CN102175854A - 生脉注射液中微量蛋白的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生脉注射液中微量蛋白的测定方法，该方法包括：水提取醇沉淀法制备抗原；家兔免疫法制备抗生脉抗原血清并进一步纯化制备抗体；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定生脉注射液中的微量蛋白含量。本发明解决了生脉注射液中微量蛋白含量无法快速检测的难题，对提高生脉注射液产品的质量，防止临床过敏反应具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体是一种测定生脉注射液中微量蛋白的方法。
背景技术
生脉注射液是临床应用多年的中药注射剂，主要用于治疗感染性休克、心源性休克和心肌梗塞等。
生脉注射液临床不良反应包括:过敏性皮疹、接触过敏性皮炎、腹胀、低血压、心动过速等，其中过敏反应发生率最高。引起生脉注射液过敏反应的原因很多，而蛋白等大分子物质是主要的致敏原。目前，检测过敏反应的方法一般采用动物试验的方法，例如用豚鼠、大鼠试验等。但这类试验至少有2个缺陷：1.检测周期过长，不适于中间体的测定；2.灵敏度低，对产品中含有潜在致敏危险的微量蛋白无法检出。
鉴于以上情况，急需一种灵敏度高，可以快速测定生脉注射液中微量蛋白的方法，以监控生脉注射液生产过程中的质量，防止临床使用中的过敏反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度高，可以快速测定生脉注射液中微量蛋白的方法。
本发明的目的是通过采用以下技术方案来实现的：
具体地说，本发明采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定生脉注射液中微量蛋白的方法，操作步骤如下：
1.制备生脉抗原：取人参、麦冬、五味子适量，加水提取，过滤,滤液加入乙醇，收取沉淀物，冻干, 制得生脉抗原；
2.抗生脉抗原抗体的制备：用生脉抗原免疫家兔制备兔抗生脉抗原抗体；
3.酶联免疫吸附试验（ELISA）:采用酶联免疫吸附试验法测定生脉注射液中的微量蛋白。
生脉抗原的制备中，原药材人参、麦冬、五味子的质量比为10:32.1:15.6。
优选操作方法如下：
1.制备生脉抗原：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮回流提取，回流液过滤，滤液用乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原；
2.抗生脉抗原抗体的制备：抗原用完全福氏佐剂初次免疫后，用不完全佐剂新西兰兔足趾内或皮下多点注射，剂量以所含蛋白计为0.5-5mg/只。数次免疫后新西兰兔动脉采血，分离血清合并，封装，10-20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体；
3.酶联免疫吸附试验（ELISA）:
称取生脉抗原3mg-15mg，加包被液配制为2-50mg/ml储存液备用。用包被液将生脉抗原储存液倍比稀释为100μg/ml-2ug/ml浓度范围，100μl/孔包被在96孔聚乙烯酶标板上；待测生脉注射液每批号3孔以上，每孔100μl包被。4oC湿盒过夜；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗2-3遍，拍干；用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液溶液, pH 7.4 ) 封闭10-15分钟；弃去溶液，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清(一抗)1-3小时；弃去溶液；磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗，磷酸盐缓冲溶液稀释)避光室温孵育1-3小时；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加100μl 邻苯二胺/过氧化氢（OPD/H2O2）底物磷酸缓冲液，临用前10-15分钟配制：称取10-15mg邻苯二胺，用10-15ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色。显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490 nm 处记录吸收度。以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟。根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。
最佳操作方法如下：
1.制备生脉抗原：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮提取1-4小时，或回流10-180分钟，回流液过滤，滤液用45%-85%乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原。
2.抗生脉抗原抗体的制备：抗原用完全福氏佐剂配制，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行初次免疫，剂量以所含蛋白计为0.5-3mg/只。2-3周后用不完全福氏佐剂配制抗原，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行1-4次免疫，新西兰兔耳中动脉采血1-2ml，分离血清，测定抗体滴度，如果抗体稀释度小于10-5时，仍然呈现阳性反应，则一周后加强免疫一次，再一周后新西兰兔颈总动脉采血，分离血清合并，封装，20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体。
3.酶联免疫吸附试验（ELISA）:称取生脉抗原5mg-10mg，加包被液(0.05mol.L-1碳酸盐缓冲液，pH9.6)配制为5-20mg/ml储存液备用。用包被液将生脉抗原储存液倍比稀释为80μg/ml-10μg/ml浓度范围，100μl/孔包被在96孔聚乙烯酶标板上；待测生脉注射液每批号3孔以上，每孔100μl包被。4oC湿盒过夜；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗2遍，拍干；用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液溶液, pH 7.4 ) 封闭10分钟；弃去溶液，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清(一抗)2小时；弃去溶液；磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干；加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗，磷酸盐缓冲溶液稀释)避光室温孵育2小时；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干；加100μl 邻苯二胺/过氧化氢（OPD/H2O2）底物磷酸缓冲液，临用前10分钟配制：称取10mg邻苯二胺，用10ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色。显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm 处记录吸收度。以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟。根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。
生脉抗原系以生脉药材为原料，生产中醇沉工艺不彻底得到的残留物。由于醇沉工艺的主要目的是去除植物蛋白，得到的残留物又能与特异的Bradford蛋白反应试剂作用，提示制备的生脉抗原主要为残留的植物蛋白。经SDS电泳分析抗原是多种残留蛋白混合物。三味中药材中五味子抗原的蛋白含量最高，达到19.7%，红参次之约为8.0%，麦冬最少，仅为5.4%。生脉抗原的蛋白含量约为11.2%。
标准曲线的建立，检测限及定量限的确定:
以A490 nm值为横坐标，抗原浓度的对数值为纵坐标，非线性四参数回归方程为Y=(0.147-2.097)/(1+(x/16.247)1.238)+2.097，r2=0.999。在2.0-30.0 μg·mL-1呈明显线性, 分别按照阴性平均值+3倍标准偏差和阴性平均值+10倍标准偏差(n=12，重复次数=10) 计算方法的检测限和定量限约为0.566和1.431μg·mL-1（见表1）。由于所制备的生脉抗原的蛋白含量约为10%， 因此本发明对抗原活性杂质的检测限和定量限应低于0.566μg·ml–1和1.431μg·ml–1。
表1. ELISA检测法的检测限及定量限
检测含生脉中药注射液中抗原活性杂质的含量:
采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法对45批生脉注射液样本进行测定，样品中生脉抗原活性杂质含量较低，虽均在检测限以上，但在定量限以下。样本080927在本试验中抗原含量在检测限以下，用作阴性对照。
表2．45批生脉注射液样本的残留抗原含量（n=5）
残留在生脉水溶液组分中的植物蛋白等高分子杂质，既可以诱导机体产生抗体，又可以引发机体是速发型过敏反应。目前的“水煮醇沉”提取生脉水溶性组分的生产工艺, 不一定能保证彻底去除生脉抗原活性杂质, 因此在含生脉药材的中药注射剂中, 可能残留有生脉抗原活性杂质, 进而引起过敏反应。本发明建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)法可以用于指导企业的工艺改造,作为药品生产过程质量控制的有效方法。
在本发明技术方案中，所述生脉注射液为以人参、麦冬、五味子为原料制得的注射液，该产品为2007年、2008年、2009年上市抽检产品。
本发明技术方案中使用的仪器：酶标仪为Thermo公司产品；高速冷冻离心机为Eppendorf公司产品；电泳仪为BIORAD公司产品；YM210离心超滤管(其标示的截留相对分子质量为1万)为Millipore公司产品; 10kDa透析袋（Green Bird）购自上海星基公司；96孔酶标板为Genric bio公司生产。
试验动物：新西兰兔，4～5个月龄, 体重为2～3 kg, 雌雄不限,由西安市迪乐普生物资源开发有限公司提供；豚鼠，雄性，250-350g，由上海生旺实验动物养殖有限公司提供。
试验试剂：弗氏完全佐剂为Sigma公司产品；弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G为Cell Signaling公司产品；POD和BSA为生工生物技术有限公司产品；过氧化氢，硫酸氨，硫酸等其他化学试剂为国产分析纯试剂。
BCA蛋白定量试剂盒（#P008）和快速银染试剂盒（#P0017S）购自碧云天生物技术研究所；预染蛋白标准品(相对分子质量75000～13000)购自普利莱生物技术有限公司；30%聚丙烯酰胺溶液购自BIORAD。
本发明的有益效果是：相对于现有技术，本发明经过研究和大量的实验证明，该测定方法灵敏度高，可以快速测定生脉注射液中微量蛋白的含量，解决了现有技术中存在的不足，是一种评价生脉注射液生产质量的关键技术。本发明用于监控生脉注射液的生产过程，有助于稳定和提高产品质量，能够有效防止临床使用中的过敏反应。
具体实施方式
实施例1：
1.生脉抗原的制备：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子,轻微破碎, 水煮回流2 h, 过滤, 滤液用60%乙醇沉淀, 过滤，收集沉淀物，沉淀物用水复溶后冻干, 制得生脉抗原。采用BCA法,以牛血清白蛋白(BSA)制备标准曲线,测定生脉抗原中的蛋白含量。
2.抗生脉抗原抗体的制备：用生脉抗原免疫家兔制备兔抗生脉抗原血清。方法如下，抗原用完全福氏佐剂配制，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行初次免疫，剂量以所含蛋白计为1mg/只。3周后用不完全福氏佐剂配制抗原，同样进行第二次免疫。3周后用不完全佐剂配制抗原，进行第三次免疫，三次免疫后一周，耳中动脉采血1ml，分离血清，测定抗体滴度，判断抗体产生情况。如果抗体稀释度小于10-5时，仍然呈现阳性反应，则一周后加强免疫一次，再一周后颈总动脉采血，分离血清，将相同抗原的血清合并，分装，20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，抗生脉抗原抗体。
纯化免疫球蛋白G：取抗血清5mL加生理盐水5ml，加饱和硫酸铵溶液2.5ml至硫酸铵的饱和度为20%，4℃静置30分钟, 3000转离心20分钟，弃沉淀。取上清10ml加饱和硫酸铵溶液10ml至硫酸铵的饱和度为50%，4℃静置30分钟,3000转离心20分钟，弃上清液；沉淀溶于约10mL水中，再加饱和硫酸铵溶液5ml至硫酸铵的饱和度为33%，4℃静置30分钟，3000转离心20分钟，弃上清液，此步骤重复3次。沉淀溶于20ml生理盐水中, 装入透析袋; 以100倍的生理盐水为透析液，4℃透析24小时，其间更换2次透析液以去除硫酸铵。纯化后的抗体转移到适当的容器中，BSA法测定蛋白浓度，将纯化的抗体用生理盐水稀释成约1mg·mL-1，加入0.04% NaN3 溶液防腐，4℃储存备用。
3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析抗原：采用15%的聚丙烯酰胺凝胶，抗原样本用磷酸盐缓冲溶液配制为1mg/ml及10mg/ml浓度，5倍加上样缓冲液，煮沸5min，分别上样20ug，30ug，及100ug，电泳，银染检测。
4.酶联免疫吸附试验（ELISA）测定微量蛋白：称取生脉抗原10mg，将包被液(0.05 mol·L -1 碳酸盐缓冲液, pH 9.6)倍比稀释的生脉抗原包被在96孔聚乙烯酶标板上，4oC湿盒过夜，磷酸盐缓冲溶液洗2遍，用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液, pH 7.4 ) 封闭10分钟，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清(一抗)2小时，磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干，加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗)2小时，磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干，加100μl邻苯二胺/过氧化氢（OPD/H2O2）底物磷酸缓冲液，临用前10分钟配制：称取10mg邻苯二胺，用10ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色。显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm 处记录吸收度。以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟。根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。
实施例2：
1.生脉抗原的制备：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，轻微破碎, 水煮回流4 h, 过滤, 滤液用85%乙醇沉淀, 过滤，收集沉淀物，沉淀物用水复溶后冻干, 制得生脉抗原。采用BCA法,以牛血清白蛋白(BSA)制备标准曲线,测定生脉抗原中的蛋白含量。
2.抗生脉抗原抗体的制备：用生脉抗原免疫新西兰兔制备兔抗生脉抗原血清。方法如下，抗原用完全福氏佐剂配制，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行初次免疫，剂量以所含蛋白计为3mg/只。2周后用不完全福氏佐剂配制抗原，同样进行第二次免疫。2周后用不完全佐剂配制抗原，进行第三次免疫，三次免疫后一周，耳中动脉采血2ml，分离血清，测定抗体滴度，判断抗体产生情况。如果抗体稀释度小于10-5时，仍然呈现阳性反应，则一周后加强免疫一次，再一周后颈总动脉采血，分离血清，将相同抗原的血清合并，分装，15℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，抗生脉抗原抗体。
纯化免疫球蛋白G：取抗血清5mL加生理盐水5ml，加饱和硫酸铵溶液2.5ml至硫酸铵的饱和度为20%，4℃静置30分钟, 3000转离心20分钟，弃沉淀。取上清10ml加饱和硫酸铵溶液10ml至硫酸铵的饱和度为50%，4℃静置30分钟, 3000转离心20分钟，弃上清液；沉淀溶于约10mL水中，再加饱和硫酸铵溶液5ml至硫酸铵的饱和度为33%，4℃静置30分钟，3000转离心20分钟，弃上清液，此步骤重复3次。沉淀溶于20ml生理盐水中, 装入透析袋; 以100倍的生理盐水为透析液，4℃透析24小时，其间更换2次透析液以去除硫酸铵。纯化后的抗体转移到适当的容器中，BSA法测定蛋白浓度，将纯化的抗体用生理盐水稀释成约1mg·mL-1，加入0.04% NaN3 溶液防腐，4℃储存备用。
3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析抗原：采用15%的聚丙烯酰胺凝胶，抗原样本用磷酸盐缓冲溶液配制为1mg/ml及10mg/ml浓度，加5倍上样缓冲液，煮沸5min，分别上样20ug，30ug，及100ug，电泳，银染检测。
4.酶联免疫吸附试验（ELISA）测定微量蛋白：称取生脉抗原15mg，将包被液(0.05 mol·L -1 碳酸盐缓冲液, pH 9.6)倍比稀释的生脉抗原包被在96孔聚乙烯酶标板上，4oC湿盒过夜，磷酸盐缓冲溶液洗3遍，用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液, pH 7.4 ) 封闭15分钟，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清(一抗)3小时，磷酸盐缓冲溶液洗4遍，拍干，加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗)3小时，磷酸盐缓冲溶液洗4遍，拍干，加100μl邻苯二胺/过氧化氢（OPD/H2O2）底物磷酸缓冲液，临用前15分钟配制：称取15mg邻苯二胺，用15ml磷酸缓冲液溶解，临用前加15μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色。显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm 处记录吸收度。以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟，根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。
实施例3：
1.生脉抗原的制备：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，轻微破碎, 水煮回流1h, 过滤, 滤液用75%乙醇沉淀, 过滤，收集沉淀物，沉淀物用水复溶后冻干, 制得生脉抗原。采用BCA法,以牛血清白蛋白(BSA)制备标准曲线,测定生脉抗原中的蛋白含量。
2.抗生脉抗原抗体的制备：用生脉抗原免疫新西兰兔制备兔抗生脉抗原血清。方法如下，抗原用完全福氏佐剂配制，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行初次免疫，剂量以所含蛋白计为5mg/只。3周后用不完全福氏佐剂配制抗原，同样进行第二次免疫。3周后用不完全佐剂配制抗原，进行第三次免疫，三次免疫后一周，耳中动脉采血2ml，分离血清，测定抗体滴度，判断抗体产生情况。如果抗体稀释度小于10-5时，仍然呈现阳性反应，则一周后加强免疫一次，再一周后颈总动脉采血，分离血清，将相同抗原的血清合并，分装，10℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，抗生脉抗原抗体。
纯化免疫球蛋白G：取抗血清5mL加生理盐水5ml，加饱和硫酸铵溶液2.5ml至硫酸铵的饱和度为20%，4℃静置30分钟, 3000转离心20分钟，弃沉淀。取上清10ml加饱和硫酸铵溶液10ml至硫酸铵的饱和度为50%，4℃静置30分钟, 3000转离心20分钟，弃上清液；沉淀溶于约10mL水中，再加饱和硫酸铵溶液5ml至硫酸铵的饱和度为33%，4℃静置30分钟，3000转离心20分钟，弃上清液，此步骤重复3次。沉淀溶于20ml生理盐水中, 装入透析袋; 以100倍的生理盐水为透析液，4℃透析24小时，其间更换2次透析液以去除硫酸铵。纯化后的抗体转移到适当的容器中，BSA法测定蛋白浓度，将纯化的抗体用生理盐水稀释成约1mg·mL-1，加入0.04% NaN3 溶液防腐，4℃储存备用。
3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析抗原：采用15%的聚丙烯酰胺凝胶，抗原样本用磷酸盐缓冲溶液配制为1mg/ml及10mg/ml浓度，加5倍上样缓冲液，煮沸5min，分别上样20ug，30ug，及100ug，电泳，银染检测。
4.酶联免疫吸附试验（ELISA）测定微量蛋白：称取生脉抗原12mg，将包被液(0.05 mol·L -1 碳酸盐缓冲液, pH 9.6)倍比稀释的生脉抗原包被在96孔聚乙烯酶标板上，4oC湿盒过夜，磷酸盐缓冲溶液洗3遍，用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液, pH 7.4 ) 封闭12分钟，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清(一抗)3小时，磷酸盐缓冲溶液洗4遍，拍干，加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗)3小时，磷酸盐缓冲溶液洗4遍，拍干，加100μl邻苯二胺/过氧化氢（OPD/H2O2）底物磷酸缓冲液，临用前12分钟配制：称取12mg邻苯二胺，用12ml磷酸缓冲液溶解，临用前加12μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色。显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm 处记录吸收度。以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟。根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。
实施例4：
1.生脉抗原的制备：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，轻微破碎, 水煮回流3h, 过滤, 滤液用45%乙醇沉淀, 过滤，收集沉淀物，沉淀物用水复溶后冻干, 制得生脉抗原。采用BCA法,以牛血清白蛋白(BSA)制备标准曲线,测定生脉抗原中的蛋白含量。
2.抗生脉抗原抗体的制备：用生脉抗原免疫新西兰兔制备兔抗生脉抗原血清。方法如下，抗原用完全福氏佐剂配制，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行初次免疫，剂量以所含蛋白计为2mg/只。3周后用不完全福氏佐剂配制抗原，同样进行第二次免疫。3周后用不完全佐剂配制抗原，进行第三次免疫，三次免疫后一周，耳中动脉采血1ml，分离血清，测定抗体滴度，判断抗体产生情况。如果抗体稀释度小于10-5时，仍然呈现阳性反应，则一周后加强免疫一次，再一周后颈总动脉采血，分离血清，将相同抗原的血清合并，分装，20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，抗生脉抗原抗体。
纯化免疫球蛋白G：取抗血清5mL加生理盐水5ml，加饱和硫酸铵溶液2.5ml至硫酸铵的饱和度为20%，4℃静置30分钟, 3000转离心20分钟，弃沉淀。取上清10ml加饱和硫酸铵溶液10ml至硫酸铵的饱和度为50%，4℃静置30分钟, 3000转离心20分钟，弃上清液；沉淀溶于约10mL水中，再加饱和硫酸铵溶液5ml至硫酸铵的饱和度为33%，4℃静置30分钟，3000转离心20分钟，弃上清液，此步骤重复3次。沉淀溶于20ml生理盐水中, 装入透析袋; 以100倍的生理盐水为透析液，4℃透析24小时，其间更换2次透析液以去除硫酸铵。纯化后的抗体转移到适当的容器中，BSA法测定蛋白浓度，将纯化的抗体用生理盐水稀释成约1mg·mL-1，加入0.04% NaN3 溶液防腐，4℃储存备用。
3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析抗原：采用15%的聚丙烯酰胺凝胶，抗原样本用磷酸盐缓冲溶液配制为1mg/ml及10mg/ml浓度，加5倍上样缓冲液，煮沸5min，分别上样20ug，30ug，及100ug，电泳，银染检测。
4.酶联免疫吸附试验（ELISA）测定微量蛋白：称取生脉抗原8mg，将包被液(0.05 mol·L -1 碳酸盐缓冲液, pH 9.6)倍比稀释的生脉抗原包被在96孔聚乙烯酶标板上，4oC湿盒过夜，磷酸盐缓冲溶液洗2遍，用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液, pH 7.4 ) 封闭10分钟，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清(一抗)1小时，磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干，加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗)1小时，磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干，加100μl邻苯二胺/过氧化氢（OPD/H2O2）底物磷酸缓冲液，临用前10分钟配制：称取10mg邻苯二胺，用10ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色。显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm 处记录吸收度。以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟。根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。
实施例5：
1.生脉抗原的制备：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，轻微破碎, 水煮回流4h, 过滤, 滤液用80%乙醇沉淀, 过滤，收集沉淀物，沉淀物用水复溶后冻干, 制得生脉抗原。采用BCA法,以牛血清白蛋白(BSA)制备标准曲线,测定生脉抗原中的蛋白含量。
2.抗生脉抗原抗体的制备：用生脉抗原免疫新西兰兔制备兔抗生脉抗原血清。方法如下，抗原用完全福氏佐剂配制，新西兰兔足趾内或皮下多点注射进行初次免疫，剂量以所含蛋白计为0.5mg/只。3周后用不完全福氏佐剂配制抗原，同样进行第二次免疫。3周后用不完全佐剂配制抗原，进行第三次免疫，三次免疫后一周，耳中动脉采血2ml，分离血清，测定抗体滴度，判断抗体产生情况。如果抗体稀释度小于10-5时，仍然呈现阳性反应，则一周后加强免疫一次，再一周后颈总动脉采血，分离血清，将相同抗原的血清合并，分装，20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，抗生脉抗原抗体。
纯化免疫球蛋白G：取抗血清5mL加生理盐水5ml，加饱和硫酸铵溶液2.5ml至硫酸铵的饱和度为20%，4℃静置30分钟, 3000转离心20分钟，弃沉淀。取上清10ml加饱和硫酸铵溶液10ml至硫酸铵的饱和度为50%，4℃静置30分钟, 3000转离心20分钟，弃上清液；沉淀溶于约10mL水中，再加饱和硫酸铵溶液5ml至硫酸铵的饱和度为33%，4℃静置30分钟，3000转离心20分钟，弃上清液，此步骤重复3次。沉淀溶于20ml生理盐水中, 装入透析袋; 以100倍的生理盐水为透析液，4℃透析24小时，其间更换2次透析液以去除硫酸铵。纯化后的抗体转移到适当的容器中，BSA法测定蛋白浓度，将纯化的抗体用生理盐水稀释成约1mg·mL-1，加入0.04% NaN3 溶液防腐，4℃储存备用。
3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析抗原：采用15%的聚丙烯酰胺凝胶，抗原样本用磷酸盐缓冲溶液配制为1mg/ml及10mg/ml浓度，加5倍上样缓冲液，煮沸5min，分别上样20ug，30ug，及100ug，电泳，银染检测。
4.酶联免疫吸附试验（ELISA）测定微量蛋白：称取生脉抗原3mg，将包被液(0.05 mol·L -1 碳酸盐缓冲液, pH 9.6)倍比稀释的生脉抗原包被在96孔聚乙烯酶标板上，4oC湿盒过夜，磷酸盐缓冲溶液洗3遍，用5%小牛血清溶液(溶剂为磷酸盐缓冲溶液, pH 7.4 ) 封闭15分钟，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清(一抗)3小时，磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干，加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液(二抗)3小时，磷酸盐缓冲溶液洗5遍，拍干，加100μl邻苯二胺/过氧化氢（OPD/H2O2）底物磷酸缓冲液，临用前10分钟配制：称取10mg邻苯二胺，用10ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色。显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490nm 处记录吸收度。以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟。根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。
实施例6：
豚鼠被动皮肤过敏( PCA) 试验：
1.取豚鼠背部脱毛，同时配制兔抗原血清的生理盐水稀释液(1：2、1：8、1：32、1：64)备用。每只豚鼠于脱毛处皮内注射上述血清，每点注射0.1ml，共4点(脊柱两侧)。
2.兔生脉抗血清备。
3.15-24小时后，静脉注射抗原1ml／只，浓度0.5-100ug/ml，混合液中伊文思蓝浓度为0.5％ ，30分后将动物处死，摘出背部皮肤，观察皮肤内侧有无蓝斑。
抗原用0.5%伊文思兰生理盐水配制。
表3生脉及药材抗原检出结果
| 最低检测出的浓度 | 未检测出的浓度 | |
| 生脉抗原 | 10μg/ml,最高浓度有蓝斑 | 5μg/ml |
豚鼠PCA反应证明从生脉中制备的抗原活性杂质在10mg/ml 剂量即具有引发被动过敏反应的能力。生脉抗原用酶联免疫吸附试验（ELISA）法的检测限为0.566mg/ml之间。
本发明所要求保护的范围并不限于上述实施例所表达的具体技术方案以及上述技术方案的组合。
Claims (4)
1.一种生脉注射液中微量蛋白的测定方法，包括如下操作步骤：
（1）制备生脉抗原：取质量比为10:32.1:15.6的原料药人参、麦冬、五味子，水煮回流提取，回流液过滤，滤液用乙醇沉淀，过滤，收集沉淀物，沉淀物水复溶后冻干，即得生脉抗原；
（2）抗生脉抗原抗体的制备：抗原用完全福氏佐剂初次免疫后，用不完全佐剂新西兰兔足趾内或皮下多点注射，剂量以所含蛋白计为0.5-5mg/只；数次免疫后新西兰兔动脉采血，分离血清合并，封装，10-20℃冻存，用于纯化免疫球蛋白G，制得抗生脉抗原抗体；
（3）酶联免疫吸附试验:称取生脉抗原3mg-15mg，加包被液配制为2-50mg/ml储存液备用；用包被液将生脉抗原储存液倍比稀释为100μg/ml - 2ug/ml浓度范围，100μl/孔包被在96孔聚乙烯酶标板上；待测生脉注射液每批号3孔以上，每孔100μl包被；
4oC湿盒过夜；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗2-3遍，拍干；用5%小牛血清溶液封闭10-15分钟；弃去溶液，加入100μl 1∶100稀释的兔抗生脉血清1-3小时；弃去溶液；磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加入100μl 1：3000辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G溶液避光室温孵育1-3小时；弃去溶液，磷酸盐缓冲溶液洗4-5遍，拍干；加100μl邻苯二胺/过氧化氢底物磷酸缓冲液，临用前10-15分钟配制：称取10-15mg邻苯二胺，用10-15ml磷酸缓冲液溶解，临用前加10μl过氧化氢，混匀，每孔加100μl进行显色；
显色适当后，加100μl的2mol·L硫酸终止反应，用酶标仪在490 nm 处记录吸收度；
以log浓度对吸收度做非线性模拟曲线，然后选择适当的线性范围做线形模拟，根据标准曲线计算待测样本的抗原含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述步骤（1）水煮提取1-4小时，所用乙醇浓度为45-85%。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述步骤（1）回流10-180分钟，所用乙醇浓度为45-85%。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述步骤（2）新西兰兔足趾内或皮下注射免疫，剂量以所含蛋白计为0.5-3mg/只。
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