CN102181529A - 一种检测牛瓜氨酸血症有害基因的方法及其专用引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测牛瓜氨酸血症有害基因的方法及其专用引物。本发明提供的检测瓜氨酸血症有害基因的引物组合物，包括序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3。采用本发明的专用引物对瓜氨酸血症(CN)有害基因的携带者和正常个体(非CN有害基因携带者)分别进行AS-PCR检测，实验证明：AS-PCR扩增分型结果和测序结果与预期没有偏差，说明特异性引物的扩增特异性很高，可以分辨单碱基变化；且内标条带也能够指示DNA和PCR体系质量，排除假阴性存在的可能性，说明本发明试剂盒检测CN有害基因的准确性很高。

Description

一种检测牛瓜氨酸血症有害基因的方法及其专用引物

技术领域

本发明涉及一种检测牛瓜氨酸血症有害基因的方法及其专用引物。

背景技术

随着人工授精和胚胎移植技术在奶牛育种中的应用，种质产品(个体、冻精、胚胎等)在世界范围内广泛流通，使得优秀公牛种质资源充分利用。但在获得优秀生产性能的同时，往往会将遗传疾病也进行扩散，尤其是常染色体隐性遗传疾病。

常染色体单基因隐性遗传病是由常染色体上的一对等位基因控制的，只有在该基因为隐性纯合的基因型时，个体才会患病。而隐性有害基因携带个体表型正常，但是其一旦与携带者交配，就会有0.25的可能性出现患病个体，而且携带者个体即使与正常个体交配，也会有0.5的可能性将有害基因传递给后代。这种特点导致它传播有害基因的几率非常大。一旦种用个体为常染色体有害基因的携带者，并且有良好的生产性能，在盲目追求提高生产性能的目的下，广泛利用其种用价值，就会导致有害基因的大面积扩散。

瓜氨酸血症(citrullinemia，CN)最早由Harper等在澳大利亚荷斯坦牛群中发现的一种常染色体单基因隐性遗传疾病。其分子遗传学基础是奶牛11号染色体(BTA11)上精氨酸合成酶(argininosuccinate synthetase，ASS)基因编码的第86个氨基酸密码子发生无义突变(CGA→TGA)，终止信号提前出现，从而使成隐性纯合个体ASS功能缺失(Dennis J A，Healy P J，Beaudet A L，et al.Molecular Definition of BovineArgininosuccinate Synthetase Deficiency.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America，1989，86：7947-7951.)。ASS参与肝脏的尿素循环，尿素循环受阻导致氨代谢障碍，使得血液中瓜氨酸浓度升高，个体产生氨中毒的现象。隐性纯合子犊牛一般在24小时内开始发病，出现精神沉郁、食欲下降、以头顶墙等逐渐加重的神经症状，最后死亡。病理学研究发现患病个体大脑皮层受到不同程度的损伤，犊牛从出生到发病再到死亡的全过程不超过一周(Harper P A W，Healy P J，Dennis J A.Animal Model of Human Disease-Citrullinemia(Argininosuccinate Synthetase Deficiency).American Journal of Pathology，1989，135：1213-1215；Healy P J，Harper P A W，Dennis J A.Bovine Citrullinaemia-A Clinical，Pathological，Biochemical and GeneticStudy.Australian Veterinary Journal l，1990，67：255-258.)。澳大利亚科学家通过系谱分析发现几乎所有CN患病犊牛都可以追溯到一个共同祖先-澳大利亚优秀种公牛Linmack CrissKing，其致病基因来自它的父亲Gray View Crisscross。Linmack Criss King公牛由于其女儿在乳脂率上的良好表现，其冻精在澳大利亚、新西兰等英联邦国家广泛使用，产生很多携带者后代(Healy PJ，Harper P A W，Dennis J A.Bovine Citrullinaemia-A Clinical，Pathological，Biochemical and Genetic Study.Australian Veterinary Journal l，1990，67：255-258；Healy P J，Dennis J A.，Camilleri L M，et al.Bovine Citrullinaemia Traced to the Sire of Linmack Kriss King.Australian VeterinaryJournal l，1991，68：155.)。

目前对CN的分子检测方法主要是PCR-RFLP，其主要内容是：1.围绕突变位点设计上下游引物，进行分析片段的扩增。2.利用限制性内切酶AvaII消化扩增片段。3.将消化好的片段进行琼脂糖电泳检测分型。如果原扩增片段不被AvaII消化成更小的片段，说明存在着有害基因。PCR-RFLP方法虽比较准确实用，但仍存在一定的假阳性，需要重复验证并结合系谱和测序结果进一步验证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种引物组合物。

本发明提供的检测瓜氨酸血症有害基因的引物组合物，包括序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3。

序列1所示的引物1由19个核苷酸组成，其对应于序列表中序列6所示的第66位-84位；其中序列1的第15位是碱基T、这样人为错配防止引物间配对用；序列1的第19位是碱基T，是对应序列6第84位的碱基C突变成的T。

序列2所示的引物2由17个核苷酸组成，其对应于序列表中序列6所示的第68位-84位；其中序列1的第13位是碱基T、这样人为错配防止引物间配对用。

进一步讲，上述瓜氨酸血症有害基因可以是精氨酸合成酶基因的第86个氨基酸密码子发生无义突变的基因，该有害基因的第4个外显子的核苷酸序列优选如序列表中序列6所示。

更进一步讲，上述引物组合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3组成。

在另一实施例中，上述引物组合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4和序列表中序列5所示的引物5组成，其中：所述引物4和引物5为一对内标引物。

上述引物1和引物3为整体包装、引物2和引物3为整体包装，或所述引物1、引物2和引物3分别单独包装。

优选地，上述引物1、引物2和引物3的摩尔比为1∶1∶2。

一种含有上述的引物组合物的试剂盒也属于本发明的保护范围之内。

上述的引物组合物或上述的试剂盒在检测牛瓜氨酸血症有害基因中的应用也属于本发明的保护范围之内。

上述应用是通过等位特异性PCR进行检测的，所述等位特异性PCR包括两轮PCR扩增。

上述两轮PCR扩增的1个PCR体系中引物1、引物3的终浓度均为0.4μmol/L；另1个PCR体系中引物2、引物3的终浓度均为0.4μmol/L。

本发明的试剂盒是采用等位特异性PCR的方法(AS-PCR)，它是一种比较简单的单碱基位点分型的方法，它通过根据突变位点设计两条3，末端与突变位点分别一致的特异性引物和突变点另一边的公共引物，特异性引物只能与3，末端碱基严格配对的模板结合，并扩增出相应产物，而不配对的模板不被扩增。这样通过两轮不同特应性引物的PCR扩增，就能知道模板链的碱基组成。从而对位点进行分型。本发明的试剂盒进行AS-PCR与PCR-RFLP结果比较，其结果更准确有效。

用本发明的试剂盒筛查荷斯坦奶牛瓜氨酸血症(CN)有害基因的携带者时，可以待测荷斯坦奶牛的基因组DNA为模板，利用特异性引物(其核苷酸序列分别为序列表中的序列1或序列2)和公共引物(其核苷酸序列分别为序列表中的序列3所示)进行2次PCR扩增，同时在PCR体系中加入一对内标引物(其核苷酸序列分别为序列表中的序列4和序列5所示)来扩增出一条内标条带，然后按照下述方法对AS-PCR结果进行2％琼脂糖电泳检测，结果分析：如果内标条带出现，说明PCR体系和模板没有问题。如果内标条带没出现，则更换PCR体系或模板，直到内标条带出现。然后看特异性引物的目的条带是否出现，如果出现表明突变位点的碱基与特异性引物3’末端的碱基一样，如果没有出现，就说明该位点与引物3’末端的碱基不符。

采用本发明的试剂盒对瓜氨酸血症(CN)有害基因的携带者和正常个体(非CN有害基因携带者)分别进行AS-PCR检测，实验证明：AS-PCR扩增分型结果和测序结果与预期没有偏差，说明特异性引物的扩增特异性很高，可以分辨单碱基变化；且内标条带也能够指示DNA和PCR体系质量，排除假阴性存在的可能性，说明本发明试剂盒检测CN有害基因的准确性很高。

本发明试剂盒的应用克服了上述PCR-RFLP检测方法存在的缺陷。具有操作更简便、快速；成本更低廉；准确性更高，更可靠、稳定；实用性更强，适合大规模应用的优点。

附图说明

图1为本发明的试剂盒进行检测的琼脂糖凝胶电泳结果。M表示Marker(依次为：600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，4、8、21为有害基因携带者(21和4的DNA样品一致)，其余21个为正常个体；图1-1的388bp目标条带是由引物序列1和序列3扩增，目标条带出现表明突变位点碱基为T，不出现碱基不为T；图1-2的386bp目标条带是由引物序列2和序列3扩增，目标条带出现表明突变位点碱基为C，不出现碱基不为C。157bp内标条带用于检测PCR体系和DNA模板是否存在问题，如1-1图中13内标条带弱，需要重新扩增，排除假阴性问题(模板和体系问题导致目标条带扩增不出来)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、利用检测瓜氨酸血症(CN)有害基因携带者的试剂盒筛查CN有害基因携带者

一、检测瓜氨酸血症有害基因携带者的试剂盒

检测瓜氨酸血症有害基因携带者的试剂盒包含PCR反应试剂、琼脂糖凝胶电泳试剂和溴化乙啶贮存液。

其中，PCR反应试剂包括：Taq DNA聚合酶(5U/μL)、10×PCR缓冲液(含Mg²⁺，15mmol/L)、dNTPs(4×2.5mmol/L)，其中，Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs均购自北京六合通经贸有限公司(TaKaRa产品代理商)，上述试剂的商品目录号为DR001B。每条引物的浓度均为20μmol/L。该引物是2条特异性引物、1条公共引物和1对内标引物，其中特异性引物为序列表中序列1和序列2所示的引物1和引物2；公共引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示；内标引物的正向引物的序列为序列表中序列4所示的核苷酸序列，反向引物的序列为序列表中序列5所示的核苷酸序列。

琼脂糖水平凝胶电泳试剂：50×TAE：Tris碱242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/LEDTA(pH＝8.0)100mL，加水充分溶解，定容至1L。

琼脂糖购自北京东胜泰博科技有限公司。

溴化乙啶贮存液：1g溴化乙啶溶于100mL蒸馏水中。

二、利用上述步骤一的试剂盒筛查荷斯坦奶牛CN有害基因携带者

1、精液DNA的提取

根据前期利用PCR-RFLP方法对参加青年公牛后裔测定和国家良种补贴项目的中国荷斯坦公牛进行的CN检测结果，选取21头正常公牛和2头CN有害基因携带者公牛的管制冻精用于提取基因组DNA，获得提取好的精液DNA。

2、AS-PCR扩增检测

AS-PCR扩增的特异性引物的序列为两个正向引物序列，分别为：AGC GCA CTG TACGAT GAC T(如序列表中序列1所示)和CGC ACT GTA CGA TGA CC(如序列表中序列2所示)，公共引物的序列(即反向引物序列)为：GCG GGA ACA TGG GAG AC(如序列表中序列3所示)。另外还有内标条带的引物，即内标引物，内标引物的正向引物序列为：TGC TTA TGG GAG AA6GG(如序列表中序列4所示)，内标引物的反向引物序列为：AGTTAA CCA CAC CAA ACG(如序列表中序列5所示)。上述引物均由英潍捷基公司合成。

采用上述步骤一的试剂盒进行2轮PCR扩增检测。2轮PCR扩增反应总体系均为20μL，其中精液的基因组DNA均大于50ng；一个PCR体系的加入上游特异性引物(引物1/引物2)和下游公共引物(引物3)各0.4μL(也即特异性引物和公共引物在一个PCR体系中的终浓度均为0.4μmol/L)，内标条带上下游引物各为0.8μL；四种dNTP1.6μL；Taq DNA聚合酶1.5U；10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μL。扩增条件为先94℃预变性5min；然后94℃30秒，55℃30秒，72℃30min，共35个循环；最后72℃延伸7min。

将PCR扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，对2头CN携带者ASS基因的2轮PCR扩增分别得到388bp和386bp的目的条带，并且同时都得到清晰的内标条带扩增产物。健康个体(21头正常公牛)的针对ASS基因的2轮PCR扩增，仅包含3’末端为C的特异性引物的扩增体系获得386bp的目的条带，而包含另一特异性引物的扩增体系未出现388bp的扩增产物，但是内标条带在两个体系中均出现。在实验中如果内标条带不出现，则说明DNA或PCR体系存在问题，要检测DNA样品和PCR试剂。直到能扩增出内标条带，比较着看目的条带的有无，来排除假阴性。

3、检测结果的序列分析

将上述步骤2中得到的2头CN携带者ASS基因的388bp和386bp的PCR扩增产物，以及其中3头正常个体ASS基因的386bp PCR产物进行序列分析。测序采用PCR产物直接测序的方法，由北京优博奥生物技术有限公司完成。测序结果表明388bpPCR产物显示ASS基因外显子4的第82位(即GenBank Accession Number NC_007309的自5′端第11484位)碱基为单碱基T(有害基因)，386bpPCR产物显示ASS基因外显子4的第82位(即GenBank Accession Number NC_007309的自5′端第11484位)碱基为单碱基C(正常基因)。当个体扩增出内标条带，并且通过2个PCR体系获得388和386bp两条时，则该个体为CN有害基因携带者(CT)。如果内标条带出现，但是只扩增出386bp的目的条带，那么该个体为正常个体(CC)。该测序结果与AS-PCR扩增结果一致。

综上通过测序进一步验证，可知AS-PCR扩增分型结果和测序结果与预期没有偏差，说明特异性引物的扩增特异性很高，可以分辨单碱基变化。而且，内标条带也能够指示DNA和PCR体系质量，排除假阴性存在的可能性。说明该试剂盒检测CN有害基因的准确性很高。并且操作简单，适合大规模应用。

Claims (10)

1.一种检测瓜氨酸血症有害基因的引物组合物，包括序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3。

2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述瓜氨酸血症有害基因是精氨酸合成酶基因的第86个氨基酸密码子发生无义突变的基因。

3.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2和序列表中序列3所示的引物3组成。

4.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物是由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4和序列表中序列5所示的引物5组成。

5.如权利要求1-4中任一所述的引物组合物，其特征在于：所述引物1和引物3为整体包装、引物2和引物3为整体包装，或所述引物1、引物2和引物3分别单独包装。

6.如权利要求1-5中任一所述的引物组合物，其特征在于：所述引物1、引物2和引物3的摩尔比为1∶1∶2。

7.一种含有权利要求1-6中任一所述的引物组合物的试剂盒。

8.权利要求1-6所述的引物组合物或权利要求7所述的试剂盒在检测所述瓜氨酸血症有害基因中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用是通过等位特异性PCR进行检测的，所述等位特异性PCR包括两轮PCR扩增。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述两轮PCR扩增的1个PCR体系中引物1、引物3的终浓度均为0.4μmol/L；另1个PCR体系中引物2、引物3的终浓度均为0.4μmol/L。

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