CN102174452A

CN102174452A - 一种原油降解海洋微生物的筛选改造方法

Info

Publication number: CN102174452A
Application number: CN 201110066870
Authority: CN
Inventors: 李明; 石博文; 唐莉; 程子洪; 张星; 林载祁; 黄琦
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2011-03-18
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明涉及一种原油降解海洋链霉菌的筛选改造方法，属于生物工程技术领域。其特征是分离筛选出的具有原油降解能力的“土著”微生物，以分子生物学方法将邻苯二酚2，3-双加氧酶转化入其体内，达到高效表达；经检测该菌株在含油5g/L的原油-无机盐培养液中培养15天的原油降解率达62.9％，且对氮磷营养盐的依赖性相对其它菌株较小，因此是石油降解优势菌株。该菌株在廉价的豆粉培养基中生长良好，具有大规模固体发酵从而投放入原油污染海域进行海洋修复的潜力。

Description

一种原油降解海洋微生物的筛选改造方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及对一种原油降解海洋微生物的筛选和生物工程改造。

背景技术

海洋石油污染是目前世界性的严重的海洋环境问题之一。2010年7月16日，大连新港附近一条输油管道发生爆炸起火，海面上原油泄漏重灾区达11平方公里，轻灾区50平方公里，受影响面积将达到183平方公里。大连新港位于辽东半岛南端的大孤山东北麓，黄海岸边的大窑湾西南侧，是我国目前规模最大、水位最深的现代化深水油港。漏油事件之后曾经绮丽迷人的黄金海岸现随处可见大片的油污带，黑色原油污染触目惊心。大面积漏油不但会引起许多急性伤害，如海洋动植物的死亡等，更会对环境和健康造成长期的威胁。尤其是各种持久性有机污染物(POPs)，如多环芳烃。POPs具有高毒性，持久性，积聚性和流动性大等特点。可以通过食物链而富集到较大的和高端的生物体内。一方面，毒物富集后可能杀死这些生物；另一方面。这些生物如果成为海产品供人食用，危害人的肝、肠、肾、胃等，使人体组织细胞突变致癌。

当前，清除泄漏原油的方式主要有三种，即物理方法、化学方法和生物降解法。相比物理和化学添加剂等方法，生物降解法具有很大优势。首先是微生物资源丰富。根据现有的资料显示，能降解石油的微生物共有约70个属，其中细菌28个属，丝状真菌30个属，酵母12个属，共200多种微生物。海洋中的主要降解细菌有无色杆菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属等；主要的降解真菌有金色担子菌属、假丝酵母属等。其次，污染物可以在原地被降解，对环境干扰较少，成本低且无二次污染。因此，利用海洋环境中的天然微生物降解烃类物质的能力来清除海上的石油污染是一种可行的有效方法。

但是，当前国内外许多相关的研究大多是在油田等石油资源丰富的地区分离纯化出的微生物。不同的石油组分和不同环境微生物对降解效率的影响很大，引入外来微生物有可能不适应环境而影响降解效率，还很可能使外来物种入侵转变成为强势物种从而造成原有生态环境的失衡。在本地筛选出的‘土著’原油降解微生物往往降解效率较低，且许多微生物的生长依赖氮、磷等营养盐的添加，而氮、磷的加入会对水体造成富营养化，形成二次污染。此外，还有许多原油降解微生物不能利用廉价原料大规模发酵从而投放入被污染环境进行生物修复，从而制约了其作为优势菌株的进一步发展。

本发明就是针对大连本地‘土著’原油降解微生物降解效率不高、依赖氮磷，且难以大规模发酵投放入海洋环境这一问题，通过科学的方法驯化，筛选出高效原油降解菌，并结合分子生物学手段对其进行了生物工程改造，提高了降解活性。为进一步的发展大规模发酵工艺，优化条件，模拟海洋修复实验提供依据。

发明内容

本发明提供了一种原油降解海洋微生物的筛选改造方法。

本发明的技术方案如下：

(1)筛选：取一定量的海泥混合海水，接入原油-无机盐培养液中富集培养。所述的原油-无机盐培养液成份如下：NH₄NO₃：1g，K₂HPO₄：1g，MgSO₄：0.1g，FePO₄：痕量，原油：5g，经0.2pm微孔滤膜除菌，陈海水：1000mL，pH：7.2。在30℃，220r.p.m培养两周后，将富集培养液按10倍稀释法稀释至10^-4～10^-6倍。采用原油-无机盐培养液中加入2％的琼脂作为含油固体培养基，取稀释后培养液0.1mL涂布于含油固体培养基，在30℃恒温培养，每个浓度设2个重复。恒温培养48h后，选取优势、不同颜色及形态的单菌落原油降解微生物。在油平板上划线分离纯化，以得到形态一致的单菌落。采用紫外分光光度法对它们的原油降解能力进行测定，选出降解率高的优势菌株添加氮磷营养盐，筛选出对氮磷营养盐依赖性相对较小的菌株。

(2)基因工程改造：将编码邻苯二酚2，3双加氧酶的基因xylE构建到载体上，再转化入筛选出的原油降解微生物中，使邻苯二酚2，3双加氧酶得到高效表达。其步骤如下：

第一步：使用的邻苯二酚2，3-双加氧酶基因xylE，其基因来自于质粒PIJ4083；

第二步：将xylE连接到高效表达载体pWHM3上，pWHM3含有链霉菌适用的强启动子ermE*p，该质粒是大肠杆菌-链霉菌穿梭型高拷贝质粒。

第三步：将构建好的pWHM3-xylE转化入微生物体内。是以原生质体转化的方式，在转化过程中加入0.4M的蔗糖作为渗透压稳定剂。

本发明的原油降解海洋微生物S9-xylE，经16S rRNA基因序列比较，初步鉴定为链霉菌Streptomyces sp.。该菌株适宜生长pH范围为5.0-9.0，适宜生长温度范围为20-40℃；其形态特征：在豆粉培养基(MS)(甘露醇20g，大豆粉20g，水1000mL)中，30℃，220r.p.m培养7天后，呈棕色，有絮状菌丝团形成，显微镜下观察菌丝末端有椭圆形孢子形成。在MS固体培养基上(液体MS每升加20g琼脂)，30℃下培养7天后，表面有褶皱，边缘不整齐呈放射状；有气生菌丝产生。该菌株在含油5g/L的原油-无机盐培养液中培养15天的原油降解率达62.9％，且对氮磷营养盐的依赖性相对较小。

本发明的有益效果是所提供的原油降解链霉菌S9-xylE以大连新港筛选出的‘土著’原油降解微生物为前身，经生物工程改造后具有高效降解原油的能力，其培养过程中对氮磷营养盐的依赖型较小且可利用廉价原料进行大规模发酵，对大连海域海洋生态无害，在原油污染修复方面有着广阔的应用潜力。

附图说明

图1是氮磷添加对原油降解微生物石油降解率的影响效果图。

图2是S9和S9-xylE对邻苯二酚的催化效果对比图。

图3是S9和S9-xylE对原油的降解效率对比图。

图1中

表示未添加氮磷营养盐时的降解效率；■表示添加氮磷营养盐后的降解效率。图2中

表示S9菌株对邻苯二酚的催化效果；■表示S9-xylE对邻苯二酚的催化效果。图3中

表示S9菌株的原油降解率；■表示S9-xylE的原油降解率。

具体实施方式

下面结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。

本发明所述的原油降解微生物的分离步骤如下：在在大连新港附近取一定量的海泥混合海水，接入100mL原油-无机盐培养液(NH₄NO₃：1g，K₂HPO₄：1g，MgSO₄：0.1g，FePO₄：痕量，原油：5g，经0.2pm微孔滤膜除菌，陈海水：1000mL，pH：7.2)中，于30℃，220r.p.m摇床培养两周；然后，取一定量的上述富集培养液接100mL新鲜培养液中，再次于30℃，220r.p.m摇床培养两周；采用稀释平板法分离石油降解菌。将富集培养液按10倍稀释法稀释，取10^-4～10^-6倍培养液各0.1mL涂布于含油固体培养基上(原油-无机盐培养液中加入2％的琼脂)，置于30℃恒温培养箱内培养，每个浓度设2个重复。恒温培养24h后，观察菌株生长情况。待平板上长出菌落时，选取优势、不同颜色及形态的单菌落，在油平板上多次划线分离纯化，以得到形态一致的单菌落。将纯化菌株接种于试管斜面培养基后保存于4℃冰箱。经富集、纯化筛选出10株原油降解微生物，分别命名为S1-S10。

将S1-S10分别接种于原油-无机盐培养液中，采用紫外分光光度法对培养5天、10天和15天的原油降解率进行检测。使用波长254nm测定样品的吸光度，石油降解率＝(对照吸光度-培养液吸光度)/对照吸光度×100％。对照吸光度为培养前(0天)的样品吸光度。其结果如表1所示：

表1分离菌株的原油降解效率和16S rRNA序列同源性比较

微生物的种类鉴定：首先按形态和培养特征初步鉴定到类群，然后进行16SrRNA序列分析：以新鲜单克隆菌体为模板，采用16S rRNA通用引物(F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3’；R：5’-AAGGAGGTGATCCACCCGAC-3’)进行扩增。25μL PCR反应体系组成如表2所示。PCR反应条件如表3所示。

表2PCR反应体系

表3PCR反应条件

取PCR产物5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测，用琼脂糖凝胶纯化试剂盒(大连宝生物工程公司TaKaRa)切胶回收PCR产物，将PCR产物克隆到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞。通过Blast程序进行同源性比较后，同源性最高的菌属和相似度百分比分别列于表1中。S9的16SrDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

氮磷的添加对石油降解率的影响：在陈海水中加入氮源、磷源，其成分分别为(NH₄)₂SO₄和KH₂PO₄，N、P元素浓度分别为85mg/mL和15mg/mL。将S1-S10分别接种于含油海水或添加氮磷的含油海水中，培养15天后的原油降解情况如图1所示，大部分微生物在添加氮、磷的海水中的降解能力明显提高(培养15天后)，但也有少数菌株(如S2，S5和S9)受氮磷影响较小。

对S9进行生物工程改造：石油污染物中的芳烃类化合物是较强的致癌物质之一，对人体危害极大。在这些芳烃类的生物降解过程中，一系列的加氧酶/羟化酶起着最重要的作用，其中包括了单加氧酶和双加氧酶等。邻苯二酚是许多芳烃类化合物代谢的中间产物。邻苯二酚2，3-双加氧酶存在于一些能分解芳香族化合物的细菌中，它能催化苯环的邻位裂解，将邻苯二酚转变成2-羟粘糠酸半醛(HMS)。因此，应用分子生物学手段将邻苯二酚2，3-双加氧酶在微生物中的过量表达会大大提高石油烃类污染物的降解率。在分离出的石油降解微生物中，通过液体培养发现，S9菌株培养15天的石油降解率为50.8％，16S rRNA序列比较发现这株细菌为链霉菌属，氮磷添加的试验表明该菌株手氮磷营养盐的制约较小。链霉菌属以产生抗生素等活性代谢产物而闻名，他们广泛存在于土壤和海洋中，可以忍受非常极端的环境条件，利用廉价原料大规模发酵投放入被污染环境进行生物修复的潜力很大。为了尝试以邻苯二酚2，3-双加氧酶在石油降解微生物体内的过量表达来提高原油降解率的设想，S9菌株被选为实验对象，以原生质体转化的方式将外源DNA转化入该菌株内。

本发明所用xylE基因，最初来源于Pseudomonas putida。该基因编码的邻苯二酚2，3-双加氧酶(catechol 2，3-dioxygenase)能催化邻苯二酚的间位代谢途径，使无色或微棕色的邻苯二酚转变成黄色的2-羟基粘康酸半醛(2-HMS)。带有‘promoterless xylE’的质粒pIJ4083被用作链霉菌中的显色指示系统来检测基因表达。本发明利用限制性内切酶(PstI/BamHI)将该基因切下，构建到带有强启动子ermE*p(具有SEQ ID NO.2的DNA序列)的高拷贝质粒pWHM3上，为避免纯化出的链霉菌对外源基因的限制性作用(甲基DNA限制)，将pWHM3-xylE质粒转化入大肠埃希菌ET12567，得到了无甲基化修饰的pWHM3-xylE质粒转化入链霉菌原生质体中。在转化过程中加入0.4M的蔗糖作为渗透压稳定剂；在进行XylE酶活性测定时的菌液量为1mL，在菌液中加入50mM邻苯二酚(catechol)，然后用分光光度计测量375nm处的每分钟吸光值，测量结果再用公式mUcatechol dioxygenase[nmolmin^-1]＝(30.3×ΔA₃₇₅)/time[min]以及菌体干重换算出每毫克菌体的酶活性。S9-xylE催化邻苯二酚的结果如图2所示，相对于S9，S9-xylE具有很高活性。而在加入原油的无机盐培养液中，原油降解率也相对增加，在第15天时的石油降解率提高到62.9％，如图3所示。

综上所述，本发明中所述的S9-xylE是一株具有高效原油降解率、低发酵成本、无二次污染的转基因原油降解链霉菌。在海洋原油污染修复方面有着广阔的应用前景。

Claims

1.一种原油降解海洋微生物的筛选改造方法，其特征在于如下步骤：

(1)筛选：取海泥混合海水，接入原油-无机盐培养液中富集培养；所述的原油-无机盐培养液成份如下：NH₄NO₃：1g，K₂HPO₄：1g，MgSO₄：0.1g，FePO₄：痕量，原油：5g，经0.2pm微孔滤膜除菌，陈海水：1000mL，pH：7.2；在30℃，220r.p.m培养两周后，将富集培养液按10倍稀释法稀释至10^-4～10^-6倍；采用原油-无机盐培养液中加入2％的琼脂作为含油固体培养基，取稀释后培养液0.1mL涂布于含油固体培养基，在30℃恒温培养，每个浓度设2个重复；恒温培养48h后，选取优势、不同颜色及形态的单菌落原油降解微生物；在油平板上划线分离纯化，以得到形态一致的单菌落；采用紫外分光光度法对它们的原油降解能力进行测定，选出降解率高的优势菌株添加氮磷营养盐，筛选出对氮磷营养盐依赖性相对较小的菌株；

(2)基因工程改造：将编码邻苯二酚2，3双加氧酶的基因xylE构建到载体上，再转化入筛选出的原油降解微生物中，使邻苯二酚2，3双加氧酶得到高效表达；其步骤如下：

第二步：将xylE连接到高效表达载体pWHM3上，pWHM3含有链霉菌适用的强启动子ermE*p，该质粒是大肠杆菌-链霉菌穿梭型高拷贝质粒；

第三步：将构建好的pWHM3-xylE转化入微生物体内；以原生质体转化的方式，在转化过程中加入0.4M的蔗糖作为渗透压稳定剂。