、或者在75克的口服葡萄糖耐量试验之后负荷后2小时血糖值为200mg/dL或更高。进一步地，在下列情况下患者可以被诊断为糖尿病：当在不同日进行的试验中两次获得根据上述标准的阳性结果时；当糖尿病的症状特征甚至只观察到一次时；当 HbA1c(血红蛋白A1c)的浓度为6.5％或更高时；或者当观察到糖尿病性视网膜病时。HbA1c值是重要的升糖控制指数，一般基于这个值作出评价。HbA1c值反映过去1至2个月的时间内患者的平均血糖值，它在每个患者中是相当稳定的；所以，HbA1c值是最重要的血糖控制指标。 
除了根据上面标准诊断为糖尿病的情况之外，本发明的目标糖尿病还包括临床前期糖尿病(临界糖尿病)。当患者的空腹血糖值为110至125mg/dL，或在葡萄糖耐量试验之后负荷后2小时的血糖值为140至199mg/dL时，该患者可以被诊断为临界糖尿病。 
本文讨论的糖尿病并发症指的是，随着糖尿病(优选非胰岛素依赖型2型糖尿病)直接或间接发生的全身和局部疾病。具体实例为糖尿病酸中毒、糖尿病性黄瘤、糖尿病性肌萎缩、糖尿病性酮症、糖尿病性昏迷、糖尿病性胃病、糖尿病性坏疽、糖尿病性溃疡、糖尿病有关的并发症、糖尿病性腹泻、糖尿病性微血管病变、糖尿病性子宫体硬化、糖尿病性心肌病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性大疱症、糖尿病性白内障、糖尿病性皮肤病、糖尿病性硬肿症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性类脂质渐进性坏死、和糖尿病性血液循环障碍等。 
本发明的药物组合物可以施用给上述由高血糖状态引起的各种疾病的患者，从而有效地预防或治疗该患者的疾病。 
本发明的药物组合物包括动物用药物组合物、以及人用药物组合物。 
(3)食品组合物
本发明的食品组合物的特征是包含该LSEL肽作为有效成分。 
根据本发明提供的食品组合物包括具有抑制血糖值升高功能的特定保健用食品(包括准许用于特定保健用途的食品，即合格的FOSHU)；具有增强胰岛素分泌功能的特定保健用食品(包括准许用于特定保健用途的食品，即合格的FOSHU)；以及由于血糖升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用而用来预防或改善由高血糖所引起的疾病的特定保健用食品(包括准许用于特定保健用途的食品，即合格的FOSHU)。 
具有抑制血糖值升高功能的特定保健用食品的特征是，包含对预防或改善糖尿病患者或临界糖尿病患者的高血糖状态(抑制血糖值升高)有效的量的LSEL肽；该食品的包装和广告上可带有该作用(血糖值升高抑制作用)的标识。具有增强胰岛素分泌功能的特定保健用食品的特征是，包含对增强糖尿病患者或临界糖尿病患者的胰岛素分泌有效的量的LSEL肽；该食品的包装和广告上可带有关于该作用(胰岛素分泌增强作用)的标识。用于预防或改善由高血糖引起的疾病的特定保健用食品的特征是，包含由于血糖升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用而对预防或改善上述疾病有效的量的LSEL肽；该食品的包装和广告上可带有关于该作用(抗糖尿病作用)的标识。
只要本发明的食品组合物包含对表现出血糖值升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用有效的量的LSEL肽，本发明的食品组合物可以完全由该LSEL肽组成。然而，本发明的食品组合物通常与可在食品中使用的载体或添加剂在一起进行制备。当LSEL肽从动物、鱼类、贝虾类或植物中获得时，该LSEL肽并不总是需要纯化，只要所得肽具有血糖升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用即可。包含该LSEL肽或其部分的蛋白溶解产物(proteolysate)也可以用作本发明的食品组合物的有效成分。 
本发明的食品组合物包括食品添加剂和补充剂，其利用该肽LSEL，任选地与食品可接受的载体和添加剂一起制备成片剂、丸剂、胶囊、颗粒、细粉、粉末、溶液(饮品)等形式。进一步地，该组合物包括含有该肽LSEL的产品，其可以采取普通食品和饮料的形式。 
此种食品和饮料的实例包括，乳制饮料、乳酸菌饮料、含果汁软饮品、软饮品、碳酸饮料、果汁饮品、蔬菜汁饮品、蔬菜/水果饮料、酒精饮料、粉末状饮料、咖啡饮料、红茶饮料、绿茶饮料、大麦茶饮料、和类似饮料；牛乳布丁、奶制布丁、苏弗累布丁(soufflé puddings)、含果汁布丁和类似布丁、果冻、巴伐利亚奶油(bavarois)、酸乳和类似甜点；冰淇淋、冻牛乳、冰乳糖(lacto-ices)、牛奶冰淇淋、含果汁的冰淇淋、软乳酪(soft creams)、冰糖果、冰冻果子露、冰冻甜点(frozen confections)和类似的冷冻甜食；口香糖、泡泡糖和类似的香口胶(棒状口香糖、糖衣片口香糖)；巧克力豆和类似的包衣巧克力、草莓巧克力、蓝莓巧克力、甜瓜巧克力和类似口味的巧克力、以及类似的巧克力；硬糖(包括夹心糖、黄油球(butterballs)、糖豆(marbles)等)、 软糖(包括饴糖、牛轧糖、橡皮糖(gummy candies)、棉花糖等)、糖球(drop)、太妃糖和类似的饴糖；硬饼干、曲奇饼、okaki(米饼)、煎饼(sembei)(米饼)和类似的烘焙甜食(上述所有均为甜食)；清汤(consommé soups)、浓汤(potage soups)和类似汤；草莓酱、蓝莓酱、桔柑酱、苹果酱、杏子酱、蜜饯、类似果酱；红葡萄酒和类似果酒；浆状樱桃(syruped cherries)、杏、苹果、草莓和桃、和类似的加工水果；火腿、香肠、烤猪肉和类似的加工家畜肉；鱼火腿、鱼香肠、鱼片、鱼糕(kamaboko)(蒸鱼糊(steamed fish paste))、竹轮(chikuwa)(烤鱼糊(baked fish paste))、鱼板(hanpen)(蒸鱼糜(minced and steamed fish))、炸魚餅(satsumaage)(炸鱼丸)、伊达卷(datemaki)(煎蛋卷(omelet wrappers))、鲸咸肉和类似的加工海产品；乌冬(udon)(小麦面条)、hiyamugi(凉面)、somen(细面条)、soba(荞麦面条)、中式面条、意大利式面条、通心面、bifuy(米线)、harusame(凉粉条(bean-jelly stick))、馄饨和类似的面条；和各类配菜、面筋饼、denbu(鱼松粉(mashed and seasoned fish))和类似的各种其它加工食物产品。本发明的食品组合物优选为饮料或甜食的形式。 
有效成分(LSEL肽)在食品组合物中的量、或者食品组合物的摄入量没有特别限制，可根据该食品组合物的类型、期望的改善作用的程度和其他因素，在广泛的范围内加以适当地选择。虽然该食品组合物的剂量可随着食品组合物的类型变化，但是按照每次给体重60kg的人施用的LSEL肽计，剂量可以从约10mg/60kg体重至约1,000mg/60kg体重的范围内加以适当地选择。 
本发明的食品组合物由于LSEL肽而表现出胰岛素分泌增强作用，可改善由胰岛素作用的减弱或缺乏所引起的高血糖，从而抑制血糖值的升高。所以，本发明的食品组合物可以有效地用作预防或治疗右高血糖所引起的各种疾病的组合物。 
(4)饲料组合物
本发明的饲料组合物的特征是包含LSEL肽作为有效成分。 
根据本发明提供的饲料组合物包括，具有抑制血糖值升高功能的饲料；具有增强胰岛素分泌功能的饲料；和由于血糖值升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用来预防或治疗由高血糖所引起的疾病的饲料。 此种饲料优选用作宠物食品，尤其是狗、猫和类似动物。具有抑制血糖值升高功能的饲料的特征是，包含对预防或改善糖尿病或前驱糖尿病动物的高血糖状态(抑制血糖值升高)有效的量的LSEL肽。具有增强胰岛素分泌功能的饲料的特征是，包含对增强糖尿病或前驱糖尿病动物的胰岛素分泌有效的量的LSEL肽。用于预防或治疗由高血糖所引起的疾病的饲料的特征是，包含对表现出抑制血糖值升高或增强胰岛素分泌的作用有效的量的LSEL肽。 
本发明的饲料组合物包括，利用LSEL肽，任选地与可在饲料中使用的载体和添加剂一起制备成片剂、丸剂、胶囊、颗粒、细粉、粉末、溶液等形式的那些。进一步地，该组合物包括含有肽LSEL的产品，其可以采取普通饲料的形式。当LSEL肽从动物、鱼类、贝虾类或植物中获得时，该LSEL肽并不总是需要纯化，只要所得到的肽具有血糖升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用即可。包含LSEL肽或其部分的蛋白溶解产物也可以用作本发明的饲料组合物的有效成分。 
有效成分(LSEL肽)在饲料组合物中的含有量，或者饲料组合物的摄入量没有限制，可根据饲料组合物的类型、摄取该饲料组合物的动物种类、期望的改善作用的程度和其他因素，在广泛的范围内加以适当地选择。虽然该饲料组合物的剂量可随着饲料组合物的类型变化，但是按照每次给体重10kg的动物施用的LSEL肽计，该剂量可以从约1mg/10kg体重至约100mg/10kg体重的范围内加以适当地选择。 
实施例
下面给出制备例和实验例从而更详细地说明本发明。然而，本发明的范围不受实验例限制。在以下实验例中，“％”表示“重量％”，除非另有说明。 
制备例1合成LSEL肽 
由氨基酸序列Leu-Ser-Glu-Leu(SEQ ID NO：1)组成的肽(LSEL肽)通过标准的液相法合成(更具体地，本发明人将肽的生产外包给Shanghai C-Strong Co.，Ltd.(中国，上海))。所得肽的氨基酸序列通过液相自动化埃德曼降解法分析(仪器：Applied Biosystems制造的Procise HT蛋白质测序系统)。结果证实，所得肽是由上面给出的氨基 酸序列组成的四肽。 
实验例1该LSEL肽的口服或皮下施用对葡萄糖负荷正常小鼠血糖值的作用 
将制备例1中制备的LSEL肽口服或皮下施用给葡萄糖负荷正常小鼠从而检验该肽对该小鼠血糖值的作用。在这个测试中，使用7周龄的雄性ICR小鼠(日本SLC)。 
首先，测量禁食过夜(约18小时)的小鼠的血糖值。基于所得血糖值，将小鼠分成6组：(3组为LSEL口服给药组；1组为LSEL皮下以给药组；1组为口服给药对照组；1组为皮下给药对照组)。表1显示LSEL肽的剂量、给药途径、以及LSEL口服给药组和LSEL皮下给药组中的小鼠数目。 
混合葡萄糖(2g/kg体重)和LSEL肽(10mg/kg体重、25mg/kg体重、或50mg/kg体重)并将其同时口服施用给LSEL口服给药组，在给药后的30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量它们的血糖值。在口服施用葡萄糖(2g/kg体重)之后立即将LSEL肽(25mg/kg体重)皮下施用给LSEL皮下给药组，在给药后的30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量它们的血糖值。混合葡萄糖(2g/kg体重)和蒸馏水并将其同时口服施用给口服给药对照组(n＝24)。在口服施用葡萄糖(2g/kg体重)之后立即将生理盐水皮下施用给皮下给药对照组(n＝11)，在给药后的30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量它们的血糖值。具体地，葡萄糖是以溶液形式使用的，通过将葡萄糖溶解在生理盐水中，并按10mL体积/kg体重施用该溶液(同样适用于下述实验)；血糖值通过紧凑型血糖测量装置“Caresist”(Roche制造)，利用从每只小鼠的尾部静脉采集的一滴血测定。 
图2示出LSEL口服给药组(LSEL肽的剂量：50mg/kg体重)和对照组的血糖值随时间的变化。图3示出LSEL皮下给药组(LSEL肽的剂量：25mg/kg体重)和对照组的血糖值随时间的变化。在每组中获得浓度与时间的曲线下0至2小时的面积(AUC0-2h)，并根据下面公式计算血糖AUC0-2h抑制率(％)。表1显示结果。 
[数学公式1] 
注意： 
对照组*：(口服给药组、皮下给药组) 
LSEL肽给药组*：LSEL肽给药组(口服给药组、皮下给药组) 
表1 
Figure RE-GSB00001111189400143
图2和表1明显表明，对葡萄糖负荷正常小鼠的LSEL肽口服给药，剂量依赖性地抑制血糖值的升高。特别地，以50mg/kg的量施用LSEL肽使浓度与时间的曲线下面积与对照组相比减小了13.2％(p＜0.1)。图3和表1明显地表明，对葡萄糖负荷正常小鼠的LSEL肽皮下给药(25mg/kg体重)，使浓度与时间的曲线下面积与对照组相比减小了23.2％(p＜0.05)。 
上面的结果明显表明，LSEL肽可以抑制血糖值升高，不论该肽是口服或皮下给药。 
实验例2LSEL肽口服给药对葡萄糖负荷的2型糖尿病KK-Ay-小鼠模型的血糖值的作用 
将制备例1中制备的LSEL肽口服施用给葡萄糖负荷的2型糖尿病KK-Ay-小鼠模型。在这个测试中，使用9周龄雄性的2型糖尿病KK-Ay-小鼠模型(CLEA Japan，Inc.)。 
更具体地，测量禁食过夜(约18小时)的小鼠的血糖值。基于所得血糖值，将小鼠分成4组：(3组为LSEL口服给药组，1组为对照组)。表2显示LSEL肽的剂量和每个LSEL口服给药组中小鼠的数目。混合葡 萄糖(2g/kg体重)和LSEL肽(25mg/kg体重、50mg/kg体重、或100mg/kg体重)并将其同时口服施用给LSEL口服给药组，在给药之后的30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量它们的血糖值。混合葡萄糖(2g/kg体重)和蒸馏水并同时将其口服施用给对照组(n＝11)，在给药之后的30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量它们的血糖值。具体地，葡萄糖是以溶液形式使用的，通过将葡萄糖溶解在生理盐水中，并按10mL体积/kg体重施用该溶液；血糖值通过“Caresist”(Roche制造)利用从每只小鼠的尾部静脉采集的一滴血测定。 
图4示出LSEL口服给药组(LSEL肽的剂量：100mg/kg体重)和对照组的血糖值随时间的变化。在每组中确定浓度与时间的曲线下0至2小时的面积(AUC0-2h)，并根据上面的数学公式1计算血糖AUC0-2h抑制率(％)。表2显示结果。 
表2 
Figure RE-GSB00001111189400151
图4和表2明显表明，对2型糖尿病小鼠模型的LSEL肽口服给药，剂量依赖性地抑制血糖值的升高。特别地，以100mg/kg的量施用LSEL肽使浓度与时间的曲线下面积与对照组相比减小了15.3％(p＜0.1)。 
实验例1和2的结果相结合明显表明，与对照组相比，LSEL肽可以显著地抑制葡萄糖负荷正常小鼠(ICR小鼠)和葡萄糖负荷的2型糖尿病小鼠模型(KK-Ay小鼠)的血糖值升高。 
实验例3LSEL肽口服给药对蔗糖负荷的ICR小鼠模型血糖值的作用 
将制备例1中制备的LSEL肽口服施用给蔗糖负荷正常小鼠从而检查LSEL肽对该小鼠血糖值的作用。在这个测试中，使用7周龄雄性ICR小鼠(日本SLC)。 
更具体地，测量禁食过夜约18小时的小鼠的血糖值。基于所得血糖值，将小鼠分成2组：(1组为LSEL口服给药组，1组为对照组)。表3显示LSEL肽的剂量和LSEL口服给药组中小鼠的数目。 
混合蔗糖(2g/kg体重)和LSEL肽(25mg/kg体重)并将其同时口服施用给LSEL口服给药组，在给药之后的30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量它们的血糖值。混合蔗糖(2g/kg体重)和蒸馏水并将其同时口服施用给对照组(n＝11)，在给药之后的30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量它们的血糖值。更具体地说，血糖值通过“Caresist”(Roche制造)利用从每只小鼠的尾部静脉采集的一滴血进行测量。 
图5示出LSEL口服给药组和对照组的血糖值随时间的变化。在每组中获得浓度与时间的曲线下0至2小时的面积(AUC0-2h)，并根据上面的数学公式1计算血糖AUC0-2h抑制率(％)。表3显示结果。 
表3
测试物质 剂量(mg/kg) 小鼠数目 血糖AUC0-2h抑制率(％)
LSEL 25 12 22.9  p＜0.05
图5和表3明显表明，对蔗糖负荷正常小鼠的LSEL肽口服给药，剂量依赖性地抑制血糖值的升高。特别地，以25mg/kg的量施用LSEL肽使浓度与时间的曲线下面积与对照组相比减小了22.9％(p＜0.05)。 
实验例1和3的结果相结合明显表明，LSEL肽的口服给药可以显著地抑制蔗糖负荷所引起的血糖值升高、以及葡萄糖负荷所引起的血糖值升高。 
实验例4LSEL肽口服给药对葡萄糖负荷ICR小鼠的血浆胰岛素浓度的作用 
将制备例1中制备的LSEL肽口服施用给葡萄糖负荷正常小鼠从而检查该肽对小鼠的血浆胰岛素浓度的作用。在这个测试中，使用7周龄雄性ICR小鼠(日本SLC)。 
更具体地，测量禁食过夜约18小时的小鼠的血糖值。基于所得血糖值，将小鼠分成2组：(1组为LSEL口服给药组，1组为对照组)。表4显示LSEL肽的剂量和LSEL口服给药组中小鼠的数目。 
混合葡萄糖(2g/kg体重)和LSEL肽(50mg/kg体重)并将其同时口服施用给LSEL口服给药组，在给药之后的15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量它们的血浆胰岛素浓度。混合葡萄糖(2g/kg体 重)和蒸馏水并将其同时口服施用给对照组(n＝6)，在给药之后的15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟测量它们的血浆胰岛素浓度。更具体地，血浆胰岛素浓度以下列方式测量。利用肝素从眼窝采集血液，并将其离心从而获得血浆。利用ELISA胰岛素试剂盒(“Rebis Insulin-Mouse-T”，Shibayagi Co.，Ltd.制造)测量血浆中的胰岛素浓度。 
图6示出LSEL口服给药组和对照组中的血浆胰岛素浓度随时间的变化。在LSEL口服给药组中获得浓度与时间的曲线下0至2小时的面积(AUC0-2h)，并根据下面公式计算胰岛素AUC0-2h的增加率(％)。表1显示结果。 
[数学公式2] 
Figure RE-GSB00001111189400171
表4显示结果。 
表4 
测试物质 剂量(mg/kg) 小鼠数目 胰岛素AUC0-2h的增加率(％)
LSEL 50 7 252.0  p＜0.05
图6和表4明显表明，以50mg/kg的量口服施用LSEL肽，使血浆胰岛素浓度与时间的曲线下0至2h的面积与对照组相比增加了252.0％(p＜0.05)。 
实验例1和4中的结果相结合表明，LSEL肽由于胰岛素分泌增强作用很有可能抑制血糖值升高。 
实验例5安全性 
即使制备例1中制备的LSEL肽以2g/kg体重的量口服施用给小鼠时，也没有表现出毒性。该结果表明，LSEL肽的LD50远远大于2g/kg体重。 
实施例1绿茶饮料 
将8克绿茶叶加入到300L热水(80℃)中，并在这个温度下提取4分钟。冷却所得提取液，然后离心。收集澄清的上清液作为绿茶提取液。向该提取液中加入0.4kg维生素C，然后加入50g制备例1中制备的 LSEL肽。加入热水使最终体积为1,000L。将所得混合物加热到85℃或更高，装入金属罐中并进行蒸煮灭菌(125℃，5分钟)，从而制得绿茶饮料。 
实施例2片剂 
捏合下面给出的成分，使其成粒，干燥并根据标准方法制成片剂，从而制得每片(200mg)包含5wt.％(10mg)量的LSEL肽的片剂。这些片剂用作具有LSEL肽的药理作用(血糖值升高抑制作用、胰岛素分泌增强作用、抗糖尿病作用)的药物制剂或补充剂。 
Figure RE-GSB00001111189400181
实施例3饲料 
将制备例1中制备的LSEL肽以0.1wt.％的量加入到包含维生素、矿物等的预混合物中。将该混合物以10wt.％的量加入到市售的狗食中，从而制得具有胰岛素分泌增强作用或血糖值升高抑制作用的狗食。 
工业实用性
根据本发明，可以提供药物组合物、食品组合物、或饲料组合物，其由于包含该肽(LSEL)作为有效成分而表现出血糖值升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用。这些组合物由于血糖升高抑制作用或胰岛素分泌增强作用，具有降低糖尿病或前驱糖尿病受验者(包括人和动物)的高血糖血糖值的作用。所以，本发明的组合物对预防或治疗由高血糖所引起的疾病有效，特别是糖尿病和糖尿病并发症。 
附图说明
图1是具有包含氨基酸序列(Leu-Ser-Glu-Leu)的多肽或蛋白质的动物、鱼类、贝虾类和植物的列表。 
图2示出在实验例1中口服施用LSEL时，葡萄糖负荷ICR小鼠的血 糖值的变化。 
图3示出在实验例1中皮下施用LSEL时，葡萄糖负荷ICR小鼠的血糖值的变化。 
图4示出在实验例2中口服施用LSEL时，葡萄糖负荷KK-Ay小鼠的血糖值的变化。 
图5示出在实验例3中口服施用LSEL时，蔗糖负荷ICR小鼠的血糖值的变化。 
图6示出在实验例4中口服施用LSEL时，蔗糖负荷ICR小鼠的血浆胰岛素浓度的变化。 
序列表独立文本
SEQ ID NO：1给出新型四肽的氨基酸序列。 
Figure IPA00001355015800011

Claims (7)

1.一种由以Leu-Ser-Glu-Leu表示的氨基酸序列组成的肽。
2.一种药物组合物或食品组合物，包括权利要求1所述的肽作为有效成分。
3.一种饲料组合物，包括权利要求1所述的肽作为有效成分。
4.一种权利要求1所述的肽在制备抑制血糖值升高的组合物中的用途。
5.一种权利要求1所述的肽在制备增强胰岛素分泌的组合物中的用途。
6.一种权利要求1所述的肽在制备预防或治疗2型糖尿病或其并发症的组合物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述并发症是选自糖尿病酸中毒、糖尿病性黄瘤、糖尿病性肌萎缩、糖尿病性酮症、糖尿病性昏迷、糖尿病性胃障碍、糖尿病性坏疽、糖尿病性溃疡、糖尿病性腹泻、糖尿病性微血管病变、糖尿病性子宫体硬化、糖尿病性心肌病、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性大疱症、糖尿病性白内障、糖尿病性皮肤病、糖尿病性硬肿症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性类脂质渐进性坏死、和糖尿病性血液循环障碍的至少一种疾病。
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