CN102188523A - 一种植物抗生素 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物抗生素，通过以下方法制备：将南瓜籽、油菜籽、木瓜籽、葡萄柚、甜橙、绿豆、栀子花、番石榴、黑芝麻、厚朴、生山楂、苏叶、松针、藿香按比例加乙醇浸泡，低温蒸馏真空浓缩提取，所制得的植物抗生素含酸量以绿原酸计，不少于0.4％；含酚量以愈创木酚计，不少于4.18％；pH值为2.0～4，抗菌谱广，对病毒、真菌、细菌的灭活效果显著，安全稳定，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种植物抗生素。
背景技术
抗生素(antibiotics)是由微生物包括细菌、真菌、放线菌属或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素为微生物培养液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。
目前滥用抗生素已产生一些社会问题。抗生素滥用使细菌逐渐产生耐药基因，使抗生素药物效果变差，甚至无效。而且，细菌耐药性可以相互传播的，使细菌耐药性复杂化。另外抗生素用得过多过滥，会大量杀灭体内正常细菌，让致病菌乘虚而入。如人体肠道细菌按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存，在质和量上形成一种生态平衡，长期应用广谱抗生素，敏感肠菌被抑制，未被抑制的细菌乘机繁殖，从而引起菌群失调，可以引起维生素的缺乏，使身体抵抗力下降。
抗生素用药后常发生刺激症状如红斑、灼热、瘙痒、刺痛，毛囊炎，皮肤萎缩变薄，毛细血管扩张等；可见皮肤干燥、多毛、萎缩纹、对感染的易感性增加等；如长期用药可能引起皮质功能亢进症，表现为多毛、痤疮、满月脸、骨质疏松等症状；偶可引起变态反应性接触性皮炎及易产生耐药性不良副作用。因此用药需考虑患者年龄，如皮肤屏障功能较弱的婴幼儿童和孕产妇，大面积外用涂抹吸收后可出现耳毒性及肾毒性反应，从而使婴幼儿童和孕产妇积蓄不良致后健康隐患。
植物抗生素是在真菌、其它病原微生物的感染或者在毒性化学药品及紫外光照射下，植物体内重新合成的具有抗病原体或其他活性的一类物质。高等植物能够产生多种结构类型的植物抗生素，因此从植物中提取植物抗生素是目前研究的热点。
研究发现，多种中药具有抗菌消炎作用，可用于防治病原微生物感染，还具有调节人体免疫系统的作用。目前未见用中药制备植物抗生素的报道。
发明内容
本发明的目的要解决的问题是提供一种利用中草药制备的植物抗生素，本发明提供的植物抗生素，由以下方法制备：
将南瓜籽5-7重量份、油菜籽6.5-8.5重量份、木瓜籽3.8-5.5重量份、葡萄柚6.5-7.0重量份、甜橙7-8重量份、绿豆7.5-8重量份、栀子花6-9重量份、番石榴7.2-8.5重量份、黑芝麻5.5-9.5重量份、厚朴3.5-4重量份、生山楂5-5.5重量份、苏叶4.5-5重量份、松针7.5-9.5重量份、藿香3-3.5重量份与乙醇20-25重量份浸泡3天，过滤得乙醇滤液备用；滤渣加水40-45重量份煎煮4-5小时，过滤得一煎滤液，一煎滤渣加水20-25重量份煎3-4小时，过滤得二煎药液；
将乙醇药液和一煎滤液、二煎药液混合，静置3天，过滤后取滤液在60℃-70℃真空蒸馏3h，再于95℃-115℃真空蒸馏3h，收集各时段蒸馏液混合，静置后取上清液90℃-115℃真空蒸馏3.5h，得净化液，加入净化液重量16-20％的竹炭，在95℃-110℃真空蒸馏1h，收集蒸馏液即为植物抗生素。
上述制得的植物抗生素中，含酸量以绿原酸计，不少于0.4％(mg/ml)；含酚量以愈创木酚计，不少于4.18％(mg/ml)；pH值为2.0～4。
本发明方法制备的植物抗生素中，经仪器分析测定，其主要成分包含以下几类：多酚类、愈创木酚、儿茶素、原花色素、黄酮类鼠李糖苷的二氢莰非醇和二氢槲皮苷、查耳酮类及其衍生物等；绿原酸、氨基酸类、无机元素以及有机酸类成分等。
现代科学研究已经证实：植物酸类多酚类如绿原酸、愈创木酚、黄酮类等物质对病毒具有较强的对抗作用，如抑制甲、乙型流感病毒、人体呼吸系统合孢体病毒(RSV)。多酚类对于对于胃肠炎病毒、A型肝炎病毒、对芽孢杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌、革兰氏阴性菌均、革兰氏阳性菌有很强的抑制作用。
本发明低温蒸馏真空浓缩提取植物抗生素，避免了高温提取对中草药有效成份的破坏，不仅针对病毒、真菌、细菌的灭活效果显著，而且成份明确，制备的植物抗生素性能稳定。本发明所述植物抗生素含弱酸组分，可以有效杀灭病毒、真菌及细菌，而且弱酸组分可以被人体轻易分解，安全无害，且可有效提高人体免疫力。
本发明所述植物抗生素原液pH值为2.0～4，相对密度为0.96～1.03，可用于皮肤黏膜有害微生物的灭活。或以去离子水稀释2-10倍，pH值为3～5，可用于预防病毒病菌提高自身免疫力的口服保健产品，具有明显提高自身免疫力效果。
本发明所述植物抗生素以去离子水稀释5-15倍，pH值为3.6～5.6，用于各种真菌细菌引起的婴幼儿童及孕产妇臀部肿胀、皮炎、皮癣、瘙痒、痱子、蚊虫叮咬、外阴感染，以及婴幼儿童因粪、尿、酸、碱或微生物生长引起的红肿刺激，尿布疹，具有抑菌消炎、除味功效。
本发明所述植物抗生素以去离子水稀释6-12倍，用于老年人长期卧床的病人由于受力点集中，长期的血液不流通和免疫力下降而引起的病毒及细菌感染，以及用于褥疮及痔疮、肛周炎、肛门脓肿、肛门出血，可有效缓解症状。
本发明所述植物抗生素以去离子水稀释15-20倍并添加生物钙基、木糖醇、维生素E基质的不含氟牙膏，还可用预防和治疗上火牙痛、牙龈炎症、口腔溃疡。
经广州中医学院中药临床药理基地、广州中医学院附属医院、广东省中医院、广州医学院附属医院等六家医院对580例随机单盲临床实验验证，使用本发明的植物抗生素针对中老年人湿敷治疗急性湿疹具有红肿渗出，褥疮及皮肤溃疡以及中老年免疫力下降所致的皮肤渗脓其显效率为78.70％，总有效率为94.30％。
广州中山医科大学附属第三医院耳鼻喉病科使用本发明植物抗生素针对治疗外耳道真菌病19例，患者全部治愈，表明该植物抗生素对多种真菌感染的外耳道真菌病、乳突根治术腔真菌病、慢性化脓性中耳炎并外耳道真菌病有很好的疗效，一般患者在用药1-3天即可见效，治疗1周后症状和体征得到有效控制，疗效与上海宝龙药业有限公司生产的商品名显克欣(成分酮康唑)等同。
本发明所述植物抗生素抑菌范围广，对临床常见致病菌如金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、产气杆菌、淋球菌、克氏肺炎杆菌、绿浓杆菌及大肠杆菌等抑制作用较强。还可明显抑制并杀灭红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、断毛发癣菌、絮状表皮癣菌、石膏样小孢子菌、羊毛小孢子菌；对白色念球菌、申克氏孢子丝菌及裴氏着色菌也具有明显抑制作用，且效果与化学抗生素比较无显著差异。
经实验证实，本发明所述植物抗生素在鸡(鸭)胚成纤维细胞或在鸡(鸭)胚中具有抑制鸡新城疫病毒、鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒的活性，还有抑制单纯疱疹II型病毒在人胚肾细胞上增殖的作用。
用本发明所述植物抗生素消毒根管，封药后细菌检出率平均下降了45％，菌落形成单位(CFU)平均减少了60％左右，与临床最常用的根管消毒药FC比较，降低的程度无明显差别，表明本发明所述植物抗生素消毒根管，其杀菌抑菌能力能够达到FC的效果。
稳定性试验显示，本发明植物抗生素制剂原液经37℃恒温存放90天后，对白色念珠菌的杀灭作用无影响。
安全性试验显示，本发明所述植物抗生素单次给药和多次给药对正常皮肤、破损皮肤均未见有刺激性反应，也未见皮肤过敏性反应，表明本发明所述植物抗生素安全无副作用。
本发明所述植物抗生素抗菌谱广，对病毒、真菌、细菌的灭活效果显著，安全稳定，集治疗、预防、保健于一体，在杀菌消炎同时，不仅保护皮肤酸性环境不受破坏，而且能加强自净作用，具有促进粘膜创面愈合，修复病变组织增强自然防御功能，可有效预防和治疗病原微生物对人体的侵害，具有广泛的利用价值及开发前景。
具体实施方式
本发明公开了一种植物抗生素，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、制备方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：制备本发明所述植物抗生素
准确称取(单位为kg)南瓜籽7.00、油菜籽8.50、木瓜籽5.50、葡萄柚6.50、甜橙8.00、绿豆8.00、栀子花9.00、番石榴8.50、黑芝麻9.50、松针9.50、厚朴3.50、生山楂5.00、苏叶5.00、藿香3.50kg加乙醇25.00kg浸泡3天，3天后过滤，得乙醇药液。将药渣加蒸馏水40kg，煎4h，过滤得一煎药液35kg。将一煎药渣加蒸馏水20kg，煎3h，过滤得二煎药液15kg，将乙醇药液和一煎、二煎药液混合，静置3天，过滤后得95kg药液。将过滤后的药液加入乙醇蒸馏釜中蒸馏，在60℃-70℃真空浓缩以去除乙醇，恒温保持3h，然后再升温至于95℃-115℃，恒温保持3h；收集各时段的蒸馏液，蒸馏结束；混合后得纯化蒸馏液20kg：静置48h。取上清层置蒸馏釜中蒸馏，90℃-115℃真空浓缩，恒温保持3.5h；蒸馏结束后得精制净化液16.5kg，在精制净化液中加入重量百分比16-20的竹炭，置蒸馏釜中蒸馏，加热至95℃-110℃，真空浓缩，恒温保持1h，所得浓缩滤液8kg即为植物抗生素，为淡黄色液体。
实施例2：制备本发明所述植物抗生素
准确称取(单位为kg)南瓜籽5.50、油菜籽7.50、木瓜籽3.80、葡萄柚7.00、甜橙7.50、绿豆7.80、栀子花8.00、番石榴7.80、黑芝麻7.50、松针8.50、厚朴3.80、生山楂5.30、苏叶4.80、藿香3.20kg加乙醇22.00kg，浸泡3天，3天后过滤，得乙醇药液。将药渣加蒸馏水40kg，煎4h，过滤得一煎药液35kg。将一煎药渣加蒸馏水20kg，煎3h，过滤得二煎药液15kg，将乙醇药液和一煎、二煎药液混合，静置3天，过滤后得95kg。将过滤后的药液加入乙醇蒸馏釜中蒸馏，在60℃-70℃真空浓缩以去除乙醇，恒温保持3h，然后再升温至于95℃-115℃，恒温保持3h；收集各时段的蒸馏液，蒸馏结束；混合后得纯化蒸馏液20kg：静置48h。取上清层置蒸馏釜中蒸馏，90℃-115℃真空浓缩，恒温保持3.5h；蒸馏结束后得精制净化液16.5kg，在精制净化液中加入重量百分比16-20的竹炭，置蒸馏釜中蒸馏，加热至95℃-110℃，真空浓缩，恒温保持1h，所得浓缩滤液8kg即为植物抗生素，为淡黄色液体。
实施例3：制备本发明所述植物抗生素
准确称取(单位为kg)南瓜籽5.00、油菜籽6.50、木瓜籽3.80、葡萄柚7.00、甜橙7.00、绿豆7.50、栀子花6.00、番石榴7.20、黑芝麻5.50、松针7.50、厚朴4.00、生山楂5.50、苏叶4.50、藿香3.00kg加乙醇20.00kg浸泡3天，3天后过滤，得乙醇药液。将药渣加蒸馏水40kg，煎4h，过滤得一煎药液35kg。将一煎药渣加蒸馏水20kg，煎3h，过滤得二煎药液15kg，将乙醇药液和一煎、二煎药液混合，静置3天，过滤后得95kg药液。将过滤后的药液加入乙醇蒸馏釜中蒸馏，在60℃-70℃真空浓缩以去除乙醇，恒温保持3h，然后再升温至于95℃-115℃，恒温保持3h；收集各时段的蒸馏液，蒸馏结束；混合后得纯化蒸馏液20kg：静置48h。取上清层置蒸馏釜中蒸馏，90℃-115℃真空浓缩，恒温保持3.5h；蒸馏结束后得精制净化液16.5kg，在精制净化液中加入重量百分比16-20的竹炭，置蒸馏釜中蒸馏，加热至95℃-110℃，真空浓缩，恒温保持1h，所得浓缩滤液8kg即为植物抗生素，为淡黄色液体。
实施例4：本发明所述植物抗生素测定
绿原酸含量的测定
1、仪器和材料
岛津LG-1200高效液相色谱仪，975型紫外检测器，BIOFUGE22R高速冷冻离心机，其余试剂均为分析纯。绿原酸标准样品(由中国药品生物制品检定所提供).植物抗生素制剂样品(实施例1-3制备)。
2、实验方法
绿原酸含量的高效液相色潜分析
色谱条件色谱柱KYATECH(日本)ODS柱(4.6mm×25cm，5Um)；流动相：乙腈∶水∶冰乙酸(体积比)＝10∶90∶5；流速：1mL/min；检测波长：325nm；进样量10uL。
3、实验与结果
精密称取绿原酸标准样品10mg于100mL容量瓶中，以甲醇为溶剂超声助溶，待冷却至室温定容，备用。
标准曲线的绘制
分别精密吸取绿原酸标准溶液0.125、0.25、0.5、1、2、4、6、8mI.于10mL容量瓶中，用甲醇稀释量至刻度摇匀。按照上述色谱条件分别取稀释后样品6份及原标准溶液进样分析。每个样重复三次，取峰值平均值，得峰面积(Y)与绿原酸浓度(X)的线性回归方程为：Y＝2×107X-31962，相关系数R＝0.999。在该条件下，绿原酸浓度的线性范围为0.00125～0.01mg/mL。
精密称取实施例1-3的5份植物抗生素制剂，每份10克，按照确定的方法制备分析样品，并在选定的色谱条件下分析绿原酸的含量，绿原酸以mg/ml计百分含量分别为0.396、0.401、0.405、0.406、0.509，测得平均率0.403％，相对标准偏差为0.124。
愈创木酚含量的测定
1、仪器和材料
GC-122气相色谱仪，愈创木酚对照品(中国药品生物制品检定所提供)植物抗生素(自制)萘、乙酸乙酯和无水硫酸钠分析纯。
2、方法与结果
色谱条件色谱柱为聚乙二醇(PEG)-20M，柱温120℃；气化室温度为240℃；检测器；氢火焰离子化检测器，温度为280℃，流速1.5ml/min-1；H2流速30ml/min-1；空气流速350ml/min-1。
校正因子测定取萘101.10mg，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml含10.11mg的溶液，作为内标溶液.另取愈创木酚对照品40.11mg，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml含愈创木酚4.10mg的溶液，作为对照品溶液，精密量取对照品溶液和内标溶液各1ml，置10ml量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀、精精吸取1μl注入气相色谱仪，连续进样5次，按平均峰面积计算较正因子。
供试品溶液的制备取样品植物抗生素制剂，精密称定，取约7g，精密称定，置250ml园底烧瓶中，加水150ML，摇匀，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度部分，再加入乙酸乙酯4ml连接回流冷凝管，加热回流4h，放冷，将挥发油测定器中液体移至分液漏斗中，用少量乙酸乙酯洗涤冷凝管，并入分液漏斗，分取乙酸乙酯层，用铺有无水硫酸钠0.5g的垂熔玻璃漏斗滤过，滤液置10ml量瓶中，用少量乙酸乙酯洗涤溶器，洗液并入同一瓶中，精密加入1ml内标溶液，加乙酸乙酯至刻度，摇匀、即得，精密吸取供试品溶液1ml，注入气相色谱仪，测定。
线性关系考察精密称取愈创木酚对照品220.41mg，置25ML量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，再分别精密移取1、3、5、7、9ml置100ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，分别吸取上述对照品溶液1ml，注入气相色谱仪，测定峰面积，以愈创木酚进行浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做出标准曲线，得回归方段：Y＝599.77X-1.261，r＝0.9997，表明愈创木酚在0.0881～0.7936mg/ml-1浓度范围内线性关系良好。
精密度试验吸取对照品溶液1μl重复进样5次，测定峰面积，RSD＝0.2％(n＝5)。
重现性试验取同批样品5份，分别按供试品制备项下制备，测愈创木酚含量，RSD＝0.3％(n＝5)。
空白对照试验按处方比例及工艺配制空的制剂，同供试液制备方法制得空白对照溶液，照含量测定项下方法试验，取对照品、样品及空白对照溶液各1μl注入气相色谱仪，记录色谱图，结果阴性样品溶液不干扰愈创木酚的含量测定。
稳定性试验取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12h进样测定峰面积，并计算RSD＝0.9％，表明样品液在12h内稳定性良好。
回收率试验取乙知含量的植物抗生素制剂3.5g，精密称定，共6份，分别精密加入愈创木酚对照溶液(7.0531mg/ml-1)1ml，置250ml圆底烧瓶中，加水150ml，连接挥发油测定器，照供试品制备项下方法处理测定，平均回收率为98.5％RSD＝0.3％(n＝5)。
含量测定取实施例1-3的样品3批，按上述色谱条件测定，计算含量，愈创木酚以mg/ml计的百分含量为4.18、4.29、4.29％。
实施例5：本发明所述植物抗生素的体外抗病毒实验
材料：
1、病毒：鸡新城疫标准强毒株(NDV F48E9)、鸭瘟病毒(DPV F34)、传染性喉气管炎疫苗中等毒力疫苗(ILTV)、鸡痘病毒弱毒疫苗(APV Q)、传染性支气管炎病毒肾病变株SAIBV(地方株广东省农科院动物传染病防治效果研究组)、传染性法氏囊炎中等毒力活疫苗(IBV BJ-836)。
2、鸡胚、鸭胚：来源于非疫区健康种鸡(鸭)场，自行孵化至8～12日龄。
3、细胞：常规方法培养鸡胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞。
4、受试药物：实施例1-3制备的植物抗生素
方法：
1、病毒效价测定：将病毒10倍递增稀释后，常规方法接种鸡(鸭)胚和/或鸡(鸭)胚成纤维细胞；继续培养，观察记录胚胎死亡情况和CPE。
2、药物对鸡(鸭)胚和鸡(鸭)胚成纤维细胞的毒性测定：将受试药物2倍比稀释后，过滤除菌，分别接种于细胞和/或鸡胚，每一稀释度接种4孔细胞或4枚胚胎，并设立未加药物的空白对照，继续培养，观察记录各组胚胎死亡和CPE出现情况。
3、受试药物在鸡胚和鸡(鸭)胚成纤维细胞中抑制病毒效力测定：将受试药物2倍比稀释，各稀释度分别与等量病毒混合，接种于细胞或鸡(鸭)胚中，每孔或每胚接种病毒量为100个TCID50或EID50，同时设立未使用药物的病毒感染对照组，继续培养，观察并记录胚胎死亡情况，用MTT法测定各孔细胞活力。
结果：
1、本发明所述植物抗生素对病毒效价：NDV EID50＝107.83 IBVEID50＝105.45
DPV EID50＝107 ILTVTCID50＝105
APV QTCID50＝106.5 IBDV BJ836＝105.04
2、本发明所述植物抗生素对鸡(鸭)胚的最大无毒浓度为20g/L；药物对鸡胚成纤维细胞的最大无毒浓度为1.25g/L
3、受试药物抑制病毒的效力：
受试药物对鸡(鸭)胚的半数保护剂量为：
NDV＝1.25g/L DPV＝1.15g/L SAIBV＝0.63g/L
受试药物在鸡(鸭)胚成纤维细胞上抑制病毒的最小浓度为：
ILTV＝0.02g/L IBDV＝0.001g/L APV＝0.08g/L
NDV＝0.02g/L
以上实验说明，本发明所述植物抗生素在鸡(鸭)胚成纤维细胞或在鸡(鸭)胚中具有抑制鸡新城疫病毒、鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡痘病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒的活性。
实施例6：本发明所述植物抗生素的体外抗IBV实验
材料：
病毒：鸡传染性支气管炎病毒(肾型SAIB K9，EID50＝105.45)
药物：实施例1-3制备的植物抗生素
鸡胚：9-10日龄健康鸡胚
方法：
将20g/l的植物抗生素用生理盐水从1∶2-1∶256作倍比稀释，各浓度再与稀释好的IBV病毒液(200个EID50)等体积混合。将混合液在室温作用1h后分别接种鸡胚，0.2ml/胚，每个浓度接4个胚。另外各接4个病毒液和生理盐水的对照。放37℃孵化箱培养。每天照胚2次，逐日观察，96h终止实验。以Reed-Muench公式计算半数保护浓度。结果如表1所示。
表1、本发明所述植物抗生素抗IBV感染实验结果
| 抗生素稀释度 | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.3125 | 0.156 | 0.078 | 0.039 | 0.0195 | 0.0098 | 0.0049 |
| 鸡胚死亡数 | 0/4 | 0/4 | 2/4 | 0/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 2/4 | 3/4 | 2/4 | 2/4 | 2/4 |
经计算植物抗生素对IBV感染鸡胚的半数保护量为：IC50＝2-5.259，即抗生素IC50浓度为：0.625g/l。
实施例7：本发明所述植物抗生素对单纯疱疹病毒体外抑制试验
1、实验材料：
受试药品：实施例1-3制备的植物抗生素，淡黄色液体，分别以微型注射器滤膜(孔径0.22u)作除菌过滤，置4℃冰箱保存备用。
病毒株：单纯疱疹病毒II型(以下简称HSV-II)，由中国预防医科院病毒所毒种室提供。
抗HSV-II血清：由预防医科院病毒所提供。
人胚肾原代细胞：来自水囊引产5月胎儿，取胎肾按常规方法，作胰蛋白酶冰消化，以营养液分散细胞、计数，每毫升约含40万个细胞，每管接种1.5ml，置37℃培养3-4日形成完整单层细胞，供实验用。
营养液：含10％小牛血清，加抗生素(青、链、庆大霉素)适量，用NaHCO3调PH7.0-7.2冰箱保存备用。
2、实验方法：
2.1药物对细胞毒性试验：取不同稀释浓度药物(100-6.25mg/ml)直接作用于人肾细胞(接种0.1ml)管中，逐日观察有无致细胞病变作用(CPE)，判定药物细胞毒性，以选择适当药物浓度，作实验观察。
2.2病毒Tc ID50测定：取HSV-II培养物，按10-1、10-2、......、10-7稀释，分别接种4管细胞，逐日观察CPE至72小时，判定病毒Tc ID50滴度，实验用100Tc ID50病毒量。
2.3药物抑制病毒增殖试验：取不同药物浓度，各管加100Tc ID50HSV-II混合置4℃冰箱过夜，次日分别接种4管人胚肾细胞(即每1药物浓度为4个重复)，37℃孵育，逐日观察有无CPE，至48-72小时，判断抑制病毒增殖的药物最低有效剂量。试验分设药物对照、细胞对照、抗HSV-II血清对照、病毒对照。
3、实验结果：
细胞毒试表明植物抗生素用6.66-0.415mg/ml不致产生细胞毒。药物抑制病毒增殖结果见表2。
表2植物抗生素在人胚肾细胞上抑制病毒增殖的作用
注：±疑有轻度细胞毒性；-表示正常细胞，+，++，+++，表示CPE程度
以上实验结果说明，本发明所述植物抗生素有抑制单纯疱疹II型病毒在人胚肾细胞上增殖的作用，植物抗生素最低抑制浓度为6.66mg/ml。
实施例8：本发明所述植物抗生素进行消毒灭菌实验
试验菌株：大肠杆菌8099第6代，军事医学科学院提供
试验菌株：金黄色葡萄球菌ATCC6538第5代，军事医学科学院提供
试验菌株：白色念珠菌ATCC10231第5代，军事医学科学院提供
中和剂：DIFCO
方法：
检测依据：《消毒技术规范》第三版第一分册第2.4.1.6及2.6.4.2
中和剂鉴定试验方法：实施例1-3制备的植物抗生素25％稀释液，杀菌时间为1min，中和时间10min，试验温度为20-22℃水浴，以上菌株各试验重复三次，采用载体浸泡定量杀菌试验中和剂鉴定试验法。
杀菌试验方法：试验温度为为20-22℃，以上菌株各试验重复三次，采用载体浸泡定量杀菌试验法。
中和剂鉴定试验结果如表3所示，显示在20-22℃水浴条件下，以上菌株各经重复试验三次，第3、4、5组间误差为1.14％，第6、7、8组均无菌生长。
表3、中和剂鉴定试验结果
杀菌试验结果：
在20-22℃水浴条件下，经三次重复试验结果证明，DIFCO在植物抗生素制剂对大肠杆菌载体浸泡定量杀菌试验中和剂鉴定试验中，可以有效中和该消毒剂25％稀释液的残留毒性，该中和剂及中产物对试验菌无毒性，对培养基无不良影响。
本发明所述植物抗生素制剂20％稀释液作用3min对大肠杆菌的平均杀灭率为99.93％(99.93％-99.94％)；15％稀释液作用10min对大肠杆菌的平均杀灭率为99.92％(99.91％-99.93％)，具体见表4。
表4、本发明所述植物抗生素对大肠杆菌的杀菌试验结果
注：阳性对照组平均菌落数为1.44×106cfu/片(1.2×106-1.44×106cfu/片)，阴性对照组均无菌生长
在20-22℃水浴条件下，经三次重复试验结果证明，植物抗生素制剂20％稀释液作用3min对金黄色葡萄球菌的平均杀灭率为99.92％(99.91％-99.93％)；15％稀释液作用10min对金黄色葡萄球菌的平均杀灭率为99.91％(99.9％1-99.92％)，具体见表5。
表5、本发明所述植物抗生素对金黄色葡萄球菌的杀菌试验结果
注：阳性对照组平均菌落数为1.15×106cfu/片(9.60×106-1.30×106cfu/片)阴性对照组均无菌生长
在20-22℃水浴条件下，经三次重复试验结果证明，DIFCO在植物抗生素制剂对白色念珠菌载体浸泡定量杀菌试验中和剂鉴定试验中，可以有效中和该消毒剂30％稀释液的残留毒性，该中和剂及中产物对试验菌无毒性，对培养基无不良影响。本发明所述植物抗生素制剂25％稀释液作用1min对白色念珠菌的平均杀灭率为99.91％；20％稀释液作用10min对大肠杆菌的平均杀灭率为99.93％。具体见表6。
表6、本发明所述植物抗生素对白色念珠菌的杀菌试验结果
注：阳性对照组平均菌落数为1.68×106cfu/片(1.4×106-2.10×106cfu/片)，阴性对照组均无菌生长。
实施例9：本发明植物抗生素进行消毒实验
试验菌株：手表面自然污染菌
采样液：DIFCO
检测依据：《消毒技术规范》第三版第一分册第2.11。
方法：实施例1-3制备的植物抗生素20％稀释液，采用表面擦试消毒法。消毒作用3min，左手为对照组，右手为试验组。试验人次为30人。试验环境室内温度23℃、相对湿度50％。
经对30人次手表面擦拭消毒重复试验结果证明，实施例1-3制备的植物抗生素的20％稀释液，作用3min对手自然菌的平均消除率均≥90.36、手上残留菌量均≤66cfu/手，见表7。
表7、手消毒现场试验结果
注：中和剂、PBS、培养基阴性对照均无菌生长。
实施例10：本发明植物抗生素进行病毒灭活实验
试验菌株：枯草杆菌黑色变种芽胞病毒(ATCC9372)，军事医学科学院提供，H1N1病毒，北大妇儿医学院提供。
中和剂：DIFCO
检测依据：《消毒技术规范》第三版第一分册第2.4.1.6及2.6.4.2。
中和剂鉴定试验方法：实施例1-3制备的植物抗生素，杀菌时间为5min，中和时间10min，试验温度为20-22℃水浴，试验各重复三次，采用载体浸泡定量杀菌试验中和剂鉴定试验法。
杀菌试验方法：试验温度为20-22℃，试验各重复三次，采用载体浸泡定量杀菌试验法。
中和剂鉴定试验结果显示，在20-22℃水浴条件下，经三次各重复试验结果证明，第3、4、5组间误差为2.47％，第6、7、8组均无菌生长。
表8、中和剂鉴定试验结果
在20-22℃水浴条件下，经三次各重复试验结果证明，DIFCO在植物抗生素制剂对枯草杆菌黑色变种芽胞病毒载体浸泡定量杀菌试验中和剂鉴定试验中，可以有效中和该病毒原液的残留毒性，该中和剂及中产物对试验菌无毒性，对培养基无不良影响。
杀菌试验结果见表9，显示本发明所述植物抗生素作用20min对枯草杆菌黑色变种芽胞病毒的平均杀灭率为90.15％，对H1N1病毒杀灭率为90.50％。并且该发明制剂针对口蹄疫、猪流感病毒均有一定的抑杀作用。
表9、杀菌试验结果
注：阳性对照组平均菌落数1.25×106cfu/片(9.00×105-1.64×106cfu/片)，阴性对照组均无菌生长。
实施例11：本发明所述植物抗生素微生物限度检验
检验依据：《中国药典》2005年版二部附录XIJ微生物限度检查法
标准规定：细菌数每1g不得过100个；霉菌、酵母菌数每1g不得过100个；铜绿假单胞菌每1g不得检出；金黄色葡萄球菌每1g不得检出。
供试液的制备：取实施例1-3制备的植物抗生素5g(供试液)，置于无菌锥形瓶中，于45℃恒温水浴中加入8ml无菌吐温-80或十四烷酸异丙酯，充分搅拌均匀后，缓慢加入预热至45℃的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至总体积100ml，边加边振摇使混匀振摇5～10分钟，呈白色乳液状作为1∶20供试液。
细菌数检查
离心沉淀集菌法：取1∶20供试液10ml至灭菌离心管中，3000转/分离心20分钟，弃上清，取底部的菌体悬液约1～2ml，全部加入无菌培养皿中，分别注入营养琼脂培养基约15ml，做2个平行皿，35℃培养48小时，观察结果，计数。
霉菌、酵母菌数：
离心沉淀集菌加薄膜过滤法：取1∶20供试液10ml至灭菌离心管中，3000转/分离心20分钟，弃上清，取底部的菌体悬液约1～2ml加至100ml含8％吐温-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液中，混匀，过滤，再用含8％吐温-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶液作为冲洗液冲洗滤膜，每次50ml，冲洗量500ml。抽干滤膜，取出，滤膜菌面朝上，贴于玫瑰红钠琼脂培养基平板上，做2个平行皿，25℃培养72小时，观察结果，计数。
铜绿假单胞菌检查：
取胆盐乳糖培养基2份，每份100ml，1份加入1∶20供试液10ml。另一份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于35℃培养24小时，再划线于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板，35℃培养24～48小时观察结果。
金黄色葡萄球菌检查：
取亚碲酸钠肉汤培养基2份，每份100ml，1份加入1∶20供试液10ml，另一份加入与供试液等量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作阴性对照，置35℃培养24小时，再划线于甘露醇氯化钠琼脂平板，35℃培养24～72小时，观察结果。
检验结果见表10-13。
表10、本发明所述植物抗生素制剂对细菌的微生物限度检验
表11、本发明所述植物抗生素制剂对霉菌、酵母菌的微生物限度检验
表12、本发明所述植物抗生素制剂对铜绿假单胞菌的微生物限度检验
表13、本发明所述植物抗生素制剂对金黄色葡萄球菌的微生物限度检验
注：“+”表示阳性或有菌生长；“-”表示阴性或无菌生长；“√”表示选择的项目或培养基。
以上结果显示，本品按《中国药典》2005年版二部附录XIJ微生物限度检查法检查，结果符合规定。本发明植物抗生素达到及优于中国药典规定及标准。目前市面销售的化学抗生素和中西合成产品外，尚未见纯中药制备的植物抗生素能达到于本发明植物抗生素相等水平指标的相关报到及市面销售流通的技术产品。
实施例12：本发明所述植物抗生素用于根管消毒的抗菌作用观察
受试对象：口腔内科门诊病人须作根管治疗者，只限于牙髓坏死和急、慢性根尖周炎等感染根管共35例，随机分成2组：实验组20人，对照组15人。
实验分组：
实验组：根管扩锉后使用10％的实施例1-3制备的植物抗生素冲洗根管，不必吸干，再用原液注入根管内，然后插入纸尖和放入浸有同样药液棉球于髓室内，ZOE封洞。封闭时间为5-7天。
对照组：FC为临床最常用的根管消毒药物。用常规药物冲洗后吸干根管，放入浸有FC的纸尖和棉球，ZOE封洞，封药时间同上。
细菌标本收集：根管消毒前和消毒后分别取细菌培养。细菌标本取样及培养、鉴定方法同根管冲洗实验。
实验结果：细菌检出率变化见表14-16。
表14、消毒前后细菌的检出率
表15、消毒前后平均菌株数变化
P＞0.1
表16、植物抗生素消毒前后主要致病菌的检出情况(％)
P＞0.1
2、菌落形成单位(CFU)的变化见表17-19。
表17、消毒前后平均CFU变化
| 组别 | 消毒前 | 消毒后 | 减少％ |
| 实验组 | 232.15±273.95 | 91.30±134.22 | 60.67 |
| 对照组 | 171.42±184.0 | 90.06±169.41 |
P＞0.1
表18、消毒前后CFU绝对值比较
| 组别 | 消毒前 | 消毒后 | 减少％ |
| 实验组 | 4209 | 1624 | 61.41 |
| 对照组 | 2032 | 1304 | 35.83 |
P＜0.001
表19、消毒前后主要病源菌的CFU组成比变化(％)
P＞0.02*为升高比例
本试验结果表明，用本发明所述植物抗生素消毒根管，封药后细菌检出率平均下降了45％，菌落形成单位(CFU)平均减少了60％左右，与临床最常用的根管消毒药FC比较，2组降低的程度无明显差别。这表明用中药植物抗生素消毒根管，其杀菌抑菌能力能够达到FC的效果。此外，该药优于FC的一大特性是，对人体无毒副作用，对根尖周组织无刺激性，而且使用方便，故可作为一种能够代替传统药物的理想根管消毒剂。
实施例13：本发明所述植物抗生素的稳定性试验
试验菌株：白色念珠菌ATCC 10231第5代，军事医学科学院提供
中和剂：DIFCO
检测依据：《消毒技术规范》第三版第一分册第2.6.4.2，试验方法：将实施例1-3制备的植物抗生素在37℃恒温存放90天后进行试验，杀菌试验浓度为27.5％。试验条件为20-22℃水浴，试验重复三次。
结果见表20，显示在20-22℃水浴条件下，经三次重复试验结果证明，植物抗生素制剂原液在37℃恒温存放90天后，27.5％稀释液作用1min对白色念珠菌的平均杀灭率为99.90％(99.90％-99.91)。
表20、本发明所述植物抗生素的稳定性试验结果
注：阳性对照组平均菌落数为1.26×106cfu/片(1.10×106-1.40×106cfu/片)，阴性对照组均无菌生长
以上结果显示，本发明植物抗生素制剂原液经37℃恒温存放90天后，对白色念珠菌的杀灭作用无影响。
实施例14：本发明的植物抗生素的安全性试验
本试验以家兔为对象观察了植物抗生素对皮肤单次和多次给药后的刺激性反应，以豚鼠为对象观察了植物抗生素的皮肤刺激性及皮肤过敏性反应，结果表明，受试药植物抗生素对皮肤未见有刺激性反应和过敏性反应。
1、材料
受试药物：实施例1-3制备的植物抗生素。
阳性对照药：抗生素，类白色软膏，28g/瓶。哈尔滨六厂，批号：11042。
动物：新西兰兔，普通级，体重2.0～2.5kg；豚鼠，普通级，体重250～300克，动物雌雄兼用。广西医科大学医学实验动物中心提供。实验动物生产许可证SCXK桂2003-0003，实验动物使用许可证：SYXK桂2003-0005。饲养条件：室温25±5℃，湿度60±20％。实验动物中心提供的饲料，自由摄食、饮水。
2、方法与结果
2.1皮肤刺激性试验
2.1.1正常皮肤给药刺激性试验
2.1.1.1单次给药
选用家兔12只，将兔背部脊柱右侧毛剪掉(以宠物剪PET CLIPPER剪毛)，面积约为4×4cm2。动物随机分为(1)空白对照组，(2)阳性对照组，(3)植物抗生素组。每组4只。剪毛24小时后对剪毛区观察有无损伤等异常，并开始给药。空白对照组家兔右侧剪毛区皮肤涂基质软膏1g，阳性对照组家兔右侧剪毛区皮肤涂阳性对照药抗生素1g；受试药植物抗生素组家兔右侧剪毛区皮肤涂受试药植物抗生素1g。给药后固定4小时，随后用蒸馏水除去残留药物。
给药后5、24、48、72小时，观察涂抹部位有无红斑、水肿等情况。按表21对皮肤刺激性反应进行评分，计算每一观察时间各组动物皮肤反应(红斑、水肿)积分的平均分值。按表22进行刺激强度评价。
结果表明，各给药组皮肤均未见红斑、水肿等皮肤刺激反应，积分的平均分值均为0，见表23。按表22进行刺激强度评价，表明受试药植物抗生素单次给药对正常皮肤无刺激性反应。
2.2.2多次给药
选用家兔12只，将兔背部脊柱右侧毛剪掉(以宠物剪PET CLIPPER剪毛)，面积约为4×4cm2。动物随机分为(1)空白对照组，(2)阳性对照组，(3)植物抗生素组。每组4只。剪毛24小时后对剪毛区观察有无损伤等异常，并开始给药。空白对照组家兔右侧剪毛区皮肤涂基质软膏1g，阳性对照组家兔右侧剪毛区皮肤涂阳性对照药抗生素1g；受试药植物抗生素组家兔右侧剪毛区皮肤涂受试药植物抗生素1g。每天给药2次，连续7天，给药后固定4小时，并用蒸馏水除去残留药物。
给药期间每天按表21对皮肤刺激性反应进行评分，并计算第2天至第7天每只动物皮肤红斑、水肿刺激反应的积分均值。末次给药后5、24、48、72小时，观察涂抹部位有无红斑、水肿等情况，按表21对皮肤刺激性反应进行评分，计算积分的平均值，按表22进行刺激强度评价，并取标本作病理组织学检查。
结果表明，连续给药7天，第2、3、4、5、6天每只动物皮肤红斑、水肿刺激反应的积分均值为0，见表24、续表24；末次给药后5、24、48、72小时肉眼观察各组家兔皮肤反应，均未见红斑、水肿等皮肤刺激反应，各组刺激反应积分的平均分值为0，见表25。按表22进行刺激强度评价，表明受试药植物抗生素多次给药对正常皮肤无刺激性反应。病理学观察结果表明，正常皮肤连续给药7天，未见受试药植物抗生素对正常皮肤造成明显的病理学改变。
表21皮肤刺激反应评分标准
表22皮肤刺激强度评价标准
表23植物抗生素单次给药对正常皮肤刺激反应积分的平均分值(n＝4)
表24植物抗生素多次给药每天刺激反应及积分均值(n＝4)
续表24植物抗生素多次给药每天刺激反应及积分均值(n＝4)
表25植物抗生素第7天末次给药后家兔正常皮肤刺激反应及积分均值(n＝4)
2.1.2破损皮肤给药刺激性试验
2.1.2.1单次给药
选用家兔12只，将兔背部脊柱左侧毛剪掉(以宠物剪PET CLIPPER剪毛)，面积约为4×4cm2。动物随机分为(1)空白对照组，(2)阳性对照组，(3)植物抗生素组。每组4只。各组每只家兔左侧皮肤用砂纸磨致渗血，作为破损皮肤刺激性试验组。分组后即开始给药，空白对照组家兔左侧剪毛区皮肤涂基质软膏1g，阳性对照组家兔左侧剪毛区皮肤涂阳性对照药抗生素1g；受试药植物抗生素组家兔左侧剪毛区皮肤涂受试药抗生素1g。给药后固定4小时，并用蒸馏水除去残留药物。
给药后5、24、48、72小时，观察涂抹部位有无红斑、水肿等情况。按表21对皮肤刺激性反应进行评分，计算每一观察时间各组动物皮肤反应(红斑、水肿)积分的平均分值。按表22进行刺激强度评价。
结果表明，各给药组破损皮肤均仍可见到损伤皮肤实验因素(砂纸磨擦皮肤)所致的局部反应，但未见给药因素引起的明显红斑、水肿等皮肤刺激反应，评分分值按表22皮肤刺激强度评价标准，虽然属轻度刺激性，但组间无明显差异，见表26。表明这一轻度刺激反应为损伤皮肤实验因素所引起。因此认为植物抗生素单次给药对破损皮肤无刺激性反应。
2.1.2.2多次给药
选用家兔12只，将兔背部脊柱左侧毛剪掉(以宠物剪PET CLIPPER剪毛)，面积约为4×4cm2。动物随机分为(1)基质对照组，(2)阳性对照组，(3)植物抗生素组。每组4只。各组每只家兔左侧皮肤用砂纸磨致渗血，作为破损皮肤刺激性试验组。分组后即开始给药，空白对照组家兔左侧剪毛区皮肤涂基质软膏1g，阳性对照组家兔左侧剪毛区皮肤涂阳性对照药抗生素1g；受试药植物抗生素组家兔左侧剪毛区皮肤涂受试药植物抗生素1g。每天给药2次，连续7天，给药后固定4小时，并用蒸馏水除去残留药物。
给药期间每天按表21对皮肤刺激性反应进行评分，并计算第2天至第6天每只动物皮肤红斑、水肿刺激反应的积分均值。末次给药后5、24、48、72小时，观察涂抹部位有无红斑、水肿等情况，按表21对皮肤刺激性反应进行评分，并计算积分的平均分值，按表22进行刺激强度评价，并取标本作病理组织学检查。
结果表明，连续给药7天，第2至第6天每只动物皮肤红斑、水肿刺激反应的积分均值组间比较未见明显差异，见表27、续表27。末次给药后5、24、48、72小时肉眼观察各组家兔皮肤反应，均未见红斑、水肿等皮肤刺激反应，各组刺激反应积分的平均分值为0，见表28；按表22进行刺激强度评价，表明受试药植物抗生素多次给药对破损皮肤无刺激性反应。病理学观察结果表明，连续给药7天，未见植物抗生素对破损皮肤造成明显的病理学改变。
表26植物抗生素单次给药对破损皮肤刺激反应积分的平均分值(n＝4)
表27植物抗生素多次给药破损皮肤每天刺激反应及积分均值(n＝4)
续表27植物抗生素多次给药每天破损皮肤每天刺激反应及积分均值(n＝4)
表28植物抗生素于第7天末次给药后破损皮肤刺激反应及积分均值(n＝4)
2.2皮肤过敏性试验
取豚鼠30只，将豚鼠背部两侧毛脱掉(以宠物剪PET CLIPPER剪毛)，每侧面积约3×3cm2，第二天随机分为空白对照组、阳性对照组、植物抗生素组。每组10只，雌雄各半。
空白对照组每只于脱毛区左侧涂基质软膏0.2g，阳性对照组每只豚鼠于脱毛区左侧涂1％2、4-二硝基氯苯0.2ml，植物抗生素组豚鼠于脱毛区左侧涂植物抗生素0.2g。涂药后用鼠固定器固定6小时。第7天和第14天以同样方法重复给药1次，共3次。
第28天在各豚鼠脱毛区右侧激发接触涂药1次，阳性对照组涂0.1％2、4-二硝基氯苯。激发后1小时、24小时、48小时观察皮肤红斑、水肿过敏反应情况，并按表29对红斑、水肿进行评分，将每只动物的红斑评分与水肿评分之和作为反应值，计算每组反应均值。并计算每组动物过敏反应发生率(将出现皮肤红斑或水肿的动物数除以受试动物数，即致敏率)。按表30评价致敏程度。
实验结果表明，阳性对照组经2、4-二硝基氯苯激发给药后，豚鼠皮肤明显出现红斑、水肿，致敏率为100％，空白对照组、植物抗生素组均无红斑、水肿，致敏率为0。结果表明植物抗生素未见皮肤过敏性反应。见表31。
表29皮肤过敏反应评分标准
表30皮肤过敏性评价标准
当过敏反应发生率为0时，可判为未见皮肤过敏反应。
表31植物抗生素对豚鼠皮肤过敏反应均值及致敏率(n＝10)
结果表明，受试药植物抗生素单次给药和多次给药对正常皮肤、破损皮肤均未见有刺激性反应，也未见皮肤过敏性反应。
实施例15：本发明的植物抗生素进行杀菌实验：
1、实验菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌
2、实验分组：
第1组：菌悬液→培养、第2组：制剂→培养、第3组：制剂→培养、第4组：制剂+菌悬液→培养、第5组：稀释液+菌悬液→培养、第6组：(菌悬液+水)+过滤冲洗处理→培养、第7组：(菌悬液+制剂)+过滤冲洗处理→培养，所述制剂为实施例1-3制备的植物抗生素原液用水稀释5倍。
一、实验方法：
第1、2、3组分别取菌悬液(10倍稀释)、制剂和灭菌水各1ml，加入无菌平皿内，每组3个平皿。立即加入冷却至40～45℃的熔化营养琼脂培养基每平皿15～20ml；置37℃培养箱培养48小时，计数菌落数。
第4、5组各取悬菌液0.5ml分别入两个试管中，分别加入制剂和稀释液4.5ml；混匀后，置室温5min，然后各取1ml加入无菌平皿内每组3个平皿。立即加入冷却至40～45℃的熔化营养琼脂培养基每平皿15～20ml；置37℃培养箱培养48小时，计数菌落数。
第6、7组各取悬菌液0.5ml分别两组试管中，分别加制剂和灭菌水4.5ml，置室温1min、2min、3min，每管立即用45ml稀释液稀释，然后用灭菌针头过滤器(滤膜直径50mm，孔径0.22um)过滤，滤毕，每组再用5ml稀释液冲洗过滤一次，最后用无菌镊子取出滤膜，将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置37℃培养箱培养48小时，计数菌落数，每组3个平皿。
二、试验结果：
第1组：菌落布满平板以，无法计数；后经稀释重新培养计数，得细菌悬液浓度为：大肠杆菌2X108、金黄色葡萄球菌2X108、痢疾杆3X108、绿脓杆菌4X1088。
第2、3、4组：无菌生长。第5、6组：菌落太多，无法计数。第7组：结果如表32。
表32.杀菌试验结果(第7组)：
抗杀真菌试验：
菌种：白色念珠菌、黑曲霉菌
分组：第1组：菌悬液→培养，第2组：制剂→培养，第3组：灭菌水→培养，第4组：制剂+菌悬液→培养，第5组：(菌悬液+水)+过滤冲洗处理→培养，第6组：(菌悬液+制剂)+过滤冲洗处理→培养
实验：
第1、2、3组分别取菌悬液(10倍稀释)、制剂和灭菌水各1ml，加入无菌平皿内，每组3个平皿，立即加入冷却至40～45℃的熔化沙堡琼脂培养基(麦芽浸膏琼脂培养基)每平皿15～20ml，白色念珠菌置37℃培养箱培养48小时(黑曲霉菌30℃培养72h)计数菌落数。
第4组取悬菌液0.5ml加入试管中，加制剂4.5ml，混匀后，置室温5min，然后取1ml加入无菌平皿内，共3个平皿。立即加入冷却至40～45℃的沙堡琼脂培养基或麦芽浸膏琼脂培养基，每平皿15～20ml，白色念菌置37℃培养箱培养48小时(黑曲霉菌30℃培养72h)计数菌落数。
第5、6组各取悬菌液0.5ml分别入两组试管中，分别加制剂和灭菌水4.5ml，置室温1ml、2min、5min，每管立即用45ml稀释液稀释，然后用灭菌针头过滤器(滤膜直径50mm，孔径0.22umm)过滤、滤毕，每组再加5ml灭菌冲洗过滤一次，最后用无菌镊子取出滤膜，将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，白色念珠置37℃培养箱培养48小时(黑曲霉菌30℃培养72h)，计数菌落数，每组3个平皿。
试验结果：
第1组：菌落布满平板，无法计数，后经稀释重新培养计数，得菌悬液浓度为：白色念珠菌2X107cfu/ml、黑曲霉菌2X107cfu/ml。
第2、3、4组：无菌生长。第5组：菌落太多，无法计数。第6组：结果如表33。
表33、杀真菌试验结果(第7组)：
实施例16：本发明所述植物抗生素急性经口毒性试验：
一、实验目的：检测一种利用中草药制备的植物抗生素制剂对试验动物的急性毒性作用和强度，为蓄积毒性和亚慢性毒性试验剂量选择的依据。
二、材料和方法：
1、样品来源：发明人提供
2、受试物：实施例1-3制备的植物抗生素
性状：淡黄色液体
3、样品前处理：受试物原液直接用于实验。
4、试验动物：壹级昆明种小鼠，20只，雌、雄各半，体重18-20克，由军事医学科学院实验动物中心提供。动物合格证号：医动字第01-3023号
5、实验动物饲养环境：室温21℃，相对湿度为50％RH，群笼饲养，5只/笼。
饲料来源：军事医学科学院实验动物中心，饲料合格证号：京动许字(2000)第031号。动物房合格证号：医动字第01-2071号。
6、试验方法：(一次最大限量法)
选健康成年小鼠20只，体重18-22克，雌、雄各半，剂量设计雌性为6000mg/kgBW，雄性为6000mg/kgBW，按0.1ml/10gBW经口灌胃给予受试物。
灌胃前动物禁食6小时，自由饮水。灌胃后正常饮食，观察二周，记录中毒体征及死亡情况。
三、试验结果：
表34、实验期间动物死亡情况
2、在14天的观察期内，动物无明显中毒体征，无死亡，尸检无异常。
雌性小鼠经口LD50为大于5000mg/kgBW。
雄性小鼠经口LD50为大于5000mg/kgBW。
四、结论：
根据《消毒技术规范》(2007)中急性毒性分级标准判定，皮肤消毒液急性经口毒性属实际无毒级。
实施例17：本发明所述植物抗生素急性皮肤刺激试验：
一、实验目的：检测植物抗生素对实验动物皮肤的刺激/腐蚀作用和强度。
二、材料和方法：
1、样品来源：发明人提供
2、受试物：名称：实施例1-3制备的植物抗生素
性状：淡黄色液体
3、样品前处理：受试物原液直接用于实验。
4、实验动物：壹级新西兰家兔，4只，雌性，体重2.0-2.5kg，由北京通利实验动物养殖场提供。动物合格证号：京动许字(2000)第024号
5、实验动物饲养环境：室温21℃，相对湿度为50％RH，单笼饲养。
饲料来源：军事医学科学院实验动物中心，饲料合格证号：京动许字(2000)第031号。动物房合格证号：医动字第01-2071号。
三、试验方法：
选用皮肤完好的健康家兔4只，于试验前24小时将其背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛面积左、右各约3cm×3cm。试验时取受试物0.2ml涂于2.5cm×2.5cm的二层纱布上，敷贴于一侧去毛皮肤表面，油纸覆盖，胶布固定。另一侧皮肤作为空白对照。封闭4小时后，去除覆盖物，并用温水清洗去残留受试物，于去除受试物后的1、24、48小时观察涂扶部位皮肤反应，并评分。
四、实验结果：实验动物皮肤刺激反应积分均值为0，对照皮肤刺激反积分为0，未见其它中毒体征。
表35、实验动物皮肤刺激反应
五、小结
根据《消毒技术规范》(2007)中皮肤刺激反应评分标准判定，一种利用中草药制备的植物抗生素对家兔皮肤无刺激性。
实施例18：本发明所述植物抗生素的眼刺激试验
一、实验目的：检测植物抗生素对实验动物眼睛的急性刺激和腐蚀作用。
二、材料和方法：
1、样品来源：发明人提供
2、受试物：名称：实施例1-3制备的植物抗生素
性状：淡黄色液体
3、样品前处理：受试物原液直接用于实验。
4、实验动物：壹级新西兰家兔，4只，雌性，体重2.0-2.5kg，由北京通利实验动物养殖场提供。动物合格证号：京动许字(2000)第024号
5、实验动物饲养环境：室温21℃，相对湿度为50％RH，单笼饲养。
饲料来源：军事医学科学院实验动物中心，饲料合格证号：京动许字(2000)第031号。动物房合格证号：医动字第01-2071号。
6、试验方法：
选用眼部健康家兔4只，取0.1ml滴在于一侧眼结膜囊内，实动闭合4秒钟，用生理盐水冲洗5分钟，另一侧作为正常对照。记录受试物后6、24、48小时、4天、7天家兔结膜、虹膜、和角膜的损伤和恢复情况。
三、实验结果：
试验期内，实验动物染毒后观察评分均为0，且未见其它中毒体征。
四、小结
根据《消毒技术规范》2007中皮肤刺激反应评分标准判定，一种利用中草药制备的植物抗生素对家兔眼结膜无刺激性。
表36、动物眼刺激试验结果
实施例19：本发明所述植物抗生素阴道粘膜刺激试验
一、实验目的：检测实施例1-3制备的植物抗生素对实验动物阴道粘膜的刺激作用和强度。
二、材料和方法：
1、样品来源：发明人提供
2、受试物：名称：实施例1-3制备的植物抗生素
性状：淡黄色液体
3、样品前处理：受试物原液直接用于实验。
4、实验动物：贰级种大鼠，18只，雌性，体重240-260g，由军事医学科学院实验动物中心提供。动物合格证号：京动许字99001
5、实验动物饲养环境：室温21℃，相对湿度为50％RH，群笼饲养，6只/笼。饲料来源：军事医学科学院实验动物中心，饲料合格证号：京动许字(2000)第031号。动物房合格证号：医动字第01-2071号。
6、试验方法：
试用动物检疫3天后，选用18只健康大鼠，随机分3组，每组各6只，分别为空白对照、赋形剂对照、受试物组。空白对照组不处理；赋形剂对照组用适当大小的灭菌棉条浸以灭菌重量盐水，受试物组长浸以受试物，分别置于动物阴道内，与阴道粘膜接触4小时，24小时后处死动物。取出局部阴道组织，观察病变情况。
三、试验结果：
表37、阴道粘膜刺激试验结果
四、小结
根据《消毒技术规范》(2007)中阴道粘膜刺激试验评分标准判定，植物抗生素对大鼠阴道粘膜无刺激性。
实施例20：本发明所述植物抗生素药理作用
实施例1-3制备的植物抗生素与现有化学抗生素消毒抑菌对照组综合疗效比较MIC(最低抑菌浓度)测定(按稀释比例浓度计)
表38、本发明所述植物抗生素与现有化学抗生素消毒抑菌效果比较
结果表明：
化学抗生素消毒剂和实施例1-3制备的植物抗生素制剂对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和白色念珠菌均有很强抗菌活性。抑制90％细菌生长的最低稀释浓度仅为1∶16、1∶32(即按1份凝胶剂加16份水或1份洗液加32份水稀释后仍能抑制90％的细菌生长)。
化学抗生素消毒剂和中药植物抗生素制剂的MIC(杀死95％以上最低抑菌浓度)测定
按稀释比例浓度计：化学抗生素消毒剂和中药植物抗生素制剂杀死95％以上的最低稀释浓度分别为：1∶32、1∶64。显示有很强的抑菌和杀灭作用。达到化学抗生素消毒剂水准，这在中药植物抗生素杀菌剂中是绝无仅有的，从而更好地发挥其疗效。
实施例21：本发明所述植物抗生素与现有植物抗生素综合疗效比较
参照现有技术申请号为200610044372.x的说明书制备植物抗生素作为对照组，与本发明实施例1-3制备的植物抗生素进行比较，结果见表39。
表39、本发明所述植物抗生素与现有组合物抗生素消毒抑菌效果比较
结果表明：
本发明所述植物抗生素针对霉菌性粘膜创面炎症愈显总有效率95.03％、真菌性粘膜创面炎症愈显总有效率95.39％。现有技术针对霉菌性粘膜创面炎症愈显总有效率75.44％、真菌性粘膜创面炎症愈显总有效率77.78％.该发明技术明显优于现有技术。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种植物抗生素，其特征在于，由以下方法制备：
将南瓜籽5-7重量份、油菜籽6.5-8.5重量份、木瓜籽3.8-5.5重量份、葡萄柚6.5-7.0重量份、甜橙7-8重量份、绿豆7.5-8重量份、栀子花6-9重量份、番石榴7.2-8.5重量份、黑芝麻5.5-9.5重量份、厚朴3.5-4重量份、生山楂5-5.5重量份、苏叶4.5-5重量份、松针7.5-9.5重量份、藿香3-3.5重量份与乙醇20-25重量份浸泡3天，过滤得乙醇滤液备用；滤渣加水40-45重量份煎煮4-5小时，过滤得一煎滤液，一煎滤渣加水20-25重量份煎3-4小时，过滤得二煎药液；
将乙醇药液和一煎滤液、二煎药液混合，静置3天，过滤后取滤液在60℃-70℃真空蒸馏3h，再于95℃-115℃真空蒸馏3h，收集各时段蒸馏液混合，静置后取上清液90℃-115℃真空蒸馏3.5h，得净化液，加入净化液重量16-20％的竹炭，在95℃-110℃真空蒸馏1h，收集蒸馏液即为植物抗生素。
2.根据权利要求1所述的植物抗生素，其特征在于，含酸量以绿原酸计，不少于0.4％；含酚量以愈创木酚计，不少于4.18％；pH值为2.0～4。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
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Owner name: FANG DONGYAN Free format text: FORMER OWNER: WANG GUILIN Effective date: 20130603 |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 511515 QINGYUAN, GUANGDONG PROVINCE TO: 510235 GUANGZHOU, GUANGDONG PROVINCE |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130603 Address after: 510235 Guangdong city of Guangzhou province Panyu District Qifuxincun Lake Villa No. 17 Patentee after: Fang Dongyan Address before: 511515 Department of medical affairs, Guang Qing hospital, thirty-three Chengdong new district, Guangdong, Qingyuan Patentee before: Wang Guilin |