CN102188716A - 以氨基酸或寡肽为连接子的大分子-长春碱偶合物 - Google Patents

以氨基酸或寡肽为连接子的大分子-长春碱偶合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及以氨基酸或寡肽为连接子的大分子-长春碱偶合物。具体地，本发明涉及式I所示的偶合物或其药学可接受的盐：其为生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物，其中各符号如说明书所述。本发明还涉及所述偶合物或其药学可接受的盐的方法、包含它们的药物组合物、它们用于治疗和/或预防增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病的药物中的用途。本发明发现利用长春碱类药物C-4的羟基或C-4位去乙酰化衍生物的C-4的羟基作为交联基团，通过氨基酸或寡肽与大分子偶联，可以获得具有新颖特征的长春碱类药物的有效偶合物。

Description

以氨基酸或寡肽为连接子的大分子-长春碱偶合物
技术领域
本发明涉及生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，其中的长春碱类药物为长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾和长春氟宁。
背景技术
长春碱类药物是临床上最常用的抗肿瘤药物，包括长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindestine)、长春瑞宾(vinorelbine)和长春氟宁(vinflunine)。长春碱类药物的化学结构如下所示：
Figure GSA00000031037800011
Figure GSA00000031037800021
长春碱类抗肿瘤药物既能与微管蛋白结合，抑制微管蛋白双微体聚合成为微管；又可诱导微管的解聚，使纺锤体不能形成，使细胞停止于分裂中期，从而阻止癌细胞分裂繁殖。长春碱是长春碱类药物的代表，主要对淋巴瘤、绒毛膜上皮癌及睾丸肿瘤有效，对其它癌症如肺癌、乳腺癌、卵巢癌及单核细胞白血病也有效；长春新碱在临床上应用较广，为基本药品之一，对动物肿瘤的疗效超过了长春碱，与长春碱之间没有交叉耐药现象；长春地辛为半合成长春碱衍生物，对移植性动物肿瘤的瘤谱较广，强度为长春新碱的3倍，为长春碱的10倍；长春瑞宾是近年来开发上市的另一个半合成长春碱衍生物，适用于非小细胞肺癌、转移性乳腺癌及难治性淋巴瘤、卵巢癌、头颈部肿瘤；长春氟宁与长春瑞宾的区别在于在C-20’位上由两个氟原子取代两个氢原子。动物实验已经显示出对P338白血病B16恶性黑素瘤及对人体肺部和胸部肿瘤的抗肿瘤活性。
尽管长春碱类药物在临床得到广泛应用，但是作为细胞毒类的抗肿瘤药物，这些药物均具有骨髓抑制及胃肠道反应等副作用，不良反应大。
将抗肿瘤药物与多聚谷氨酸、聚乙二醇等大分子载体偶合，利用肿瘤血管组织对大分子偶合物的高渗透性，将药物选择性投放于肿瘤组织，能够提高抗肿瘤药物的靶向性，降低毒副作用；而且利用偶合物的缓释作用，延长药物的体内半衰期，可以提高疗效。
药物与大分子偶合物之间的连接子是影响偶合物疗效的重要因素，连接子的立体结构和电子效应不同，使得偶合物在体内水解或酶解释放游离药物的速率有所不同，从而影响偶合物在体内的半衰期，改变其药理和药效。理想的连接子必须在血液中保持稳定，而在靶组织中能够充分释放活性药物。
长春碱、长春新碱、长春瑞宾和长春氟宁分子中的游离羟基以及长春地辛分子中C-3位点的羟基位阻较大，不易参与偶联反应，形成的偶联产物也不易水解，释放活性药物。
将长春碱、长春新碱、长春瑞宾和长春氟宁分子中的C-4位的酯水解，得到C-4位去乙酰化的长春碱衍生物是长春碱类药物在人体内的主要活性代谢产物，如去乙酰长春碱的抗肿瘤活性为长春碱的5倍(STEPHEN FB，JOSEPH MP，PATRICIA KL，et al.Design and synthesis of a pro- drug ofvinblastine targeted at treatment of prostate cancer with enhanced efficacyand reduced syste
因此，本领域仍然需要有具有新颖特征的抗肿瘤药以供临床应用。
发明内容
本发明的目的是寻找具有新颖特征的抗肿瘤药特别是长春碱类药物。本发明令人惊奇地发现，利用长春碱、长春新碱、长春瑞宾和长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物及长春地辛分子中的C-4的羟基作为交联基团，通过氨基酸或寡肽与大分子偶联，可以获得具有新颖特征的长春碱类药物的有效偶合物。本发明基于以上发现而得以完成。
发明概述：
本发明第一方面提供式I所示的偶合物或其药学可接受的盐：
其为生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物，其中：
Vin代表以下式Vin-1、Vin-2、或Vin-3所示的长春碱类药物分子的长春碱环部分：
Figure GSA00000031037800041
P代表分子量为5000-200000的生物兼容性大分子；
R1代表CH3或CHO；
R2代表OCH3或NH2；
m代表1-5的整数；
n代表1-50的整数。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述的生物兼容性大分子选自聚乙二醇(在本文可缩写为PEG)、聚谷氨酸(在本文可缩写为PGA)、及其衍生物。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述生物兼容性大分子的分子量为5000-200000、或为5000-100000、或为5000-80000、或为5000-60000、或为5000-20000。在一个实施方案中，所述生物兼容性大分子的分子量为5000-200000、或为10000-200000、或为15000-200000、或为20000-150000、或为20000-100000、或为25000-80000、或为30000-60000。在一个实施方案中，所述生物兼容性大分子的分子量为5000-200000、或为5000-8000、或为8000-10000、或为10000-15000、或为15000-20000、或为20000-25000、或为25000-30000、或为30000-50000、或为50000-80000、或为80000-120000、或为120000-200000。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述的生物兼容性大分子是聚乙二醇，并且n为1。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述的生物兼容性大分子还可以是聚乙二醇的衍生物。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述的生物兼容性大分子还可以是下式P1所示的聚乙二醇衍生物，也就是说其在式I中可以以下面的P1基团部分体现：
P1＝-CH2CH2O-(CH2CH2O)x-CH3，
其中，x为110-4500的整数。在一个实施方案中，x为110-4000的整数、或为110-3500的整数、或为110-3000的整数、或为110-2500的整数、或为110-2000的整数、或为110-1500的整数、或为110-1000的整数、或为110-800的整数、或为110-500的整数。在一个实施方案中，x为120-4500的整数、或为150-4500的整数、或为200-4500的整数、或为250-4500的整数、或为300-4500的整数、或为350-4500的整数、或为500-4500的整数、或为800-4500的整数、或为1000-4500的整数、或为1200-4500的整数、或为1500-4500的整数、或为2000-4500的整数、或为2500-4500的整数、或为3000-4500的整数。在一个实施方案中，x为120-4200的整数、或为150-4000的整数、或为200-3500的整数、或为250-3000的整数、或为300-2500的整数、或为350-2000的整数、或为500-2000的整数、或为800-1500的整数。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述的生物兼容性大分子还可以是下式P2所示的聚乙二醇衍生物，也就是说其在式I中可以以下面的P2基团部分体现：
Figure GSA00000031037800051
其中，y为55-2250的整数。
在一个实施方案中，y为55-2200的整数、或为55-2000的整数、或为55-1800的整数、或为55-1500的整数、或为55-1200的整数、或为55-1000的整数、或为55-750的整数、或为55-500的整数、或为55-400的整数、或为55-300的整数、或为55-250的整数。在一个实施方案中，y为60-2250的整数、或为75-2250的整数、或为100-2250的整数、或为120-2250的整数、或为150-2250的整数、或为200-2250的整数、或为250-2250的整数、或为300-2250的整数、或为350-2250的整数、或为500-2250的整数、或为750-2250的整数、或为1000-2250的整数、或为1250-2250的整数、或为1500-2250的整数。在一个实施方案中，y为60-2200的整数、或为75-2000的整数、或为75-2000的整数、或为100-1800的整数、或为125-1500的整数、或为150-1250的整数、或为200-1000的整数、或为300-800的整数、或为400-800的整数。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述的生物兼容性大分子是聚谷氨酸，并且n为10-50的整数。在一个实施方案中，所述的生物兼容性大分子是聚谷氨酸，并且n为15-45的整数、或为20-40的整数、或为25-35的整数。在一个实施方案中，所述的生物兼容性大分子是聚谷氨酸，并且n为10-20的整数、或为20-30的整数、或为30-40的整数、或为40-50的整数。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述的m为1-5的整数、或为1-4的整数、或为1-3的整数、或为1或2。在一个实施方案中，所述的m为1、或2、或3、或4、或5。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述的Vin代表长春碱类药物分子的长春碱环部分。在一个实施方案中，所述的长春碱类药物选自：长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindestine)、长春瑞宾(vinorelbine)和长春氟宁(vinflunine)。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中式I中所示的长春碱类药物选自：长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindestine)、长春瑞宾(vinorelbine)、和长春氟宁(vinflunine)。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中用于连接长春碱类药物与生物兼容性大分子的氨基酸选自：甘氨酸、(L)-丙氨酸、(L)-亮氨酸、(L)-异亮氨酸、(L)-缬氨酸、(L)-脯氨酸、(L)-苯丙氨酸、(L)-甲硫氨酸、或(L)-谷氨酰胺。
根据本发明第一方面任一项的偶合物或其药学可接受的盐，其中用于连接长春碱类药物与生物兼容性大分子的寡肽由选自以下的氨基酸组成：甘氨酸、(L)-丙氨酸、(L)-亮氨酸、(L)-异亮氨酸、(L)-缬氨酸、(L)-脯氨酸、(L)-苯丙氨酸、(L)-甲硫氨酸、或(L)-谷氨酰胺。
本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一项所述偶合物或其药学可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
i)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁在卤化氢(例如氯化氢，例如饱和氯化氢)的溶液(例如非水溶液，例如在甲醇中的溶液，例如在无水甲醇中的溶液)中醇解，脱去C-4位乙酰基，得到去乙酰化衍生物衍生物；
ii)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物或者长春地辛分子中的C-4的羟基通过氨基酸与聚谷氨酸偶联；[在步骤ii]的一个实施方案中，其是通过使N-苄氧羰基氨基酸在氯甲酸异丁酯的作用下，与长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物或长春地辛分子中的C-4的羟基缩合，得到4-O-(N-苄氧羰基氨基酰)-长春碱衍生物，再催化氢化脱保护得到4-氨基酰长春碱衍生物，后者在DCC作用下与聚谷氨酸偶联，得到偶合物]
iii)以及任选的使以上所得偶合物形成药学可接受的盐。
或者，本发明第二方面还提供了制备本发明第一方面任一项所述偶合物或其药学可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
i)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁在卤化氢(例如氯化氢，例如饱和氯化氢)的溶液(例如非水溶液，例如在甲醇中的溶液，例如在无水甲醇中的溶液)中醇解，脱去C-4位乙酰基，得到去乙酰化衍生物衍生物；
ii)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物或者长春地辛分子中的C-4的羟基通过二肽与聚谷氨酸偶联；
iii)以及任选的使以上所得偶合物形成药学可接受的盐。
或者，本发明第二方面还提供了制备本发明第一方面任一项所述偶合物或其药学可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
i)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁在卤化氢(例如氯化氢，例如饱和氯化氢)的溶液(例如非水溶液，例如在甲醇中的溶液，例如在无水甲醇中的溶液)中醇解，脱去C-4位乙酰基，得到去乙酰化衍生物衍生物；
ii)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物或者长春地辛分子中的C-4的羟基通过寡肽与聚谷氨酸偶联；
iii)以及任选的使以上所得偶合物形成药学可接受的盐。
或者，本发明第二方面还提供了制备本发明第一方面任一项所述偶合物或其药学可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
i)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁在卤化氢(例如氯化氢，例如饱和氯化氢)的溶液(例如非水溶液，例如在甲醇中的溶液，例如在无水甲醇中的溶液)中醇解，脱去C-4位乙酰基，得到去乙酰化衍生物衍生物；
ii)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物或者长春地辛分子中的C-4的羟基与氨基酸或寡肽连接，形成长春碱类氨基酸或寡肽衍生物；
iii)使单甲氧基聚乙二醇羧乙基衍生物与N-羟基琥珀酰亚胺形成酯(mPEG-OCH2CH2COO-NS)，然后使该酯与长春碱类氨基酸或寡肽衍生物分子中的氨基反应，得到长春碱类衍生物通过氨基酸或寡肽与聚谷氨酸或聚乙二醇偶联的偶合物；
iv)以及任选的使以上所得偶合物形成药学可接受的盐。
或者，本发明第二方面还提供了制备本发明第一方面任一项所述偶合物或其药学可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
i)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁在卤化氢(例如氯化氢，例如饱和氯化氢)的溶液(例如非水溶液，例如在甲醇中的溶液，例如在无水甲醇中的溶液)中醇解，脱去C-4位乙酰基，得到去乙酰化衍生物衍生物；
ii)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物或者长春地辛分子中的C-4的羟基与氨基酸或寡肽连接，形成长春碱类氨基酸或寡肽衍生物；
iii)使二叉甲氧基聚乙二醇赖氨酸衍生物与N-羟基琥珀酰亚胺形成酯((mPEG)2-Lys-NS)，然后使该酯与长春碱类氨基酸或寡肽衍生物分子中的氨基反应，得到长春碱类衍生物通过氨基酸或寡肽与聚谷氨酸或聚乙二醇偶联的偶合物；
iv)以及任选的使以上所得偶合物形成药学可接受的盐。
本发明第三方面提供了一种药物组合物，其包含治疗和/或预防有效量的本发明第一方面任一项所述的偶合物或其药学可接受的盐，以及任选的一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。
本发明第四方面提供了本发明第一方面任一项所述的偶合物或其药学可接受的盐或者本发明第三方面任一项所述药物组合物在制备用于治疗和/或预防增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病的药物中的用途。根据本发明第四方面的用途，其中所述的增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病是可以用长春碱类药物治疗和/或预防的疾病。
本发明第五方面提供了一种在有需要的哺乳动物中治疗和/或预防增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗和/或预防有效量的本发明第一方面任一项所述的偶合物或其药学可接受的盐或者本发明第三方面任一项所述药物组合物。根据本发明第五方面的方法，其中所述的增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病是可以用长春碱类药物治疗和/或预防的疾病。
发明详述：
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
如本文所述的，术语“生物兼容性大分子”是指与动物(例如哺乳动物，例如猪、狗、猴、人，例如人)接触或者施用到该动物体内而不会产生不能接受的毒性或副作用的大分子物质，或者在具有合理的医学治疗的利益/风险比的情况下，该大分子物质产生的毒性或副作用小到足以让人们(例如医生或患者)接受的程度。在本文中，术语“生物兼容性大分子”亦具有本领域技术人员通常理解的“生物相容性大分子”。在本文中，术语“大分子”亦具有本领域技术人员通常理解的“聚合物分子”。如本文所述的，术语“增殖性疾病”是指与细胞异常增长相关的疾病。
根据本发明，提供式I所代表的生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，其中用于连接长春碱类药物与大分子的氨基酸为甘氨酸、(L)-丙氨酸、(L)-亮氨酸、(L)-异亮氨酸、(L)-缬氨酸、(L)-脯氨酸、(L)-苯丙氨酸、(L)-甲硫氨酸或(L)-谷氨酰胺；用于连接长春碱类药物与大分子的寡肽由甘氨酸、(L)-丙氨酸、(L)-亮氨酸、(L)-异亮氨酸、(L)-缬氨酸、(L)-脯氨酸、(L)-苯丙氨酸、(L)-甲硫氨酸或(L)-谷氨酰胺或组成。
优选地，本发明提供式I所代表的生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，其中大分子的分子量为25000-80000。
优选地，本发明提供式I所代表的生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，其中大分子为聚谷氨酸，n为20-40。
优选地，本发明提供式I所代表的生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，其中大分子为聚乙二醇衍生物。
优选地，本发明提供式I所代表的生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，其中大分子为聚乙二醇衍生物，其在式I中可以以下面的P1基团部分体现：
P1＝-CH2CH2O-(CH2CH2O)x-CH3，
其中x为110-4500的整数。
优选地，本发明提供式I所代表的生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，其中大分子还可以为聚乙二醇衍生物，其在式I中可以以下面的P2基团部分体现：
Figure GSA00000031037800101
其中y为55-2250的整数。
本发明还提供含有式I所代表的生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物。
本发明最后还提供式I所代表的生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐，以及包含式I所代表的生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物及其非毒性药学上可接受的盐作为活性成分的药物组合物作为抗肿瘤药物的用途。
本发明偶合物及其非毒性药学上可接受的盐可以按以下一些更具体的方案进行制备。
长春碱、长春新碱、长春瑞宾和长春氟宁在在饱和氯化氢无水甲醇溶液中醇解，脱去C-4位乙酰基，得到去乙酰化衍生物衍生物：
其中，Vin代表Vin-1、Vin-2及Vin-3所示的长春碱环。
长春碱、长春新碱、长春瑞宾和长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物及长春地辛分子中的C-4的羟基通过氨基酸与聚谷氨酸偶联的偶合物的制备方法如下：
Figure GSA00000031037800111
N-苄氧羰基氨基酸在氯甲酸异丁酯的作用下与长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物或长春地辛分子中的C-4的羟基缩合，将反应产物以硅胶柱层析分离得到4-O-(N-苄氧羰基氨基酰)-长春碱衍生物，催化氢化脱保护得到4-氨基酰长春碱衍生物，后者在DCC作用下与聚谷氨酸偶联，得到目标化合物。
反应式中，Vin代表Vin-1、Vin-2及Vin-3所示的长春碱环，R1代表CH3或CHO，R2代表OCH3或NH2；R3为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基等氨基酸侧链，n＝10-50。
类似地，可以制备长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物或长春地辛分子中的C-4的羟基通过二肽与聚谷氨酸偶联的偶合物：
Figure GSA00000031037800112
Figure GSA00000031037800121
反应式中，Vin代表Vin-1、Vin-2及Vin-3所示的长春碱环，R1代表CH3或CHO，R2代表OCH3或NH2；R3为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基等氨基酸侧链，n＝10-50。
同样地，可以制备长春碱、长春新碱、长春瑞宾和长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物及长春地辛分子中的C-4的羟基通过寡肽与聚谷氨酸偶联的偶合物。
Figure GSA00000031037800122
反应式中，Vin代表Vin-1、Vin-2及Vin-3所示的长春碱环，R1代表CH3或CHO，R2代表OCH3或NH2；R3为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基等氨基酸侧链，m代表1-5的整数，n＝10-50。
单甲氧基聚乙二醇羧乙基衍生物与N-羟基琥珀酰亚胺形成的活泼酯(mPEG-OCH2CH2COO-NS)与长春碱类氨基酸或寡肽衍生物分子中的氨基反应可以制得长春碱类衍生物通过寡肽与聚谷氨酸与聚乙二醇偶联的偶合物：
Figure GSA00000031037800131
反应式中，Vin代表Vin-1、Vin-2及Vin-3所示的长春碱环，R1代表CH3或CHO，R2代表OCH3或NH2；R3为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基等氨基酸侧链，m代表1-5的整数，X＝110-4500。
类似地，二叉甲氧基聚乙二醇赖氨酸衍生物与N-羟基琥珀酰亚胺形成的活泼酯((mPEG)2-Lys-NS)与长春碱类氨基酸或寡肽衍生物分子中的氨基反应可以制得长春碱类衍生物通过寡肽与聚谷氨酸与聚乙二醇偶联的偶合物：
Figure GSA00000031037800132
反应式中，Vin代表Vin-1、Vin-2及Vin-3所示的长春碱环，R1代表CH3或CHO，R2代表OCH3或NH2；R3为氢、甲基、异丙基、异丁基、2-甲基丙基或苯甲基等氨基酸侧链，m代表1-5的整数，Y＝550-2250。
可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
当用于上述治疗和/或预防或其他治疗和/或预防时，治疗和/或预防有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。词语“治疗和/或预防有效量”的本发明化合物指以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。但应认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明式I化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001～1000mg/kg体重/天，例如介于0.01～100mg/kg体重/天，例如介于0.01～10mg/kg体重/天。另外，根据本发明，本发明式I化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以可以参考其母体药物长春碱类药物的现有临床应用剂量来确定。
本发明化合物或其药学上可接受的盐可以单独或以药物组合物的形式给药。本发明药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂形式取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。
因此，运用本领域技术人员熟悉的药物载体可以制备成含有效剂量的本发明化合物的药物组合物。因此本发明还提供包含与一种或多种无毒药物可接受载体配制在一起的本发明化合物的药物组合物。所述药物组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服给药、供胃肠外注射或供直肠给药。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
实施例1 单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱]-偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-des-vinblastine，I1)的制备
1.1 4-去乙酰长春碱(des-vinblastine)的合成
将875ml无水甲醇盛放于3000ml三口瓶中，冰盐浴，通入干燥氯化氢气体，连续通4h，制备饱和氯化氢甲醇溶液(0℃)。加入8g长春碱硫酸盐，继续通入氯化氢气体，低温反应，反应液先变浑浊后澄清，TLC检测反应进行程度(展开剂DCM∶CH3OH＝15∶1，Rf＝0.45)，反应进行72h，停止反应。减压浓缩去溶剂，剩余粘稠固体，溶于水，加入碎冰，然后用氨水调节pH，直至不再有沉淀生成为止。DCM萃取两到三次，合并有机相，用无水硫酸钠固体干燥。过滤，减压浓缩去溶剂，硅胶柱层析分离(硅胶300-400目，洗脱剂为EtOAc∶CH3OH＝16∶1，加入1％TEA)，得到米色固体7.46g。1H-NMRδ(ppm，CDCl3，400MHz)：9.56(br s，1H)，8.03(s，1H)，7.54(d，1H)，7.15(m，3H)，6.62(s，1H)，6.10(s，1H)，5.84(q，1H)，5.77(d，1H)，4.07(s，1H)，3.85(s，3H)，3.79(s，3H)，3.70(s，1H)，3.60(s，3H)，3.15(d，2H)，2.75(s，3H)，2.63(s，1H)，1.35(qq，4H)，0.95(tt，6H)。ESI-MS：m/z 769.8[M+H]+，791.8[M+Na]+。
1.2 4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱(NH2-Leu-CO-des-vinblastine)的合成
将N-苄氧羰基-亮氨酸(0.8620g，3.25mmol)加入到50ml三口瓶中，加入干燥THF10ml，磁力搅拌溶解，N2保护，低温浴-13℃～-15℃，加入N-甲基吗啡啉(359μl，3.25mmol)，氯甲酸异丁酯(421μl，3.25mmol)(有固体析出)，低温反应40min，加入4-去乙酰长春碱(0.5000g，0.65mmol)，低温反应2h，逐渐升至室温后，继续反应12h，抽滤除去白色固体，滤液减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3CH2OH＝5∶1)，收集产物得到白色固体4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰)-去乙酰长春碱0.50g。1HNMRδ(CDCl3，400MHz)：9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，8H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，5.11(m，3H)，4.42(m，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(s，3H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H)。ESI-MS：m/z 1017.0[M+H]+。
将4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰基)-去乙酰长春碱(0.50g，0.49mmol)加入到50ml单口瓶中，溶于6ml无水乙醇，通入H2，加入1.38g Pd/C(10％，含水64.7％)，室温反应12h，滤除钯碳，减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3OH＝8∶1，加入1％TEA)，收集产物得到白色固体4-O-(亮氨酰)-去乙酰长春碱0.30g。1HNMR(CDCl3，400MHz)9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，3H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，4.42(m，1H)，3.95(q，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(m，4H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H).ESI-MS：m/z 883.1[M+H]+。
1.3 单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-des-vinblastine，I1)的合成
将0.1g(0.01mmol)分子量为10KD的单甲氧基聚乙二醇活泼酯mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入4-O-(亮氨酰)-去乙酰长春碱(26.5mg，0.03mmol)，DMF2-3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml左右，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体95mg。1HNMRδ(ppm CDCl3，400MHz)：8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，1H)，3.74(m，1.52kH)，3.3(s，3H)，3.2(m，4H)，3.10(m，1H)，2.84(d，2H)，2.70(s，3H)，2.50(m，6H)，2.40(m，1H)，2.13(m，1H)，1.68(m，1H)，1.45(m，5H)，1.25(m，4H)，0.95(m，11H)，0.77(m，3H)。
实施例2 单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春新碱]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-des-vincristine，I2)的制备
2.1 4-去乙酰长春新碱(des-vincristine)的合成
将875ml无水甲醇盛放于3000ml三口瓶中，冰盐浴，通入干燥氯化氢气体，连续通4h，制备饱和氯化氢甲醇溶液(0℃)。加入8g长春新碱，继续通入氯化氢气体，低温反应，反应液先变浑浊后澄清，TLC检测反应进行程度(展开剂DCM∶CH3OH＝15∶1，Rf＝0.45)，反应进行72h，停止反应。减压浓缩去溶剂，剩余粘稠固体，溶于水，加入碎冰，然后用氨水调节pH，直至不再有沉淀生成为止。DCM萃取两到三次，合并有机相，用无水硫酸钠固体干燥。过滤，减压浓缩去溶剂，硅胶柱层析分离(硅胶300-400目，洗脱剂为EtOAc∶CH3OH＝16∶1，加入1％TEA)，得到米色固体7.46g。1H-NMRδ(ppm，CDCl3，400MHz)：9.56(br s，1H)，8.03(s，1H)，7.95(s，1H)，7.54(d，1H)，7.15(m，3H)，6.62(s，1H)，6.10(s，1H)，5.84(q，1H)，5.77(d，1H)，4.10(s，1H)，3.85(s，3H)，3.79(s，3H)，3.70(s，1H)，3.60(s，3H)，3.15(d，2H)，2.63(s，1H)，1.35(qq，4H)，0.95(tt，6H)。ESI-MS：m/z 783.7[M+H]+，805.9[M+Na]+。
2.2 4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春新碱(NH2-Leu-CO-des-vincristine)的合成
将N-苄氧羰基-亮氨酸(0.8620g，3.25mmol)加入到50ml三口瓶中，加入干燥THF10ml，磁力搅拌溶解，N2保护，低温浴-13℃～-15℃，加入N-甲基吗啡啉(359μl，3.25mmol)，氯甲酸异丁酯(421μl，3.25mmol)(有固体析出)，低温反应40min，加入4-去乙酰长春新碱(0.5000g，0.64mmol)，低温反应2h，逐渐升至室温后，继续反应12h，抽滤除去白色固体，滤液减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3CH2OH＝5∶1)，收集产物得到白色固体4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰基)-去乙酰长春新碱0.52g。1HNMRδ(CDCl3，400MHz)：9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.95(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，8H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，5.11(m，3H)，4.42(m，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(s，3H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H)。ESI-MS：m/z 1031.2[M+H]+。
将4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰基)-去乙酰长春新碱(0.50g，0.49mmol)加入到50ml单口瓶中，溶于6ml无水乙醇，通入H2，加入1.38g Pd/C(10％，含水64.7％)，室温反应12h，滤除钯碳，减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3OH＝8∶1，加入1％TEA)，收集产物得到白色固体4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春新碱0.35g。1HNMR(CDCl3，400MHz)9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.95(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，3H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，4.42(m，1H)，3.95(q，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(m，4H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H).ESI-MS：m/z 897.2[M+H]+。
2.3单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春新碱]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-des-vincristine，I2)的合成
将0.1g(0.01mmol)mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春新碱(26.9mg，0.03mmol)，DMF2-3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml左右，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体95mg。1HNMRδ(ppmCDCl3，400MHz)：8.04(s，1H)，7.95(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，1H)，3.74(m，1.52kH)，3.3(s，3H)，3.2(m，4H)，3.10(m，1H)，2.84(d，2H)，2.50(m，6H)，2.40(m，1H)，2.13(m，1H)，1.68(m，1H)，1.45(m，5H)，1.25(m，4H)，0.95(m，11H)，0.77(m，3H)。
实施例3单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春瑞宾]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-des-vinorelbine，I3)的制备
3.1 4-去乙酰长春瑞宾(des-vinorelbine)的合成
将875ml无水甲醇盛放于3000ml三口瓶中，冰盐浴，通入干燥氯化氢气体，连续通4h，制备饱和氯化氢甲醇溶液(0℃)。加入8g长春瑞宾，继续通入氯化氢气体，低温反应，反应液先变浑浊后澄清，TLC检测反应进行程度(展开剂DCM∶CH3OH＝15∶1，Rf＝0.45)，反应进行72h，停止反应。减压浓缩去溶剂，剩余粘稠固体，溶于水，加入碎冰，然后用氨水调节pH，直至不再有沉淀生成为止。DCM萃取两到三次，合并有机相，用无水硫酸钠固体干燥。过滤，减压浓缩去溶剂，硅胶柱层析分离(硅胶300-400目，洗脱剂为EtOAc∶CH3OH＝16∶1，加入1％TEA)，得到米色固体7.46g。1H-NMRδ(ppm，CDCl3，400MHz)：9.56(br s，1H)，8.03(s，1H)，7.54(d，1H)，7.15(m，3H)，6.62(s，1H)，6.10(s，1H)，5.84(q，1H)，5.80(s，1H)，5.77(d，1H)，4.07(s，1H)，3.85(s，3H)，3.79(s，3H)，3.70(s，1H)，3.60(s，3H)，3.15(d，2H)，2.75(s，3H)，2.63(s，1H)，1.35(qq，4H)，0.95(tt，6H)。ESI-MS：m/z 737.7[M+H]+，759.8[M+Na]+。
3.2 4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春瑞宾(NH2-Leu-CO-des-vinorelbine)的合成
将N-苄氧羰基-亮氨酸(0.8620g，3.25mmol)加入到50ml三口瓶中，加入干燥THF10ml，磁力搅拌溶解，N2保护，低温浴-13℃～-15℃，加入N-甲基吗啡啉(359μl，3.25mmol)，氯甲酸异丁酯(421μl，3.25mmol)(有固体析出)，低温反应40min，加入4-去乙酰长春瑞宾(0.5000g，0.68mmol)，低温反应2h，逐渐升至室温后，继续反应12h，抽滤除去白色固体，滤液减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3CH2OH＝5∶1)，收集产物得到白色固体4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰基)-去乙酰长春瑞宾0.50g。1HNMRδ(CDCl3，400MHz)：9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，8H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，5.11(m，3H)，4.42(m，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(s，3H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H)。ESI-MS：m/z 985.1[M+H]+。
将4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰基)-去乙酰长春瑞宾(0.50g，0.49mmol)加入到50ml单口瓶中，溶于6ml无水乙醇，通入H2，加入1.38g Pd/C(10％，含水64.7％)，室温反应12h，滤除钯碳，减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3OH＝8∶1，加入1％TEA)，收集产物得到白色固体4-O-(亮氨酰)-去乙酰长春瑞宾0.30g。1HNMR(CDCl3，400MHz)9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，3H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，4.42(m，1H)，3.95(q，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(m，4H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H).ESI-MS：m/z 851.2[M+H]+。
3.3单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春瑞宾]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-des-vinorelbine，I3)的合成
将0.1g(0.01mmol)mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春瑞宾(26.5mg，0.03mmol)，DMF2-3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml左右，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体95mg。1HNMRδ(ppmCDCl3，400MHz)：8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.76(s，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，1H)，3.74(m，1.52kH)，3.3(s，3H)，3.2(m，4H)，3.10(m，1H)，2.84(d，2H)，2.70(s，3H)，2.50(m，6H)，2.40(m，1H)，2.13(m，1H)，1.68(m，1H)，1.45(m，5H)，1.25(m，4H)，0.95(m，11H)，0.77(m，3H)。
实施例4单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春氟宁]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-des-vinflunine，I4)的制备
4.1 4-去乙酰长春氟宁(des-vinflunine)的合成
将875ml无水甲醇盛放于3000ml三口瓶中，冰盐浴，通入干燥氯化氢气体，连续通4h，制备饱和氯化氢甲醇溶液(0℃)。加入8g长春氟宁，继续通入氯化氢气体，低温反应，反应液先变浑浊后澄清，TLC检测反应进行程度(展开剂DCM∶CH3OH＝15∶1，Rf＝0.45)，反应进行72h，停止反应。减压浓缩去溶剂，剩余粘稠固体，溶于水，加入碎冰，然后用氨水调节pH，直至不再有沉淀生成为止。DCM萃取两到三次，合并有机相，用无水硫酸钠固体干燥。过滤，减压浓缩去溶剂，硅胶柱层析分离(硅胶300-400目，洗脱剂为EtOAc∶CH3OH＝16∶1，加入1％TEA)，得到米色固体7.5g。1H-NMRδ(ppm，CDCl3，400MHz)：9.56(br s，1H)，8.03(s，1H)，7.54(d，1H)，7.15(m，3H)，6.62(s，1H)，6.10(s，1H)，5.98(s，1H)，5.84(q，1H)，5.77(d，1H)，4.07(s，1H)，3.85(s，3H)，3.79(s，3H)，3.70(s，1H)，3.60(s，3H)，3.15(d，2H)，2.75(s，3H)，2.63(s，1H)，1.35(qq，4H)，0.95(tt，6H)。ESI-MS：m/z 773.8[M+H]+，795.7[M+Na]+。
4.2 4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春氟宁(NH2-Leu-CO-des-vinflunine)的合成
将N-苄氧羰基-亮氨酸(0.8620g，3.25mmol)加入到50ml三口瓶中，加入干燥THF10ml，磁力搅拌溶解，N2保护，低温浴-13℃～-15℃，加入N-甲基吗啡啉(359μl，3.25mmol)，氯甲酸异丁酯(421μl，3.25mmol)(有固体析出)，低温反应40min，加入4-去乙酰长春氟宁(0.5000g，0.65mmol)，低温反应2h，逐渐升至室温后，继续反应12h，抽滤除去白色固体，滤液减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3CH2OH＝5∶1)，收集产物得到白色固体4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰基)-去乙酰长春氟宁0.52g。1HNMRδ(CDCl3，400MHz)：9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，8H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.98(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，5.11(m，3H)，4.42(m，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(s，3H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H)。ESI-MS：m/z 1021.2[M+H]+。
将4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰基)-去乙酰长春氟宁(0.50g，0.49mmol)加入到50ml单口瓶中，溶于6ml无水乙醇，通入H2，加入1.38g Pd/C(10％，含水64.7％)，室温反应12h，滤除钯碳，减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3OH＝8∶1，加入1％TEA)，收集产物得到白色固体4-O-(亮氨酰)-去乙酰长春氟宁0.33g。1HNMR(CDCl3，400MHz)9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，3H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.98(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，4.42(m，1H)，3.95(q，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(m，4H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H).ESI-MS：m/z 887.1[M+H]+。
4.3单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春氟宁]偶合物(I4)的合成
将0.1g(0.01mmol)mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱(26.5mg，0.03mmol)，DMF2-3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml左右，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体95mg。1HNMRδ(ppmCDCl3，400MHz)：8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.98(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，1H)，3.74(m，1.52kH)，3.3(s，3H)，3.2(m，4H)，3.10(m，1H)，2.84(d，2H)，2.70(s，3H)，2.50(m，6H)，2.40(m，1H)，2.13(m，1H)，1.68(m，1H)，1.45(m，5H)，1.25(m，4H)，0.95(m，11H)，0.77(m，3H)。
实施例5单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-长春地辛]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-vindestine，I5)的制备
5.1 4-O-(亮氨酰基)-长春地辛(NH2-Leu-CO-vindestine)的合成
将N-苄氧羰基-亮氨酸(0.8620g，3.25mmol)加入到50ml三口瓶中，加入干燥THF10ml，磁力搅拌溶解，N2保护，低温浴-13℃～-15℃，加入N-甲基吗啡啉(359μl，3.25mmol)，氯甲酸异丁酯(421μl，3.25mmol)(有固体析出)，低温反应40min，加入长春地辛(0.5000g，0.65mmol)，低温反应2h，逐渐升至室温后，继续反应12h，抽滤除去白色固体，滤液减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3CH2OH＝5∶1)，收集产物得到白色固体4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰)-长春地辛0.53g。1HNMRδ(CDCl3，400MHz)：9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，8H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.97(s，2H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，5.11(m，3H)，4.42(m，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(s，3H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H)。ESI-MS：m/z 1002.0[M+H]+。
将4-O-(N-苄氧羰基亮氨酰基)-长春地辛(0.50g，0.50mmol)加入到50ml单口瓶中，溶于6ml无水乙醇，通入H2，加入1.38g Pd/C(10％，含水64.7％)，室温反应12h，滤除钯碳，减压浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱剂EtOAc∶CH3OH＝8∶1，加入1％TEA)，收集产物得到白色固体4-O-(亮氨酰基)-长春地辛0.35g。1HNMR(CDCl3，400MHz)9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，3H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.97(s，2H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，4.42(m，1H)，3.95(q，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(m，4H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H).ESI-MS：m/z868.1[M+H]+。
5.2单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基)-长春地辛]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-vindestine，I5)的合成
将0.1g(0.01mmol)mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入4-O-(亮氨酰基)-长春地辛(21.5mg，0.03mmol)，DMF2-3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml左右，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体95mg。1HNMRδ(ppmCDCl3，400MHz)：8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.97(s，2H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，1H)，3.74(m，1.52kH)，3.3(s，3H)，3.2(m，4H)，3.10(m，1H)，2.84(d，2H)，2.70(s，3H)，2.50(m，6H)，2.40(m，1H)，2.13(m，1H)，1.68(m，1H)，1.45(m，5H)，1.25(m，4H)，0.95(m，11H)，0.77(m，3H)。
实施例6单甲氧基聚乙二醇20kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物(m-PEG20kD-OCH2CH2CONH-Leu-CO-des-vinblastine，I6)的制备
参考实施例1.3的方法，用分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇活泼酯mPEG20KD-OCH2CH2COO-NS代替mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS，与4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱反应，制得I6。
实施例7二叉单甲氧基聚乙二醇40kD-[4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物((m-PEG)2，40KD-Lys-CONH-Leu-CO-des-vinblastine，I7)的制备
参考实施例1.3的方法，用分子量为40KD的二叉单甲氧基聚乙二醇活泼酯(mPEG)2，40KD-Lys-NS代替mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS，与4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱反应，制得I7。
实施例8单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(丙氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Ala-CO-des-vinblastine，I8)的制备
参考实施例1.2的方法，用N-苄氧羰基-(L)-丙氨酸代替N-苄氧羰基(L)-亮氨酸，与4-去乙酰长春碱反应得到4-O-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-去乙酰长春碱，催化氢化后制得4-O-(L-丙氨酰)-去乙酰长春碱。
参考实施例1.3的方法，用4-O-(丙氨酰基)-去乙酰长春碱代替4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱，与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应，制得I8。
实施例9二叉单甲氧基聚乙二醇40kD-[4-O-(丙氨酰基)-长春碱]偶合物((m-PEG)2，40KD-Lys-CONH-Ala-CO-des-vinblastine，I9)的制备
参考实施例7的方法，用4-O-(丙氨酰基)-去乙酰长春碱代替4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱，与(mPEG)2，40KD-Lys-NS反应，制得I9。
实施例10二叉单甲氧基聚乙二醇40kD-[4-O-(丙氨酰基)-去乙酰长春新碱]偶合物((m-PEG)2，40KD-Lys-CONH-Ala-CO-des-vincristine，I10)的制备
参考实施例2.2的方法，用N-苄氧羰基-(L)-丙氨酸代替N-苄氧羰基(L)-亮氨酸，与4-去乙酰长春新碱反应得到4-O-(N-苄氧羰基-L-丙氨酰)-去乙酰长春新碱，催化氢化后制得4-O-(L-丙氨酰)-去乙酰长春新碱。
参考实施例2.3的方法，用4-O-(丙氨酰基)-去乙酰长春新碱代替4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱，与(mPEG)2，40KD-Lys-NS反应，制得I10。
实施例11单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Ala-Ala-CO-des-vinblastine，I11)的制备
11.1 4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱(NH2-Ala-Ala-CO-des-vinblastine)的合成
将N-叔丁氧羰基-丙氨酸(33.8mg，0.179mmol)与4-O-(丙氨酰基)-去乙酰长春碱(50mg，0.060mmol)加入到10ml圆底瓶中，加入干燥DCM2ml，冰浴，磁力搅拌，加入HOBt(36.5mg，0.27mmol)，DCC(61.0mg，0.30mmol)，投料完毕。低温反应2小时，室温反应10h，停止反应，饱和NaHCO3洗2次，饱和NaCl洗1次，有机相用无水硫酸钠干燥，大板分离(展开剂DCM∶CH3OH＝15∶1)，得到产物4-O-(N-叔丁氧羰基-丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱50mg。1HNMRδ(ppm，CDCl3，400MHz)：8.03(s，1H)，7.51(d，1H)，7.35(m，4H)，6.75(s，1H)，5.99(m，1H)，5.55(s，1H)，5.15(d，1H)，4.27(m，1H)，3.79(m，2H)，3.58(m，1H)，3.34(m，3H)，3.10(m，14H)，3.09(s，2H)，2.86(m，10H)，2.01(s，3H)，1.44(m，27H)，1.11(t，3H).ESI-MS：m/z 1011.8[M+H]+，1009.2[M-H]-.
将4-O-(N-叔丁氧羰基-丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱50mg溶于无水DCM2ml，加入TFA4ml，低温反应(-10～-15℃)2h，室温反应6h，停止反应，减压浓缩，加入乙醚析出固体，过滤，固体用NaHCO3溶解，DCM萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，干燥得到固体35mg。ESI-MS：m/z 911.6[M+H]+，909.2[M-H]-。
11.2单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Ala-Ala-CO-des-vinblastine，I11)的制备
参考实施例1.3的方法，用4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱代替4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱，与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应，制得I11。
实施例12单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春氟宁]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Ala-Ala-CO-des-vinflunine，I12)的制备
12.1 4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春氟宁(NH2-Ala-Ala-CO-des-vinflunine)的合成
参考实施例11.1方法，用4-O-(丙氨酰基)-去乙酰长春氟宁代替4-O-(丙氨酰基)-去乙酰长春碱与N-叔丁氧羰基-丙氨酸在二环己基碳二亚胺作用下生成4-O-(N-叔丁氧羰基-丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春氟宁，然后在三氟醋酸的作用下脱除保护基，生成4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春氟宁。
12.2单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春氟宁(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Ala-Ala-CO-des-vinflunine，I12)的合成
参考实施例11.2方法，用4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春氟宁代替4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱，与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应，制得I12。
实施例13二叉单甲氧基聚乙二醇40kD-[4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物((m-PEG)2，40KD-Lys-CONH-Ala-Ala-CO-des-vinblastine，I13)的制备
参考实施例11.2方法，用(mPEG)2，40KD-Lys-NS与4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱反应，制得I13。
实施例14二叉单甲氧基聚乙二醇40kD-[4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春氟宁]偶合物((m-PEG)2，40KD-Lys-CONH-Ala-Ala-CO-des-vinflunine，I14)的制备
参考实施例11.2方法，用4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春氟宁代替4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱，与(mPEG)2，40KD-Lys-NS反应，制得I14。
实施例15单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基-亮氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-Leu-CO-des-vinblastine，I15)的制备
15.1 4-O-(亮氨酰基-亮氨酰基)-去乙酰长春碱(NH2-Leu-Leu-CO-des-vinblastine)的合成
参考实施例11.1方法，用4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春长春碱代替4-O-(丙氨酰基)-去乙酰长春碱与N-叔丁氧羰基-亮氨酸在二环己基碳二亚胺作用下生成4-O-(N-叔丁氧羰基-亮氨酰基-亮氨酰基)-去乙酰长春碱，然后在三氟醋酸的作用下脱除保护基，生成4-O-(亮氨酰基-亮氨酰基)-去乙酰长春碱。
15.2单甲氧基聚乙二醇10kD-[4-O-(亮氨酰基-亮氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-Leu-CO-des-vinblastine，I15)的制备
参考实施例1.3的方法，用4-O-(亮氨酰基-亮氨酰基)-去乙酰长春碱代替4-O-(亮氨酰基)-去乙酰长春碱，与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应，制得I15。
实施例16聚谷氨酸-[4-O-甘氨酰基-去乙酰长春碱]偶合物(PGA-CONH-Gly-CO-des-vinblastine，I16)的制备
参考实施例1.2的方法，用N-苄氧羰基-甘氨酸代替N-苄氧羰基(L)-亮氨酸，与4-去乙酰长春碱反应得到4-O-(N-苄氧羰基-甘氨酰)-去乙酰长春碱，产率50％；将4-O-(N-苄氧羰基-甘氨酰)-去乙酰长春碱催化氢化后制得4-O-甘氨酰-去乙酰长春碱，产率60％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.99(s，1H)，8.05(s，1H)，7.51(d，1H)，7.26(m，3H)，6.60(s，1H)，6.09(s，1H)，5.65(m，1H)，5.50(s，1H)，5.30(t，2H)，5.21(s，2H)，4.22(dd，3H)，3.92(d，1H)，3.91(d，1H)，3.77(d，4H)，3.62(s，3H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，2H)，1.44(m，9H)，0.91(m，7H).ESI-MS：827.3[M+H]+。
将20克多聚-(L)-谷氨酸钠(分子量范围25000-50000，Sigma公司产品)用水溶解，用盐酸调节pH至酸性，用双蒸水透析，冰冻干燥得到多聚-(L)-谷氨酸15克。
将0.4g聚谷氨酸加入10mlDMF中，搅拌30min，然后加入0.19g(0.23mmol)4-O-甘氨酰-去乙酰长春碱和20mg DMAP，冰浴冷却，加入70mg(0.35mmol)DCC，室温搅拌反应过夜，硅胶薄层层析检测(展开剂：MeOH/CH2Cl2＝1/5)，4-O-甘氨酰-去乙酰长春碱反应完全。过滤，在搅拌下将滤液倒入180ml石油醚和20ml二氯甲烷的混合溶液中，析出固体，过滤；将固体加入10ml水中，加入饱和碳酸氢钠至固体溶解，过滤；将滤液冰浴冷却，用1mol/L的盐酸调PH至3-4，析出固体，离心，洗涤，冷冻干燥，得到I16的白色固体340mg，用紫外法测得偶合物含药量为27.3％(W/W)。
实施例17聚谷氨酸-[4-O-丙氨酰基-去乙酰长春碱]偶合物(PGA-CONH-Ala-CO-des-vinblastine，I17)的制备
参考实施例16的方法，用4-O-丙氨酰-去乙酰长春碱与聚谷氨酸反应，得到I17，用紫外法测得偶合物含药量为24.3％（W/W）。
实施例18聚谷氨酸-[4-O-缬氨酰基-去乙酰长春碱]偶合物(PGA-CONH-Val-CO-des-vinblastine，I18)的制备
参考实施例1.2的方法，用N-苄氧羰基-缬氨酸代替N-苄氧羰基(L)-亮氨酸，与4-去乙酰长春碱反应得到4-O-(N-苄氧羰基-缬氨酰)-去乙酰长春碱，产率56.8％；将4-O-(N-苄氧羰基-缬氨酰)-去乙酰长春碱催化氢化后制得4-O-缬氨酰-去乙酰长春碱，产率72％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，3H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，4.42(m，1H)，3.96(q，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(m，4H)，3.43(m，4H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，3H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H).ESI-MS：869.6[M+H]+。
参考实施例16的方法，用4-O-缬氨酰-去乙酰长春碱与聚谷氨酸反应，得到I18，用紫外法测得偶合物含药量为22.4％(W/W)。
实施例19聚谷氨酸-[4-O-亮氨酰基-去乙酰长春碱]偶合物(PGA-CONH-Leu-CO-des-vinblastine，I19)的制备
参考实施例16的方法，用4-O-亮氨酰-去乙酰长春碱与聚谷氨酸反应，得到I19。
实施例20聚谷氨酸-[4-O-脯氨酰基-去乙酰长春碱]偶合物(PGA-CONH-Pro-CO-des-vinblastine，I20)的制备
参考实施例1.2的方法，用N-苄氧羰基-脯氨酸代替N-苄氧羰基(L)-亮氨酸，与4-去乙酰长春碱反应得到4-O-(N-苄氧羰基-脯氨酰)-去乙酰长春碱，产率53％；将4-O-(N-苄氧羰基-缬氨酰)-去乙酰长春碱催化氢化后制得4-O-缬氨酰-去乙酰长春碱，产率69％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，3H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，4.42(m，1H)，3.96(q，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(m，4H)，3.43(m，6H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，2H)，2.32(m，2H)，2.16(m，1H)，1.86(m，5H)，1.44(m，12H)，0.91(m，10H).ESI-MS：m/z 867.4[M+H]+
参考实施例16的方法，用4-O-脯氨酰-去乙酰长春碱与聚谷氨酸反应，得到I20，用紫外法测得偶合物含药量为20.7％(W/W)。
实施例21聚谷氨酸-[4-O-苯丙氨酰基-去乙酰长春碱]偶合物(PGA-CONH-Phe-CO-des-vinblastine，I21)的制备
参考实施例1.2的方法，用N-苄氧羰基-苯丙氨酸代替N-苄氧羰基(L)-亮氨酸，与4-去乙酰长春碱反应得到4-O-(N-苄氧羰基-苯丙氨酰)-去乙酰长春碱，产率62％；将4-O-(N-苄氧羰基-缬氨酰)-去乙酰长春碱催化氢化后制得4-O-缬氨酰-去乙酰长春碱，产率65％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.73(s，1H)，8.03(s，1H)，7.53(d，1H)，7.35(m，8H)，6.59(s，1H)，6.09(s，1H)，5.68(m，1H)，5.49(s，1H)，5.40(t，1H)，5.30(s，1H)，4.42(m，1H)，3.96(q，1H)，3.79(s，3H)，3.77(s，3H)，3.62(m，4H)，3.43(m，4H)，3.30(d，2H)，3.10(d，2H)，2.82(m，2H)，2.63(d，3H)，2.42(m，1H)，2.32(m，1H)，2.16(m，1H)，1.86(m，1H)，1.44(m，12H)，0.91(m，7H).ESI-MS：m/z 917.3[M+H]+。
参考实施例16的方法，用4-O-苯丙氨酰-去乙酰长春碱与聚谷氨酸反应，得到I21，用紫外法测得偶合物含药量为19.1％(W/W)。
实施例22聚谷氨酸-[4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物(PGA-CONH-Ala-Ala-CO-des-vinblastine，I22)的制备
参考实施例16的方法，用4-O-(丙氨酰基-丙氨酰基)-去乙酰长春碱与聚谷氨酸反应，得到I22，用紫外法测得偶合物含药量为18.5％(W/W)。
实施例23聚谷氨酸-[4-O-(亮氨酰基-亮氨酰基)-去乙酰长春碱]偶合物(PGA-CONH-Leu-Leu-CO-des-vinblastine，I23)的制备
参考实施例16的方法，用4-O-(亮氨酰基-亮氨酰基)-去乙酰长春碱与聚谷氨酸反应，得到I23，用紫外法测得偶合物含药量为19.8％(W/W)。
实施例24单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-甘氨酰基-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Gly-CO-des-vinblastine，I24)的合成
将0.10g(0.01mmol)mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入24.8mg(0.03mmol)4-O-甘氨酰-去乙酰长春碱，DMF 2ml，DCM1ml，反应液变为澄清，低温浴(0℃)，加入DCC(9.3mg，0.045mmol)，DMAP(2.4mg，0.02mmol)，低温反应2h，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体85mg，产率79％。
实施例25单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-缬氨酰基-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Val-CO-des-vinblastine，I25)的合成
将0.10g(0.01mmol)mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入26.0mg(0.03mmol)4-O-缬氨酰-去乙酰长春碱，DMF 3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，低温浴(0℃)，加入DCC(9.3mg，0.045mmol)，DMAP(2.4mg，0.02mmol)，低温反应2h，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体92mg，产率85％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.74(s，1H)，8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，1H)，3.74(m，2.15kH)，2.70(m，37H)，1.80(m，2H)，1.37(m，4H)，0.95(m，14H).IR(cm-1，KBr)：3437.0，2945.3，2885.5，1964.9，1740.5，1615.6(-CO-NH-)，1467.1，1359.7，1342.6，1280.4，1240.2，1148.2，1109.1，1060.7，962.5，842.7，529.2。
实施例26单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-脯氨酰基-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Pro-CO-des-vinblastine，I26)的合成
将0.10g(0.01mmol)mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入26.0mg(0.03mmol)4-O-脯氨酰-去乙酰长春碱，DMF2～3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，低温浴(0℃)，加入DCC(9.3mg，0.045mmol)，DMAP(2.4mg，0.02mmol)，低温反应2h，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体86mg，产率80％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，1H)，3.74(m，1.89kH)，3.15(m，8H)，3.00(m，2H)，2.60(m，22H)1.37(m，3H)，0.95(m，6H)。
实施例27单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-苯丙氨酰基-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Phe-CO-des-vinblastine，I27)的合成
将0.10g(0.01mmol)mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入27.5mg(0.03mmol)4-O-苯丙氨酰-去乙酰长春碱，DMF 3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，低温浴(0℃)，加入DCC(9.3mg，0.045mmol)，DMAP(2.4mg，0.02mmol)，低温反应2h，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体89mg，产率82％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：10.00(s，1H)，8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，2H)，3.74(m，1.69kH)，2.70(m，6H)，2.43(m，2H)，2.18(m，1H)，1.68(m，8H)，0.95(m，3H)，0.77(m，2H)。
实施例28单甲氧基聚乙二醇20kD-4-O-甘氨酰基-去乙酰长春碱(m-PEG20kD-OCH2CH2CONH-Gly-CO-des-vinblastine，I28)的合成
将0.20g(0.01mmol)mPEG20KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入24.8mg(0.03mmol)4-O-甘氨酰-去乙酰长春碱，DMF2～3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，低温浴(0℃)，加入DCC(9.3mg，0.045mmol)，DMAP(2.4mg，0.02mmol)，低温反应2h，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体170mg，产率82％。
实施例29单甲氧基聚乙二醇20kD-4-O-缬氨酰基-去乙酰长春碱(m-PEG20kD-OCH2CH2CONH-Val-CO-des-vinblastine，I29)的合成
将0.20g(0.01mmol)mPEG20KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入26.0mg(0.03mmol)4-O-缬氨酰-去乙酰长春碱，DMF2～3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，低温浴(0℃)，加入DCC(9.3mg，0.045mmol)，DMAP(2.4mg，0.02mmol)，低温反应2h，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体184mg，产率88％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：8.26(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.75(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.62(m，1H)，3.74(m，4.02kH)，2.70(m，38H)，1.81(m.1H)，1.66(m，4H)，1.25(m，5H)，0.95(m，14H)，0.76(m，3H)。
实施例30单甲氧基聚乙二醇20kD-4-O-脯氨酰基-去乙酰长春碱(m-PEG20kD-OCH2CH2CONH-Pro-CO-des-vinblastine，I30)的合成
将0.20g(0.01mmol)mPEG20KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入26.0mg(0.03mmol)4-O-脯氨酰-去乙酰长春碱，DMF2～3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，低温浴(0℃)，加入DCC(9.3mg，0.045mmol)，DMAP(2.4mg，0.02mmol)，低温反应2h，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体172mg，产率83％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.09(s，1H)，5.42(s，1H)，3.70(m，3.05kH)，2.16(m，25H)，1.25(m，1H)，0.95(m，9H)，0.76(m，3H)。
实施例31单甲氧基聚乙二醇20kD-4-O-苯丙氨酰基-去乙酰长春碱(m-PEG20kD-OCH2CH2CONH-Phe-CO-des-vinblastine，I31)的合成
将0.20g(0.01mmol)mPEG20KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入27.5mg(0.03mmol)4-O-苯丙氨酰-去乙酰长春碱，DMF2～3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，低温浴(0℃)，加入DCC(9.3mg，0.045mmol)，DMAP(2.4mg，0.02mmol)，低温反应2h，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤，除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到固体178mg，产率85％。
实施例32单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(甘氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Gly-Ala-CO-des-vinblastine，I32)的合成
32.1 4-O-(甘氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱的合成
将50mg(0.06mmol)4-O-丙氨酰基-去乙酰长春碱、Boc-Gly-OH(31.3mg，0.179mmol)加入到10ml圆底瓶中，加入干燥DCM 2ml，冰浴，磁力搅拌，加入HOBt(36.5mg，0.27mmol)，EDC·HCl(57.5mg，0.30mmol)，投料完毕。低温反应2小时，室温反应10h，停止反应，饱和NaHCO3洗2次，饱和NaCl洗1次，有机相用无水硫酸钠干燥，大板分离(展开剂DCM∶CH3OH＝15∶1)，得到产物48mg，产率81％。
将上步产物溶于无水DCM 2ml，加入TFA 4ml，低温反应(-10～-15℃)2h，室温反应6h，停止反应，减压浓缩，加入乙醚析出固体，过滤，固体用NaHCO3溶液溶解，DCM萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩，干燥，得到4-O-(甘氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱28mg，产率65％。ESI-MS：m/z 897.4[M+H]+，920.3[M+Na]+。
32.2 m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Gly-Ala-CO-des-vinblastine(I32)的合成
将0.1g(0.01mmol)mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS加入到10ml圆底瓶中，加入26.9mg(0.03mmol)4-O-(甘氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱，DMF2～3ml，DCM1ml，反应液变为澄清，低温浴(0℃)，加入DCC(9.3mg，0.045mmol)，DMAP(2.4mg，0.02mmol)，低温反应2h，室温反应24h，停止反应，减压浓缩，剩余溶剂约1ml，加入无水乙醚析出固体，低温放置12h，抽滤除去溶剂。所得白色固体溶于水，用0.5μm滤膜过滤除去剩余游离药物，滤液冻干，G25葡聚糖凝胶柱分离，收集产物，冻干，得到目标化合物89mg，产率82％。
实施例33单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(亮氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-Ala-CO-des-vinblastine，I33)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(亮氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱，产率62％。ESI-MS：m/z 953.5[M+H]+，975.4[M+Na]+。
参考32.2的方法，用4-O-(亮氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I33，产率73％。
实施例34单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(缬氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Val-Ala-CO-des-vinblastine，I34)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(缬氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱，产率66％。ESI-MS：m/z 939.4[M+H]+，961.4[M+Na]+。
参考32.2的方法，用4-O-(缬氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I34，产率64％。
实施例35单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(脯氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Pro-Ala-CO-des-vinblastine，I35)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(脯氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱，产率50％。ESI-MS：m/z 937.1[M+H]+。
参考32.2的方法，用4-O-(脯氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I35，产率69％。
实施例36单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(苯丙亮氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Phe-Ala-CO-des-vinblastine，I36)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(苯丙氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱，产率62％。ESI-MS：m/z 987.5[M+H]+。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.74(s，1H)，8.03(s，1H)，7.84(d，1H)，7.53(d，1H)，7.11(m，8H)，6.63(s，1H)，6.10(s，1H)，5.81(t，1H)，5.48(s，1H)，5.29(s，1H)，5.24(d，1H)，4.68(m，1H)，3.81(s，3H)，3.77(s，3H)，3.68(s，1H)，3.60(s，3H)，3.14(d，2H)，2.80(s，2H)，2.69(s，3H)，2.69(s，1H)，2.42(m，1H)。
参考32.2的方法，用4-O-(苯丙氨酰-丙氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I36，产率76％。
实施例37单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(丙氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Ala-Leu-CO-des-vinblastine，I37)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(丙氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱，产率83％。ESI-MS：m/z 955.0[M+H]+，952.2[M-H]-，477.6[M+2H]2+。
参考32.2的方法，用4-O-(丙氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I37，产率82％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：12.74(s，1H)，8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，3H)，3.74(m，1.3kH)，2.70(s，3H)，2.60(s，1H)，2.50(m，3H)，2.18(m，23H)，1.68(m，6H)，1.37(m，4H)，0.95(m，10H)，0.77(m，3H)。
实施例38单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(甘氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Gly-Leu-CO-des-vinblastine，I38)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(甘氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱，，产率70％。ESI-MS：m/z 939.5[M+H]-.1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.72(s，1H)，8.03(s，1H)，7.80(d，1H)，7.51(d，1H)，7.11(m，4H)，6.63(s，1H)，6.09(s，1H)，5.81(t，1H)，5.47(s，1H)，5.21(d，1H)，4.64(m，1H)，3.81(s，3H)，3.77(s，3H)，3.68(s，1H)，3.60(s，3H)，3.10(d，2H)，2.82(s，2H)，2.67(s，3H)，2.42(m，1H)。
参考32.2的方法，用4-O-(甘氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I38，产率82％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.88(d，1H)，6.61(d，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.20(d，1H)，4.60(m，2H)，3.74(m，2.24kH)，2.70(m，34H)，1.71(m.1H)，1.50(m，1H)，0.95(m，10H)，0.76(m，3H)。
实施例39单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(缬氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Val-Leu-CO-des-vinblastine，I39)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(缬氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱，产率69％。ESI-MS：m/z 982.0[M+H]+，1004.1[M+Na]+，491.9[M+2H]2+.1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.69(s，1H)，8.03(s，1H)，7.54(m，2H)，7.11(m，3H)，6.62(s，1H)，6.09(s，1H)，5.77(t，1H)，5.44(s，1H)，5.24(d，2H)，4.71(m，1H)，3.81(s，3H)，3.77(s，3H)，3.68(s，1H)，3.60(s，3H)，3.10(d，2H)，2.80(s，2H)，2.69(s，3H)，2.63(s，1H)，2.42(m，1H)。
参考32.2的方法，用4-O-(缬氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I37，产率77％。
实施例40单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(脯氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Pro-Leu-CO-des-vinblastine，I40)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(脯氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱，产率66％。ESI-MS：m/z 979.9[M+H]+，1001.5[M+Na]+，490.4[M+2H]2+，978.1[M-H]-。
参考32.2的方法，用4-O-(脯氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I40，产率68％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，3H)，3.74(m，3.0kH)，2.70(m，35H)，2.18(m，2H)，1.68(m，10H)，1.26(m，1H)，0.95(m，11H)，0.77(m，3H)。
实施例41单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(苯丙氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Phe-Leu-CO-des-vinblastine，I41)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(苯丙氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱，产率69％。ESI-MS：m/z 1030.0[M+H]+，1052.0[M+Na]+。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.70(s，1H)，8.03(s，1H)，7.59(dd，2H)，7.20(m，8H)，6.62(s，1H)，6.09(s，1H)，5.78(t，1H)，5.45(s，1H)，5.24(d，1H)，4.71(m，1H)，3.81(s，3H)，3.77(s，3H)，3.68(s，1H)，3.60(s，3H)，3.25(m，8H)，2.80(s，2H)，2.69(s，3H)，2.63(s，1H)，2.42(m，2H)。
参考32.2的方法，用4-O-(苯丙氨酰-亮氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I41，产率66％。
实施例42单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(丙氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-Ala-CO-des-vinblastine，I42)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(丙氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱，产率61％。ESI-MS：m/z 939.8[M+H]+。
参考32.2的方法，用4-O-(丙氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I42，产率82％。
实施例43单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(甘氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-Ala-CO-des-vinblastine，I43)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(甘氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱，产率74％。ESI-MS：m/z 925.5[M+H]+，947.4[M+Na]+。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.71(s，1H)，8.03(s，1H)，7.65(d，1H)，7.52(d，2H)，7.11(m，4H)，6.63(s，1H)，6.09(s，1H)，5.81(t，1H)，5.49(s，1H)，5.23(d，2H)，4.67(m，1H)，3.81(s，3H)，3.77(s，3H)，3.68(s，1H)，3.60(s，3H)，3.10(d，2H)，2.81(s，3H)，2.69(s，3H)，2.63(s，1H)，2.42(m，6H)，1.74(m，6H)，1.30(m，9H)，0.91(m，15H)。
参考32.2的方法，用4-O-(甘氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I43，产率79％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，1H)，3.74(m，1.58kH)，2.36(m，1H)，1.85(m，1H)，1.46(m，5H)，0.95(m，13H)。
实施例44单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(亮氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-Ala-CO-des-vinblastine，I44)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(亮氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱，产率65％。ESI-MS：m/z 981.5[M+H]+，1029.5[M+K]+.1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：9.75(s，1H)，8.03(s，1H)，7.51(d，1H)，7.11(m，4H)，6.63(s，1H)，6.09(s，1H)，5.78(t，1H)，5.46(s，1H)，5.18(d，2H)，4.71(m，1H)，3.81(s，3H)，3.77(s，3H)，3.68(s，1H)，3.60(s，3H)，3.10(d，2H)，2.80(s，2H)，2.69(s，3H)，2.63(s，1H)，2.44(m，2H)。
参考32.2的方法，用4-O-(亮氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I44，产率80％。
实施例45单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(缬氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-Ala-CO-des-vinblastine，I45)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(缬氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱，产率65％。ESI-MS：m/z 967.58[M+H]+，989.4[M+Na]+。
参考32.2的方法，用4-O-(缬氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I45，产率78％。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ：8.04(s，1H)，7.46(d，1H)，7.22(m，4H)，6.95(d，1H)，6.75(d，1H)，6.61(d，1H)，6.37(s，1H)，6.09(s，1H)，5.80(t，1H)，5.42(s，1H)，5.23(d，1H)，4.60(m，1H)，3.74(m，2.56kH)，2.60(m，6.5H)，2.50(m，3H)，1.68(m，3H)，1.37(m，10H)，0.95(m，28H)，0.77(m，10H)。
实施例46单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(脯氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-Ala-CO-des-vinblastine，I46)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(脯氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱，产率61％。ESI-MS：m/z 965.9[M+H]+，988.0[M+Na]+，483.8[M+2H]2+。
参考32.2的方法，用4-O-(脯氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I46，产率66％。
实施例47单甲氧基聚乙二醇10kD-4-O-(苯丙氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱(m-PEG10kD-OCH2CH2CONH-Leu-Ala-CO-des-vinblastine，I47)的合成
参考32.1的方法合成4-O-(苯丙氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱，产率69％。ESI-MS：m/z 1015.5[M+H]+，1037.4[M+Na]+。
参考32.2的方法，用4-O-(苯丙氨酰-缬氨酰基)-去乙酰长春碱与mPEG10KD-OCH2CH2COO-NS反应得到目标化合物I47，产率64％。
实验例1 偶合物在缓冲液、兔血浆和人血浆中的稳定性评价
实验例1.1 在缓冲溶液中的稳定性测定
将一定质量的偶合物溶于pH为7.4的缓冲溶液中(药物浓度约为0.2mmol/l)，按照体积200μl分成10等份，分别进行编号，在37℃孵育。在不同时间(30min，1h，2h，3h，4h，5h，7h等)按照样品编号顺序进行取样，用水和乙腈稀释到0.5ml，用4ml甲基叔丁基醚萃取两次，涡流30s混匀，离心(16000rmp约10min)，取上层清液，合并有机相，氮气吹干。所得固体用100μl流动相溶解，HPLC检测，检测其在4-O-去乙酰长春碱、4-O-去乙酰长春新碱、4-O-去乙酰长春瑞宾、4-O-去乙酰长春氟宁或长春地辛保留时间处的峰面积，并计算偶合物释放的药物浓度。
实验例1.2在血浆中的稳定性测定
将药物溶于100μl生理盐水，然后加入到1ml血浆中，配成偶合物浓度0.2mmol·L-1，涡流混合，将混合物分成十等份，分别进行编号，37℃水浴。在不同时间(30min，1h，2h，3h，4h，5h，7h等)按照样品编号进行取样，加入200μl甲醇，沉淀蛋白，涡流混合30S，离心(16000rpm，10min)，取上清液，HPLC进样检测。检测其在4-O-去乙酰长春碱、4-O-去乙酰长春新碱、4-O-去乙酰长春瑞宾、4-O-去乙酰长春氟宁或长春地辛保留时间处的峰面积，计算偶合物释放的药物浓度。
实验结果见表1。
表1 目标化合物在缓冲液、兔血浆和人体血浆中稳定性测定结果
(48h，释放游离药物/偶合物中含药量，％)
Figure GSA00000031037800371
Figure GSA00000031037800381
实验例2小鼠体内抗人肝癌移植瘤的活性评价
取Balb/c-nu/nu裸鼠(5-7周龄，16-20克)，随机分组，皮下接种0.1毫升含106个人肝癌细胞(HepG2)的细胞悬液，至瘤体积达到50立方毫米。静脉注射0.5mg/kg(折算成长春碱衍生物)剂量的偶合物及游离药物，于给药后20天，处死动物，测定体重及肿瘤重量，按下式计算肿瘤抑制率：
Figure GSA00000031037800382
实验结果见表2。
表2 目标化合物对人肝癌移植瘤的抑制作用
  化合物   动物数(终/始)  体重变化(g)  瘤重(g)   抑制率(％)
  生理盐水   6/6  +9.85  1.19
  去乙酰长春碱   5/6  +3.93  0.38   68
  I1   6/6  +7.56  0.30   75
  I2   6/6  +8.04  0.46   61
  I3   5/6  +6.91  0.32   73
  I4   6/6  +8.30  0.29   75
  I5   6/6  +8.11  0.41   76
  I6   6/6  +7.82  0.35   71
  I7   6/6  +6.47  0.37   69
  I15   6/6  +8.28  0.42   65
  I19   6/6  +8.46  0.53   55
  I23   6/6  +8.55  0.45   62
给药剂量折算成游离药物量。
由表2可知，与游离药物相比，目标化合物对实体瘤的抑制作用相当或更好；而对体重的影响低于游离药物，表明目标化合物的毒副作用较轻。

Claims (10)

1.式I所示的偶合物或其药学可接受的盐：
Figure FSA00000031037700011
其为生物兼容性大分子通过氨基酸或寡肽与长春碱类药物形成的偶合物，其中：
Vin 代表以下式Vin-1、Vin-2、或Vin-3所示的长春碱类药物分子的长春碱环部分：
Figure FSA00000031037700012
P  代表分子量为5000-200000的生物兼容性大分子；
R1 代表CH3或CHO；
R2 代表OCH3或NH2；
m  代表1-5的整数；
n  代表1-50的整数。
2.权利要求1的偶合物或其药学可接受的盐，其中所述的生物兼容性大分子选自聚乙二醇(在本文可缩写为PEG)、聚谷氨酸(在本文可缩写为PGA)、及其衍生物。
3.权利要求1-2任一项所述偶合物或其药学可接受的盐，其中所述生物兼容性大分子的分子量为5000-200000、或为5000-100000、或为5000-80000、或为5000-60000、或为5000-20000；或者，所述生物兼容性大分子的分子量为5000-200000、或为10000-200000、或为15000-200000、或为20000-150000、或为20000-100000、或为25000-80000、或为30000-60000；或者，所述生物兼容性大分子的分子量为5000-200000、或为5000-8000、或为8000-10000、或为10000-15000、或为15000-20000、或为20000-25000、或为25000-30000、或为30000-50000、或为50000-80000、或为80000-120000、或为120000-200000。
4.权利要求1-3任一项所述偶合物或其药学可接受的盐，其特征在于以下任一项或多项：
i)所述的生物兼容性大分子是聚乙二醇，并且n为1。
ii)所述的生物兼容性大分子还可以是下式P1所示的聚乙二醇衍生物，也就是说其在式I中可以以下面的P1基团部分体现：
P1＝-CH2CH2O-(CH2CH2O)x-CH3，
其中，x为110-4500的整数；进一步的，x为110-4000的整数、或为110-3500的整数、或为110-3000的整数、或为110-2500的整数、或为110-2000的整数、或为110-1500的整数、或为110-1000的整数、或为110-800的整数、或为110-500的整数；
iii)所述的生物兼容性大分子还可以是下式P2所示的聚乙二醇衍生物，也就是说其在式I中可以以下面的P2基团部分体现：
其中，y为55-2250的整数；进一步的，y为55-2200的整数、或为55-2000的整数、或为55-1800的整数、或为55-1500的整数、或为55-1200的整数、或为55-1000的整数、或为55-750的整数、或为55-500的整数、或为55-400的整数、或为55-300的整数、或为55-250的整数。
5.权利要求1-4任一项所述偶合物或其药学可接受的盐，其特征在于以下任一项或多项：
i)所述的生物兼容性大分子是聚谷氨酸，并且n为10-50的整数。在一个实施方案中，所述的生物兼容性大分子是聚谷氨酸，并且n为15-45的整数、或为20-40的整数、或为25-35的整数。在一个实施方案中，所述的生物兼容性大分子是聚谷氨酸，并且n为10-20的整数、或为20-30的整数、或为30-40的整数、或为40-50的整数。
ii)所述的m为1-5的整数、或为1-4的整数、或为1-3的整数、或为1或2。在一个实施方案中，所述的m为1、或2、或3、或4、或5。
6.权利要求1-5任一项所述偶合物或其药学可接受的盐，其特征在于以下任一项或多项：
i)所述的Vin代表长春碱类药物分子的长春碱环部分；进一步的，所述的长春碱类药物选自：长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindestine)、长春瑞宾(vinorelbine)和长春氟宁(vinflunine)；
ii)式I中所示的长春碱类药物选自：长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindestine)、长春瑞宾(vinorelbine)、和长春氟宁(vinflunine)；
iii)用于连接长春碱类药物与生物兼容性大分子的氨基酸选自：甘氨酸、(L)-丙氨酸、(L)-亮氨酸、(L)-异亮氨酸、(L)-缬氨酸、(L)-脯氨酸、(L)-苯丙氨酸、(L)-甲硫氨酸、或(L)-谷氨酰胺；
iv)用于连接长春碱类药物与生物兼容性大分子的寡肽由选自以下的氨基酸组成：甘氨酸、(L)-丙氨酸、(L)-亮氨酸、(L)-异亮氨酸、(L)-缬氨酸、(L)-脯氨酸、(L)-苯丙氨酸、(L)-甲硫氨酸、或(L)-谷氨酰胺。
7.制备权利要求1-6任一项所述偶合物或其药学可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
i)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁在卤化氢(例如氯化氢，例如饱和氯化氢)的溶液(例如非水溶液，例如在甲醇中的溶液，例如在无水甲醇中的溶液)中醇解，脱去C-4位乙酰基，得到去乙酰化衍生物衍生物；
ii)使长春碱、长春新碱、长春瑞宾或长春氟宁C-4位去乙酰化衍生物或者长春地辛分子中的C-4的羟基通过氨基酸与聚谷氨酸偶联；
iii)以及任选的使以上所得偶合物形成药学可接受的盐。或者，其包括说明书第二方面所述的步骤。
8.一种药物组合物，其包含治疗和/或预防有效量的权利要求1-6所述的偶合物或其药学可接受的盐，以及任选的一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。
9.权利要求1-6任一项所述的偶合物或其药学可接受的盐或者本发明权利要求8所述药物组合物在制备用于治疗和/或预防增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病的药物中的用途。
10.在有需要的哺乳动物中治疗和/或预防增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗和/或预防有效量的权利要求1-6任一项所述的偶合物或其药学可接受的盐或者权利要求8所述药物组合物。
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