CN102178937B - 一种护肝益脾的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种护肝益脾的药物组合物，包括基质、ADH酶粉和ALDH酶粉，所述基质主要是由下列按重量份的原料制成：葛花或葛根200～260份、枳椇子100～140份、纳豆干粉20～30份。本发明能有效分解人体内的酒精，起到护肝益脾的作用。

Description

一种护肝益脾的药物组合物及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及一种护肝益脾的药物组合物及其制备方法。

【背景技术】

随着市场经济的发展，人们生活和消费水平的提高，饮用和接触酒精的饮料也逐渐增加，酗酒和酒精中毒者也屡见不鲜，严重影响了人们身心健康和家庭、社会的和谐与稳定。酒对人体具有广泛的药理作用，在饮酒人群中，酒精性疾病的发生也是呈上升趋势。酒精性肝硬化发病率已仅次于病毒性肝炎后肝硬化而居第二位，约占20％～30％。长期饮酒或一次性大量摄入酒类制品导致的急性酒精中毒及并发症者也不计其数，还可引起精神障碍、胃溃疡及脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化等多种疾病。饮酒对冠心病患者可诱发痉挛性心绞痛。饮酒可导致心肌病，慢性酗酒可引起高血压、心律失常、心衰竭及猝死。饮酒引起的充血性心肌疾病并发率高达21％～32％，而无症状的心脏异常发病率更高。如何解酒、醒酒以及减轻酒后反应及其对肝、心、肾、脾的损害，目前还没有较好的方法和药物。因此，对解酒、醒酒护肝心、益脾肾的制品和方法引起人们的极大关注。

酒精进入人体后，小部分经首过效应被降解，绝大部分经血液进入肝内进行代谢，代谢途径中经乙醇脱氢酶(Alcohol dehydronase，EC.1.1.1.1，缩写ADH)和乙醛脱氢酶(Acetal dehyde dehydrogenase，EC1.2.1.n，缩写ALDH)两个关键酶的降解，其途径如下：

产物乙酸，在有氧条件，进入三羧酸循环或其他途径，被彻底氧化成水和二氧化碳，同时释放能量。ADH为一种含金属锌的酶(Zn-酶)，作用依赖于辅酶I(NAD⁺)。ALDH作用需辅酶I(NAD⁺)或辅酶II(NADP⁺)的参与。

正常情况下，机体内的酶及其活力保持在一定水平，以维持机体的需要，但当饮酒多时，体内酶及其活力不足以使酒精分解，从而造成机体内有关器官和组织的损伤。此时增加酶量或提高酶活性，可以免除或减少它对机体危害。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种护肝益脾的药物组合物，能有效分解人体内的酒精，起到护肝益脾的作用。

上述目的通过以下技术方案实现：

一种护肝益脾的药物组合物，其特征在于，包括基质、ADH酶粉和ALDH酶粉，所述基质主要是由下列按重量份的原料制成：葛花或葛根200～260份、枳椇子100～140份、纳豆干粉20～30份。

进一步的方案是，所述基质主要是由下列按重量份的原料制成：葛花或葛根240份、枳椇子120份、纳豆干粉25份。

进一步的方案是，按重量份比，基质70～90份、ADH酶粉5～15份、ALDH酶粉5～15份；

进一步的方案是，ADH酶粉与ALDH酶粉的重量比为1∶1；其中，基质80份、ADH酶粉10份、ALDH酶粉10份。

进一步的方案是，和药学上可接受的载体制成胶囊剂或片剂或颗粒剂。

本发明的葛(puerialobeta(willa)ohni)花(根)，具解酒醒脾功能，常用于饮酒过度，头痛，头晕，烦渴，胸膈饱胀，呕吐酸水等伤及胃气之功效。枳椇子(Hovenia acerba lindl.)具有解酒毒，利小便，除烦渴之功效；纳豆(notto)含纳豆菌(Bacillus natto)和纳豆激酶(Nattokinase)等，现已证明具有溶栓作用，同时纳豆菌是一种益生菌，易在肠道内定置，具有解酒、除血糖、降脂等作用。

本发明在由以上配料制成的基质中混入ADH酶粉和ALDH酶粉，能更加有效分解人体内的酒精，起到护肝益脾的作用。

本发明还提供一种制备上述药物组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备基质：

101)称取葛花或葛根、枳椇子和纳豆干粉，备用；

102)将葛花或葛根、枳椇子分别洗净、烘干、粉碎，混合得混合粉，加入乙醇水溶液，于85℃～95℃回流提取4～6h，用200目尼龙布滤出提取液，残渣重新提取一次，合并滤液；滤液于85℃以下真空浓缩成浸膏；

103)将纳豆干粉加入所述浸膏，混匀，55℃以下烘干，粉碎过目筛，灭菌，无菌保贮，得基质备用；

2)将基质和ADH酶粉、ALDH酶粉混合制得所述药物组合物。

进一步的方案是，所述ADH酶粉通过以下步骤制备：

步骤102)中，乙醇水溶液的浓度为50％～70％，乙醇水溶液的体积与混合粉的体积的比值为7。

进一步的方案是，所述ADH酶粉通过以下步骤制备：

201)马铃薯浸汁制备：取去皮马铃薯A克，切成小块加水5A毫升，80℃浸泡1h后，用纱布过滤，取滤出液并用水定量至5A毫升，121℃灭菌20min，即得马铃薯浸汁备用，A＞0；

202)酿酒酵母斜面培养：采用斜面培养，取100B毫升上述马铃薯浸汁，加入2B克葡萄糖，煮沸后加入2B克琼脂，继续加热使琼脂熔化后，用水定量至100B毫升，分装入试管，制成斜面；加塞，包扎，121℃灭菌20min，冷却至室温后，于无菌条件下，将菌种酿酒酵母接种在斜面上，30℃恒温培养24h；B＞0；

203)种子菌培养：取上述马铃薯浸汁，然后按每100毫升马铃薯浸汁加入2克葡萄糖，再分装至锥形瓶，加塞，包扎，121℃灭菌20min，冷却至室温后，于无菌条件下，各接一接种环步骤202)所得的斜面培养菌种，30℃恒温120r/min摇瓶培养12h；

204)液体发酵：于锥形瓶中，加入上述马铃薯浸汁，然后按每100毫升马铃薯浸汁加入2克葡萄糖，121℃灭菌20min，冷却至室温后，于无菌条件下接种10ml的种子菌培养液，30℃恒温120r/min摇瓶发酵17h；

205)发酵液经4000r/min 15min、室温的离心收集细胞或过滤收集细胞，并用蒸馏水洗净，得酵母物；

206)称取酵母物，加入0.01mol/L、pH7.0的磷酸钾缓冲液，所述磷酸钾缓冲液内含0.01mol/L巯基乙醇和1mmol/L ZnCl₂，磷酸钾缓冲液的体积与酵母物的质量的比值为5～10，搅拌提取3h-5h，4000r/min-8000r/min、室温离心10min，取上清液；残渣重复提取一次，合并上清液；

207)采用双水相萃取纯化酶液：于合并上清液中加入相对分子质量17000-24000的聚乙二醇和磷酸氢二钾萃取，聚乙二醇的质量与上清液的体积的比值为6～12％，磷酸氢二钾的质量与上清液的体积的比值为8～16％；分层后，取上层酶液，对上述缓冲液透析24h以上，其间更换缓冲液3～4次；用聚乙二醇吸水浓缩或超过滤浓缩至原体的1/3左右，得酶的浓缩液，冻干，即得ADH酶粉。

进一步的方案是，所述ALDH酶粉通过以下方法制备：将绿豆洗净，包于纱布内，投入沸水中3～5min，取出，摊凉，转入搪瓷盆内摊平，加少量水，置培养箱内37～40℃催芽1～2d；待绿豆芽长至1-2cm长后，取出并用蒸馏水洗净；将绿豆芽置匀浆机中，加入预冷至5～10℃的0.01mol/LpH7.3～7.8磷酸钾缓冲液，所述磷酸钾缓冲液内含8mmol/L EDTA、0.01mol/L巯基乙醇和0.01mol/L KCl，所述磷酸钾缓冲液的体积与绿豆芽的质量的比值为5～10，匀浆，60目尼龙布过滤，滤液以4000r/min进行离心10～15min，收集上清液；于上清液中加固体硫酸铵至45％饱和度，于5～8℃低温置3～5h，离心，收集上清液；上清液对所述缓冲液透析12～24h，其间更换缓冲液2～3次；然后用聚乙二醇吸水浓缩或超过滤浓缩至原体积的1/3；冻干，得ALDH酶粉备用。

【具体实施方式】

实施例一

本发明护肝益脾胶囊通过以下步骤制备：

(1)基质制备

1.1、取2400g葛花(或根)、1200g枳椇子(材料在药店市售)分别洗净、烘干、粉碎，混合得混合粉，加入浓度为50％～70％的乙醇水溶液，乙醇水溶液的体积与混合粉的体积的比值为7，于85℃～95℃回流提取4～6h，用尼龙布(200目)滤出提取液，残渣重新提取一次，合并滤液；滤液于85℃以下真空浓缩成浸膏；

1.2、取250g纳豆干粉(本公司生产，许可证号：QS440425010226)加入由1.1中取得的浸膏，混匀，55℃以下烘干，粉碎过筛(60目)，灭菌，无菌保贮，得基质备用；

(2)ADH酶粉制备

2.1马铃薯浸汁制备：取去皮马铃薯200g，切成小块加水1000ml，80℃浸泡1h后，用纱布过滤，取滤出液并用水定量至1000ml，121℃灭菌20min，即得马铃薯浸汁备用；

2.2酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)斜面培养：采用斜面培养，取100ml上述马铃薯浸汁，加入2g葡萄糖，煮沸后加入2g琼脂，继续加热使琼脂熔化后，用水定量至100ml，分装入试管，制成斜面；加塞，包扎，121℃灭菌20min，冷却至室温后，于无菌条件下，将菌种酿酒酵母接种在斜面上，30℃恒温培养24h；

2.3种子菌培养：取上述马铃薯浸汁，每100ml马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，分装至250(100)ml锥形瓶，加塞，包扎，121℃灭菌20min，冷却至室温后，于无菌条件下，各接一接种环由步骤2.2所得的斜面培养菌种，30℃恒温摇瓶(120r/min)培养12h；

2.4液体发酵：于500ml锥形瓶中，加入300ml由马铃薯浸汁和葡萄糖构成的培养液(每100ml马铃薯浸汁加入2g葡萄糖)，121℃灭菌20min，冷却至室温后，无菌下接种10ml的种子菌培养液，30℃恒温摇瓶(120r/min)发酵17h；

2.5发酵液经离心(4000r/min 15min，室温)收集细胞或过滤收集细胞，并用蒸馏水洗净，得酵母物；

2.6称取酵母物，加入0.01mol/L、pH7.0的磷酸钾缓冲液(内含0.01mol/L巯基乙醇和1mmol/L ZnCl₂)，磷酸钾缓冲液的体积(ml)与酵母物的质量(g)的比值为5～10，搅拌提取3h-5h，离心(4000r/min-8000r/min，10min，室温)，取上清液；残渣重复提取一次，合并上清液；

2.7采用双水相萃取纯化酶液：于上清液中加入相对分子质量17000-24000的聚乙二醇(PEG)和磷酸氢二钾(K₂HPO₄)萃取，聚乙二醇的质量(g)与上清液的体积(ml)的比值为6～12％，磷酸氢二钾的质量(g)与上清液的体积(ml)的比值为8～16％；分层后，取上层酶液，对上述缓冲液透析24h以上，其间更换缓冲液3～4次；用PEG或超过滤浓缩至原体的1/3左右；取出酶的浓缩液，冻干，即得ADH酶粉；

2.8酶活力测定：于石英比色皿中加入pH8.0、0.05mol/L的Tri-Hcl3ml、17mol/L乙醇40uL、0.05mol/L NAD⁺40uL(用上述缓冲液制备)，于25℃水浴恒温恒定后，迅速加入0.1mL酶液(ADH酶粉加水组成，酶液中的ADH酶粉浓度对测试酶活力的结果不构成影响)，并以缓冲液为对照；在340nm波长下，每隔30S读一次数，共读3min，以A₃₄₀对时间(s)作图，计算出每分钟的A₃₄₀增加值(ΔA₃₄₀)。在上述条件下，每分钟340nm波长下，增加0.001光吸收单位的酶量为一个酶活力单位(U)。按下述计算酶活力单位：

U/ml＝ΔA₃₄₀×3.8/(3×0.001×0.1)

U/g酶＝U/mL×稀释倍数/酶质量

2.9蛋白含量的测定：按Bradford(1976)方法，并以牛血清蛋白为标准蛋白质。

(3)ALDH酶粉的制备

3.1制备：将绿豆(vigna radiata)洗净，包于纱布内，投入沸水中3-5min，取出，摊凉，转入搪瓷盆内摊平，加少量水，置培养箱(37～40℃)内催芽1～2d；待绿豆芽长至1～2cm长后，取出蒸馏水洗净；置匀浆机中，加入预冷(5～10℃)0.01mol/LpH7.3～7.8磷酸钾缓冲液(内含8mmol/L EDTA，0.01mol/L巯基乙醇和0.01mol/L KCl)，磷酸钾缓冲液的体积(ml)与绿豆芽的质量(g)的比值为5～10，匀浆，尼龙布(60目)过滤，滤液离心(4000r/min，10～15min)收集上清液；于上清液中加固体硫酸铵至45％饱和度，置低温(5～8℃)3～5h，离心(同上)，收集上清液；上清液对上述缓冲液透析12～24h，其间更换缓冲液2～3次；然后用PEG或超过滤浓缩至原体积的1/3；冻干，得ALDH酶粉备用；

3.2酶活性测定：于石英皿中加入pH7.3(或7.8)、0.01mol/L磷酸钾缓冲液(内含8mmol/L EDTA，0.01mol/L巯基乙醇和0.01mol/L KCl)1.95ml，0.015mol/L NAD⁺(或NADP⁺)溶液(以上述缓冲液配制)0.2ml，0.14mol/L四甲基吡唑(4-MP)溶液(以上述缓冲液配制)0.25ml，0.25ml酶液(ALDH酶粉加水组成，酶液中的ALDH酶粉浓度对测试酶活力的结果不构成影响)，于25℃保温恒定；加入同样保温的45％乙醛0.25ml，立即混匀，于340nm波长下，测定A值，每隔30u读次数，共读3min。对照加入质量体积比为0.1％的牛血清白蛋白(0.1克牛血清白蛋白加入100ml水)0.25ml，以代替酶液，其余同测定管。求出每分钟A₃₄₀的上升值(ΔA₃₄₀)。以每分钟催化产生1hmol的NADH(或NADPH)的酶量为1个酶活力单位(U)，以下式计算酶活力：

U/ml＝ΔA₃₄₀×2.9/(0.25×6.22)

U/g＝U/ml×稀释倍数/酶质量

3.3蛋白质含量测定：蛋白质含量测定按Bradford(1976)方法，并以牛血清白蛋白为标准蛋白质。

(4)制备

取上述经灭菌的基质，在洁净车间或无菌室内均匀混入ADH酶粉和ALDH酶粉得本发明药物组合物，按重量份比，基质占80份，ADH酶粉占10份，ALDH酶粉占10份。在实际生产中，制备ADH酶粉和ALDH酶粉的原料的质量很差，而导致本发明药物组合物中ADH活力和ALDH活力不足，影响本发明的效果，因此，本设计人建议先对制造出来的ADH酶粉和ALDH酶粉要按照上述测定方法测定，以使得：每本发明药物组合物0.5g，内含ADH活力和ALDH活力分别为15000～20000U和10～50U。如果所制造的ADH酶粉和ALDH酶粉达不到此要求，可得出原料的质量很差，就要换取原料来制备。

实施例二

本实施例与实施例一不同的是，取2600g葛花(或根)、1000g枳椇子和200g纳豆干粉制备基质。

实施例三

本实施例与实施例一不同的是，取2300g葛花(或根)、1400g枳椇子和300g纳豆干粉制备基质。

实施例四

本实施例与实施例一不同的是，在发明药物组合物中，按重量份比，基质占70份，ADH酶粉占15份，ALDH酶粉占15份。

实施例五

本实施例与实施例一不同的是，在发明药物组合物中，按重量份比，基质占90份，ADH酶粉占5份，ALDH酶粉占5份。

实施例六

本实施例与实施例一不同的是，在发明药物组合物中，按重量份比，基质占70份，ADH酶粉占20份，ALDH酶粉占10份。

实验例1：急性毒性实验

研究对象为SPF级小鼠20只，雄雌各半。采用经口最大耐受法试验，将本发明产品10g加纯净水20ml配制成50％浓度的样品，给予10g/kgBW(相当于本发明产品推荐剂量0.05g/kgBW的200倍)，经口灌胃0.2ml/10gBW，灌胃前停食12h，灌胃后4小时重复一次。观察14天，记录小鼠中毒症状及死亡情况。研究结果表明，小鼠活动正常，未发现异常症状。说明本发明产品食品毒性分级属无毒级物质。

实验例2：抗酒精性化学肝损伤实验

按每人每日服用3000mg的1倍、10倍、30倍设低、中、高三个本发明品剂量，即50、500、1500mg/kgBW，用蒸馏水按1∶2(质量体积比)比例配制；56°红星二锅头；雄性SPF级小鼠50只，分成阴性对照组、高、中、低剂量组和正常组，每组10只。

除正常组以外的4组小鼠每日禁食不禁水分别灌胃生理盐水、高、中、低剂量本发明产品，10min后，灌胃56°红星二锅头0.1ml/10gBW，连续给药一周。一周后将小鼠摘眼球取血，用全自动生化分析仪测定血清中的天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、甘油三脂(TG)。

结果：分析测定结果，与阴性对照组相比较，各给药组的AST、ALT、TG指标均显著下降，说明本发明产品能抑制饮酒后血液中的AST、ALT、TG上升，具有很好的抗酒精性化学肝损伤作用。

实验例3：解酒效果动物实验

按每人每日服用3000mg为基础设10、30、50mg/kgBW三个本发明产品剂量，用蒸馏水按1∶2(质量体积比)比例配制；56°红星二锅头；雄性SPF级小鼠40只，分成4组，每组10只。

4组小鼠全部用56°红星二锅头0.1ml/10gBW灌胃，然后立即分别按生理盐水、10、30、50mg/kgBW剂量灌药，记录醉酒只数和小鼠翻正反射消失时间及恢复时间，计算出耐受时间和醉酒维持时间。

结果：生理盐水对照组醉倒率为100％，平均7.5分钟翻正反射消失，平均维持时间为385分钟；灌胃本发明产品后的小鼠，高剂量组醉倒率为40％，平均65分钟翻正反射消失，平均维持时间为242分钟；中剂量组醉倒率为50％，平均47分钟翻正反射消失，平均维持时间为305分钟；低剂量组醉倒率为70％，平均16.5分钟翻正反射消失，平均维持时间为344分钟。结果表明本发明产品具有明显的解酒效果。

实验例4：解酒效果人体实验

成年健康男性30人，年龄22～53，随机分为2组：实验组和对照组。实验前一周正常饮食，禁止饮酒，身体状态良好。实验组饮酒前10～30分钟服用本发明产品2～3g，对照组不服用。然后每人饮用56°红星二锅头350ml，分别在饮酒后20min、1h、4h记录主观症状，如表1所示。

表1不同组别的成年健康男性饮酒后服用本发明产品的症状表

由上述表1可以看出：说明本发明产品解酒效果较好。

本发明不局限于上述实施例，基于上述实施例的、未做出创造性劳动的简单替换，应当属于本发明揭露的范围。

Claims (7)

1.一种护肝益脾的药物组合物，其特征在于，包括基质、ADH酶粉和ALDH酶粉，所述基质由下列按重量份的原料制成：葛花或葛根200～260份、枳椇子100～140份、纳豆干粉20～30份；按重量份比，基质70～90份、ADH酶粉5～15份、ALDH酶粉5～15份；所述基质通过以下步骤制备：101)称取葛花或葛根、枳椇子和纳豆干粉，备用；102)将葛花或葛根、枳椇子分别洗净、烘干、粉碎，混合得混合粉，加入乙醇水溶液，于85℃～95℃回流提取4～6h，滤出提取液，残渣重新提取一次，合并滤液；滤液于85℃以下真空浓缩成浸膏；103)将纳豆干粉加入所述浸膏，混匀，55℃以下烘干，粉碎过筛，灭菌，无菌保贮，得基质。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述基质由下列按重量份的原料制成：葛花或葛根240份、枳椇子120份、纳豆干粉25份。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，ADH酶粉与ALDH酶粉的重量比为1∶1。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，基质80份、ADH酶粉10份、ALDH酶粉10份。

5.根据权利要求1至4任一所述的药物组合物，其特征在于，和药学上可接受的载体制成胶囊剂或片剂或颗粒剂。

6.一种制备权利要求1所述的药物组合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备基质：

101)称取葛花或葛根、枳椇子和纳豆干粉，备用；

102)将葛花或葛根、枳椇子分别洗净、烘干、粉碎，混合得混合粉，加入乙醇水溶液，于85℃～95℃回流提取4～6h，滤出提取液，残渣重新提取一次，合并滤液；滤液于85℃以下真空浓缩成浸膏；

103)将纳豆干粉加入所述浸膏，混匀，55℃以下烘干，粉碎过筛，灭菌，无菌保贮，得基质备用；

2)将基质和ADH酶粉、ALDH酶粉混合制得所述药物组合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤102)中，乙醇水溶液的浓度为50％～70％，乙醇水溶液的体积与混合粉的体积的比值为7。