CN102170903A - 用于刺激免疫反应的产品和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了产品，该产品包括(i)载体和(ii)附着于载体的BCR结合抗原。该产品能够进行BCR介导的内化。该产品可用于诱导或增强免疫反应，并且提供了产品的方法和应用。本发明还提供了在包含树突细胞和B细胞的细胞群体中将药剂相对于B细胞优先递送至树突细胞的方法，该方法包括(i)将药剂附着于载体以及(ii)使细胞群体与附着于载体的药剂接触，其中细胞群体包括B细胞和树突细胞。

Description

用于刺激免疫反应的产品和方法

技术领域

本发明涉及用于诱导BCR介导的特异性免疫反应的产品和方法。尤其是，本发明提供了包含BCR结合抗原和免疫刺激剂的产品，以及与所述产品有关的方法和应用。本发明还涉及用于将药剂递送至树突细胞的方法。

背景技术

当抗体被设计成特异性地识别和消除入侵抗原时，它们是免疫系统采用的有效的武器，以抗击，例如，感染或癌症。为了诱发抗体产生，在由通过B细胞受体(BCR)的特异性抗原识别引发的过程中，必须激活B细胞(1)。特异性抗原衔接(engagement)引发两个BCR介导过程：首先，调节进入细胞周期的细胞内信号的传递(2，3)；以及其次，在加工和呈递(连同与特异性T细胞的MHC)以前的抗原内化(4)。刺激T细胞的B细胞可以分化成滤泡外浆细胞(PC)、或发育成生发中心B细胞。短寿命的滤泡外PC介导第一波主要低亲和力抗体的分泌，其中的一些可能已经经受类别转换(5)。可替换地，生发中心B细胞经受体细胞高突变和亲和成熟，这导致选择高亲和力B细胞克隆，其分化成长寿命浆细胞或记忆B细胞(6)。

在免疫反应的发展期间，抗原的BCR介导的摄取便于其浓缩并递送至包含新合成的MHC第II类分子的特化晚期内体(7)。

许多年以来，假设肽是引发T细胞反应的仅有的抗原决定簇。然而，现在显然的是，T细胞还能够识别和应答抗原脂质和糖脂，其由CD1分子呈递(8)。人CD1基因家族由5种非多态基因(CD1A、-B、-C、-D、以及-E)构成，位于1号染色体上的小簇中(9)。相反，小鼠仅表达CD1d分子。CD1基因具有与MHC第I类基因可比的内含子-外显子结构并且编码I型整合膜蛋白，其由α1、α2、以及α3域构成，类似于MHC第I类分子，非共键连接于β2微球蛋白(β2)。以类似于MHC第II类分子的方式，在它们被加载在细胞内区室中或在细胞内区室中被加工以后，CD1蛋白介导抗原脂质在APC表面上的呈递(10)。CD1d在各种造血细胞上表达，包括树突细胞、胸腺细胞、B细胞、T细胞、以及单核细胞。

可以通过使用免疫刺激剂来增强抗原的免疫原性。例如，α-半乳糖苷神经酰胺(αGalCer)，一种海绵衍生糖脂，是很好表征的iNKT(不变的天然杀伤T)细胞抗原，具有已证明的强烈刺激小鼠和人iNKT细胞的能力(14，15)。另外，还已经提出，当连同抗原一起给予时(US2003/0157135)或当直接连接于抗原时(WO2007/051004)，αGalCer可用作免疫刺激剂。

TLR(Toll样受体)激动剂还已用作免疫刺激剂。TLR家族现在由13个成员构成：虽然在人类中仅已鉴定TLR1至TLR10。TLR是包含toll/IL-IR(TIR)域的超家族的成员，并在所有家族成员的细胞质域之间存在相当大的同源性(Ulevitch，Nature reviews，July 2004，Vol 4,512-520)。按照在细胞中它们识别它们的特定配体的部位，可以将TLR分为两类。TLR 1、2、4、5以及6在细胞的表面上表达，其中它们介导细菌产物的识别。另一方面，TLR的子集，如TLR 3、7、8以及9定位于细胞内区室，其中它们可以应答核酸。

目前，仍然需要用于诱导有效的特异性BCR介导的免疫反应的组合物和方法。

发明内容

B细胞的高度调节激活是生产特异性抗体所需要的。该过程借助于通过B细胞受体(BCR)的抗原的特异性识别来引发，导致早期细胞内信号，接着特异性辅助T细胞的募集。本发明的发明人已设计了新的产品和方法，用于诱导对于抗原的BCR介导的抗原特异性免疫反应，上述产品和方法通常采用抗原与其附着的载体，即颗粒性抗原。还可以将免疫刺激剂附着于载体，或可以以连同颗粒性抗原一起的可溶形式提供免疫刺激剂。

本发明是基于本发明的发明人的以下发现：即，颗粒性抗原与BCR的特异性结合和随后的内化依赖于存在于表面上的抗原的总亲合力(avidity)，如通过B细胞上的BCR所看到的。该观察结果最可能解释为需要触发颗粒性抗原的内化所必要的最小程度的BCR成簇。

载体的使用使得可以精细调节抗原密度，以及从而精细调节亲合力。甚至对于低亲和力抗原的应答也可以发生BCR介导的颗粒性抗原的内化，只要超过限定的亲合力阈值。于是，颗粒性抗原经由BCR衔接被B细胞有效地吸收，从而导致抗原特异性BCR介导的免疫反应。能够调节载体上的密度并从而调节亲合力是一种精致的机制，该机制便于抗原特异性免疫反应的精细控制和调节。通过改变载体上的抗原密度，可以影响和调节免疫反应。颗粒性抗原，即附着有抗原的载体，连同免疫刺激剂一起被呈递到B细胞。‘连同’是指，免疫刺激剂也附着于载体，或免疫刺激剂与颗粒性抗原一起共同给予。

如在本文中所使用的，“共同”给予是指，同时以一种组合物、或同时以不同组合物、或顺序地给予可溶性免疫刺激剂和颗粒性抗原，如本文描述的。关于顺序给予，相隔一段时间间隔给予免疫刺激剂和颗粒性抗原，其仍然使免疫刺激剂可以增强抗原特异性免疫反应。

在颗粒性抗原已被特异性B细胞内化以后，免疫刺激剂能实现特异性免疫反应的增强。增强机制可以例如涉及B细胞将抗原和/或免疫刺激剂呈递到T细胞，如iNKT细胞，细胞因子或趋化因子的分泌，涉及树突细胞，或与免疫系统有关的细胞的级联反应。在任何情况下，它将导致对B细胞的刺激性反馈，从而导致抗原特异性免疫反应的增强。

与可溶性抗原相比，结合颗粒BCR结合抗原和可溶性免疫刺激剂会导致增强的特异性免疫反应。虽然使用可溶性免疫刺激剂如α-GalCer可以导致免疫刺激剂的非特异性摄取(如下面更详细地讨论的)，但连同可溶性免疫刺激剂一起使用颗粒形式的抗原会增加抗原的免疫原性并导致增强的抗原特异性免疫反应。

通过将抗原和免疫刺激剂附着于相同载体，可以获得甚至更加增强的免疫反应。因此，通过靶B细胞以BCR依赖方式，抗原和免疫刺激剂被内化在一起。在BCR介导的颗粒性抗原的内化以后，B细胞可以呈递抗原，并且取决于免疫刺激剂，还将免疫刺激剂(如免疫刺激性脂抗原)呈递至一种或多种类型的T细胞。激活的T细胞又将(直接或间接，即经由其它细胞)刺激B细胞进行分化。可替换的免疫刺激剂(如内体TLR配体)可以触发细胞内级联反应，其导致，例如，细胞激活或可以增强其它免疫细胞反应的细胞因子的分泌。此外，可能的是，免疫刺激剂可以增强DC的成熟(例如通过发育辅助性iNKT的募集)，并且因而激活在它们表面上的抗原连同MHC分子一起呈递到特异性CD4+T辅助细胞。在刺激以后，这些特异性CD4+T辅助细胞于是可以为抗原特异性B细胞的发育提供必要的辅助。因此，通过这些机制中的每一种或这些机制的组合，通过抗原和免疫刺激剂在表面上的结合，可以增强抗原特异性免疫反应。

WO2007/051004提出直接附着抗原与免疫刺激剂以形成结合物(共轭物)，但并没有提出本发明的产品和方法。

虽然大部分颗粒性抗原经由特异性BCR将被B细胞吸收，从而确定免疫反应的特异性，但经由微胞饮和吞噬作用，树突细胞(DC)和巨噬细胞可以吸收颗粒性抗原，其可能有助于总的所观察到的免疫反应。

如上所述，可溶性免疫刺激剂通常由细胞以相对非特异性方式吸收，并潜在地由受体介导，如LDL受体(在免疫刺激性脂质的情况下)，如αGalCer。然而，免疫刺激剂结合成颗粒形式会抑制可溶性免疫刺激剂进入B细胞所采用的机制。本发明的发明人已证明，以颗粒形式存在的免疫刺激剂不能经由可溶性免疫刺激剂所采用的相同的非特异性机制进入B细胞。

因此，因为颗粒状免疫刺激剂不能以非特异性方式进入B细胞，所以它并不触发非特异性免疫反应。为了获得进入靶细胞，颗粒状免疫刺激剂(颗粒性免疫刺激剂)需要特异性摄取。这是通过结合于抗原以便于BCR介导的内化来实现的。与可溶性免疫刺激剂相比，内化的这种机制是更加有效的，并且因此产生增强的和特异性免疫反应。

本发明的发明人已证明，通过在表面上包含抗原并通过BCR介导的内化的机制，颗粒状免疫刺激剂可以进入特定细胞。本发明的发明人已进一步证明，与针对可溶性免疫刺激剂所观察到的内化机制相比，颗粒性抗原的内化的这种机制代表一种更加有效的内化机制，如由抗原特异性免疫反应的增强所证明的。

因此，在相同载体上提供抗原和免疫刺激剂会导致(i)颗粒性抗原特异性递送至表达BCR的细胞以及BCR介导的内化，以及(ii)特异性免疫反应的增强。

本发明的发明人已进一步表明，如果将药剂(如免疫刺激剂)附着于载体(在载体上没有BCR抗原的情况下)，则药剂不会被B细胞吸收，但仍然被树突细胞内化。因此，本文描述的方法和产品可以用来将药剂，如免疫刺激剂，定向递送至树突细胞，即，相对于B细胞，优先递送至树突细胞。

关于免疫刺激性脂质，本发明的发明人已发现，CD1d呈递的免疫刺激性颗粒脂质的特异性BCR介导摄取代表一种增强体内不变NKT(iNKT)依赖性B细胞反应的有效方式。该机制在广泛的抗原亲和力范围内是有效的，但取决于超过BCR介导的内化和随后颗粒脂质免疫刺激剂的CD1d依赖性呈递所必要的严格调节的亲合力阈值。随后，iNKT细胞提供刺激B细胞增殖和分化所需的帮助。有趣的是，iNKT-刺激的B细胞在滤泡外灶内发育并介导高滴度特异性IgM和早期类别转换抗体的生产。因此，本发明的发明人已证明，响应于颗粒状免疫刺激性脂质，iNKT细胞被募集用于辅助B细胞激活，从而导致抗原特异性抗体反应的增强。

另外，本发明的发明人已发现，用附着有抗体和TLR激动剂的载体刺激的B细胞导致体外和体内的增殖和分化并导致抗原特异性抗体的增强的生产。在类似的方式，观察到的增强的抗原特异性免疫反应取决于超过BCR介导的内化所需的亲合力阈值。

因此，本发明的发明人已采用BCR作为一种方式，该方式实现颗粒性抗原的有效和选择性内化，以及附着于颗粒性抗原的免疫刺激剂的选择性递送和内化，从而导致增加的特异性免疫反应。

因此，在第一方面，提供了一种能够进行BCR介导的内化的产品，该产品包括：

(i)载体，以及

(ii)附着于载体的BCR结合抗原。

在另外的方面，本发明提供了一种药物组合物，该组合物包含如本文描述的产品和适宜的载体。

在另外的方面，本发明提供了一种如本文描述的产品或组合物，用作疫苗。

在另外的方面，本发明提供了一种用于在受试者中诱导抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括以下步骤：给予受试者有效量的如本文描述的产品或组合物，以便于特异性BCR介导的内化和B细胞激活。该方法可以用于预防性或治疗性接种疫苗。

在另外的方面，本发明提供了一种用于在受试者中增加BCR结合抗原的免疫原性的方法，该方法包括给予受试者一种产品，该产品包含载体和附着于载体的抗原，并且其中将免疫刺激剂附着于载体或与所述产品一起共同给予免疫刺激剂。

在另外的方面，本发明提供了一种用于制备如本文描述的产品的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将BCR结合抗原附着于载体，以及，可选地

(b)将免疫刺激剂附着于载体，

可选地以颠倒次序进行步骤(a)和(b)。

在另外的方面，本发明提供了一种用于在受试者中增加对BCR结合抗原的抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将抗原附着于载体，以及

(b)将免疫刺激剂附着于载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(a)和(b)，

以及

(c)将载体给予受试者，

从而便于特异性BCR介导的内化和B细胞激活。

在另外的方面，本发明提供了一种用于制备如本文描述的产品或组合物的载体，其中将免疫刺激剂附着于载体。

在另外的方面，本发明提供了一种用于在受试者中增强BCR介导的免疫反应的方法，该方法包括给予受试者如本文描述的产品或组合物。

在另外的方面，本发明提供了一种通过细胞诱导特异性摄取免疫刺激剂的方法，该方法包括以下步骤：

(i)将BCR结合抗原附着于载体，

(ii)将免疫刺激剂附着于所述载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(i)和(ii)，

以及

(iii)使细胞与所述载体接触以便于特异性BCR介导的内化和B细胞激活。

在另外的方面，本发明提供了一种将BCR结合抗原和免疫刺激剂递送至细胞以诱发抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括：

(i)以第一密度将BCR结合抗原附着于载体，

(ii)将免疫刺激剂附着于所述载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(i)和(ii)，

(iii)使载体与细胞接触，

(iv)测试细胞的抗原介导激活，

用不同密度的抗原可选地重复步骤(ii)至(iv)。

在另外的方面，本发明提供了一种生产针对抗原的抗血清的方法，所述方法包括将如本文描述的产品或组合物引入到非人哺乳动物种，以及从所述哺乳动物回收免疫血清。

在另外的方面，本发明提供了一种可通过本文描述的方法获得的免疫血清。在另外的方面，本发明提供了一种可以获自所述血清的抗体。

在另外的方面，本发明提供了可通过本文描述的方法获得的用于生产特异性抗体的B细胞。

在另外的方面，本发明提供了可通过本文描述的方法获得的用于生产特异性抗体的永生化B细胞(杂交瘤)。

在另外的方面，本发明提供了一种针对疾病的被动免疫的方法，所述方法包括给予受试者包含如本文描述的抗体的免疫血清。

在另外的方面，本发明提供了一种如本文描述的产品或组合物，用作药物。

在另外的方面，本发明提供了一种如本文描述的产品或组合物，用于治疗癌症、传染病、变态反应或自身免疫病的方法中。

在另外的方面，本发明提供了如本文描述的产品或组合物在制备用于治疗癌症、传染病、变态反应或自身免疫病的药物中的应用。

在另外的方面，本发明提供了用于生成永生化细胞的方法，所述方法包括以下步骤

(i)使B细胞与如本文描述的产品或组合物接触，以及

(ii)永生化步骤(i)的B细胞。

可以通过各种方式来实现B细胞的永生化，如例如(但不限于)用合适的病毒进行转化、用另一种永生化细胞融合、或附着于CD40。

在另外的方面，本发明提供了一种用于生成永生化B淋巴细胞的方法，该方法包括以下步骤：(i)在本文描述的产品或组合物存在的情况下，离体(活体外)永生化B淋巴细胞。可以通过各种方式来实现B细胞的永生化，如例如(但不限于)用合适的病毒进行转化、融合于另一种永生化细胞、或附着于CD40。

在另外的方面，本发明提供了一种用于生成能够产生单克隆抗体的永生化B淋巴细胞的克隆的方法，该方法包括：

(i)使B淋巴细胞与如本文描述的产品或组合物离体接触，以及

(ii)永生化步骤(i)的B细胞。

可以通过各种方式来实现B细胞的永生化，如例如(但不限于)用合适的病毒进行转化、融合于另一种永生化细胞、或附着于CD40。该方法可以进一步包括步骤(iii)：筛查转化B细胞的抗原特异性。该方法可以进一步包括分离永生化B细胞。

在另外的方面，本发明提供了一种用于生成能够产生单克隆抗体的永生化B淋巴细胞的克隆的方法，该方法包括：

(i)在如本文描述的产品或组合物存在的情况下，永生化包含B淋巴细胞或由B淋巴细胞组成的细胞群体。

可以通过各种方式来实现B细胞的永生化，如例如(但不限于)用合适的病毒进行转化、融合于另一种永生化细胞、或附着于CD40。

该方法可以进一步包括：

(ii)筛查转化淋巴细胞的抗原特异性。该方法可以包括(iii)分离永生化B细胞。

在一些实施方式中，B细胞是人B细胞。在一些实施方式中，B淋巴细胞是记忆B淋巴细胞，优选人B淋巴细胞。

上面描述的方法可以进一步包括以下步骤：从所述永生化B细胞分离单克隆抗体。

在另外的方面，本发明提供了可通过本文描述的方法获得的抗体。

在另外的方面，本发明提供了一种用于加速抗原特异性抗体生产的方法，该方法包括将如本文描述的产品或组合物引入到非人哺乳动物中，并从所述哺乳动物回收抗体。

在另外的方面，本发明提供了一种用于通过B细胞抑制免疫刺激剂的非特异性摄取的方法，该方法包括以下步骤：在与所述B细胞接触以前，将所述免疫刺激剂附着于载体。

在另外的方面，本发明提供了一种用于在受试者中诱导或增加对于BCR结合抗原的抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括给予受试者包含载体和附着于载体的所述抗原的产品，并且其中将免疫刺激剂附着于载体或与所述产品一起共同给予免疫刺激剂，并且其中当给予受试者时可溶形式的抗原不能诱导T_H细胞反应。抗原可以包含或可以是碳水化合物、或肽。另外，抗原可以包含或可以是修饰肽如糖基化肽的磷酸化肽。

在另外的方面，本发明提供了一种相对于B细胞来说将药剂，如免疫刺激剂，优先递送至树突细胞的方法，该方法包括：

(i)将药剂附着于载体，

(ii)使细胞群体与附着于载体的药剂接触，其中细胞群体包含B细胞和树突细胞。

在一些实施方式中，药剂是如本文描述的免疫刺激剂。在一些实施方式中，载体是如本文中所描述的。

附图和表的简要说明

图1.通过BCR和存在的αGalCer，B细胞将颗粒结合物内化至NKT细胞。

(A)顶部图片，用DOPC/PE-生物素/αGalCer脂质体(αGalCer)、DOPC/PE-生物素/αGalCer脂质体以及生物素化HEL(αGalCer+HEL)或DOPC/PE-生物素脂质体以及生物素化HEL(HEL)涂布硅质珠。通过蛋白质印迹利用抗HEL抗体来检测抗原与脂质体涂布的珠的结合。底部图片，通过FACS分析来检测Alexa-488标记的脂质体涂布珠(黑线)，并与非标记的脂质体涂布珠比较(灰色实线轮廓)。

(B-H)通过B细胞的颗粒状αGalCer的呈递。(B)用可溶性αGalCer(15ng/m1)或0.1μl的包含αGalCer的颗粒来温育MD4B细胞。洗涤细胞并用DN32.D3细胞温育。通过ELISA测量了到iNKT细胞的αGalCer呈递作为IL2生产。(C)如在(B)中用包含αGalCer(○)、HEL(▲)或HEL-αGalCer(■)的颗粒脉冲MD4B细胞。用HEL-αGalCer颗粒脉冲WT B细胞(△)并用作对照。(D)在用NKT细胞共培养以前，用HEL-αGalCer颗粒引发MD4B细胞并用抗CD1d阻断抗体(αCD1d)或同种型对照(对照Ig)温育2小时。(E)在用抗HEL抗体染色以后，通过FACS分析包含αGalCer和不同密度HEL的颗粒。示出了平均荧光强度值(mfi)。(F)用MD4B细胞进行共培养实验，其中用包含αGalCer和不同密度的HEL、HEL^RDGN或HEL^RKD(灰度)的颗粒脉冲MD4B细胞。(G)通过表达D1.3IgM HEL-特异性BCR(■)或D1.3IgM/H2嵌合体(○)的B细胞，HEL-αGalCer结合物的呈递。(H)用MD4B细胞进行共培养实验，其中用包含HEL-αGalCer(■)、αGalCer(▲)、HEL-Gal(α1→2)GalCer(○)或Gal(α1→2)GalCer(△)的颗粒脉冲MD4B细胞。(I)用MD4B细胞进行共培养实验，其中用包含HEL-IMM47(■)的颗粒和仅包含IMM47的颗粒(◇)脉冲MD4B细胞。

图2.iNKT细胞辅助体内抗原依赖性B细胞增殖

将CFSE标记的MD4B细胞转移到受到包含αGalCer和/或HEL的颗粒激发的WT小鼠中。接受HEL-αGalCer颗粒而不是细胞的小鼠用作对照(mock)。在第5天，收获来自受体小鼠的脾脏，用于FACS分析。(A)供体HEL结合细胞的增殖检测为CFSE稀度。(B和D)还使用Jα18-/-小鼠作为受体进行了转移实验。描绘了回收自受体Jα18-/-或WT(■)脾脏的HEL⁺(B)和CD138⁺HEL⁺细胞(D)的百分比。(E)通过ELISPOT，确定了在WT受体小鼠的脾脏中分泌HEL特异性IgM的细胞的数目。(F)在第5天，在WT和Jα18-/-受体小鼠的血清中测量了特异性抗HEL IgMa。仅在用HEL-αGalCer颗粒(■)激发的WT受体小鼠中检测到特异性抗体。

(C)在MD4转移以后，在第5天，收获来自受体小鼠的脾脏，用于免疫荧光显微术。用B220(红色)染色滤泡(Fo)中的B细胞，染色HEL结合细胞的细胞内-HEL(绿色)并且用PNA(蓝色)染色生发中心(GC)。在用HEL-αGalCer颗粒激发的小鼠中，仅检测到浆细胞的HEL结合滤泡外病灶(EF)。

图3.抗体的密度/亲和力调节iNKT依赖性B细胞增殖和抗体生产。

如在图2中进行MD4转移实验。用包含αGalCer和两种不同密度的HEL或HEL^RKD的颗粒激发WT受体小鼠。(A)MD4增殖检测为在HEL结合群体中的CFSE稀度。(B)回收自受体脾脏的HEL⁺细胞的百分比(高密度：高，低密度：低)。(C)在第5天，在用包含αGalCer的珠以及：■，HEL高密度；□，HEL低密度；●，HEL^RKD高密度；○，HEL^RKD低密度激发的受体小鼠的血清中，检测到抗HEL特异性IgMa。

(D-F)WT小鼠接受MD4细胞和包含HEL-αGalCer的颗粒或HEL颗粒和可溶性αGalCer。供体细胞增殖检测为CFSE稀度(D)。与可溶性αGalCer相比(灰色虚线)，响应于HEL-αGalCer结合物，在HEL+供体细胞中检测到更广泛的增殖(黑线)。接受MD4细胞但不接受珠的小鼠用作对照(实心灰色轮廓)。(E)在接受可溶性或颗粒状(■)αGalCer-HEL的小鼠中HEL+供体细胞的百分比。(F)在接受包含HEL-αGalCer(■)的珠或HEL珠加可溶性αGalCer(○)的受体小鼠中检测到的抗HEL特异性IgMa。

图4.用颗粒性抗原/αGalCer的免疫会诱导IgM和早期类别转换的特异性抗体。

(A和C)用10μl的包含αGalCer(□)、抗原或抗原/αGalCer(■)的颗粒免疫C57BL/6小鼠(4只小鼠/组)。CGG(A)或HEL(C)用作抗原。在免疫以后的第7天和第14天，在小鼠血清中检测到特异性抗体。用包含CGG或CGG/αGalCer的颗粒免疫(B)WT(■)和Jα18-/-小鼠(3只小鼠/组)，并在第7天放血。

图5.抗原和αGalCer的交联会增强特异性抗体反应。

(A)用1μl的CGG-αGalCer涂布颗粒加1μl的OVA涂布颗粒或1μl的OVA-αGalCer涂布颗粒加1μl的CGG涂布颗粒(■)免疫C57BL/6小鼠(4只小鼠/组)。在第7天测量了抗CGG和抗OVA特异性抗体。(B)在用1μl的包含CGG-αGalCer(■)的颗粒或1μl的CGG颗粒加150ng可溶性αGalCer免疫的C57BL/6小鼠(3只小鼠/组)中检测的特异性抗CGG抗体。在第7天对小鼠进行放血，并通过ELISA来检测特异性抗CGG抗体。

图6.通过边缘区(MZ)和卵泡(Fo)B细胞，颗粒αGalCer-HEL的呈递。在用DN32.D3细胞温育以前，通过FACS来分选MD4MZ和FoB细胞，然后用颗粒αGalCer-HEL进行脉冲。αGalCer呈递测量为IL-2生产。

图7.抗原亲和力和密度体外调节B细胞对用颗粒性抗原-CpG结合物刺激的反应

(A)用涂布有HEL、CpG或HEL以及CpG的微球来温育CFSE标记的MD4B细胞。左上图片，增殖检测为CFSE稀度。左下图片，浆细胞分化检测为CD138(多配体聚糖-1)上调。中间和右图片，通过ELISA在培养上清液中，测量了IL-6分泌和HEL特异性IgMa生产。(B)在存在或没有CpG的情况下，用包含HEL亲和突变体HEL^RD、HEL^KD、HEL^RKD的微球刺激MD4细胞。通过ELISA检测了IL-6和HEL特异性IgMa分泌。(C)用包含CpG和不同密度的HEL^RD、HEL^KD、HEL^RKD的颗粒刺激CFSE标记的MD4B细胞。上图片，如上述测量了IL-6和IgMa。黑条表示高密度，灰色条表示中等密度以及空心条表示低密度。下图片，增殖检测为CFSE稀度。

图8.颗粒HEL-CpG结合物导致体内广泛的增殖和浆细胞分化

(A)将CFSE标记的MD4B细胞转移到用包含HEL和/或CpG的颗粒激发的WT小鼠中。在第4天，收获来自受体小鼠的脾脏，用于FACS分析。左上图片，增殖检测为CFSE稀度。左下图片，通过高细胞内HEL结合和表面标记CD138的上调鉴定了MD4浆细胞。在中间图片中示出了MD4群体的CD138阳性细胞的百分比。右图片，通过ELISA，血清中HEL特异性IgMa的检测。

图9抗原亲和力和密度调节体内B细胞对用颗粒性抗原-CpG结合物刺激的反应

(A-B)将CFSE标记的MD4B细胞转移到在存在或没有高密度CpG的情况下用包含HEL^RD、HEL^KD、HEL^RKD的颗粒激发的WT小鼠中。(A)上图片，通过CFSE的稀度评估了增殖。下图片，通过CD138的高细胞内HEL结合和上调揭示了MD4浆细胞。(B-D)在存在或没有高密度(B)、中等密度(C)、或低密度(D)CpG的情况下，用包含HEL^RD、HEL^KD、HEL^RKD的微球共易位MD4B细胞。上图片示出了在MD4群体中浆细胞的百分比，下图片示出了血清中的IgMa水平，如通过ELISA测量的。

图10颗粒性抗原和CpG的交联增强体内特异性抗体反应。

(A)用10μl的涂布有CGG或CpG或两者的颗粒i.p.免疫C57BL/6小鼠(3只小鼠/组)。在第14天，评估了CGG特异性IgG、IgG1、IgG2b以及IgG2c。(B)左图片，用1μl的涂布有CGG的颗粒加1μl的涂布有OVA-CpG的颗粒或1μl的涂布有CGG-CpG的颗粒加1μl的涂布有OVA的颗粒i.p.免疫C57BL/6小鼠(3只小鼠/组)。右图片，将10μl的涂布有OVA的颗粒加10μl的涂布有CGG-CpG的颗粒或10μl的涂布有OVA-CpG的颗粒加10μl的涂布有CGG的颗粒给予WT小鼠。通过ELISA，在第14天，评估了CGG和OVA特异性IgG。

图11包含HEL和/或CpG的颗粒的表征

(A)左图片，单独用生物素化HEL(黑线)涂布链抗生物素蛋白珠或连同生物素化CpG(灰色实线轮廓)一起涂布链抗生物素蛋白珠。右图片，通过蛋白质印迹利用多克隆抗HEL抗体检测了抗原与珠的结合。(B)用生物素化单克隆抗HEL F10抗体和CpG(深灰色实线)涂布链抗生物素蛋白珠。通过F10与生物素化CGG的竞争，获得了中等密度(灰白色实线)和低密度(浅灰色实线)的F10。

图12用颗粒磷酸肽-□GalCer的免疫会诱导IgM和IgG肽特异性抗体。

用10μl的包含磷酸肽或磷酸肽-αGalCer(■)的颗粒免疫C57BL/6小鼠(3只小鼠/组)。在免疫以后的第0天和第7天(血清稀度1∶1000)，检测了小鼠血清中的特异性肽抗体。

图13

用1μl OVA-CpC涂布颗粒加1μl CγG涂布颗粒或1μl CγG-CpG颗粒加1μl OVA涂布颗粒免疫C57BL/6小鼠(3只小鼠/组)一次。在免疫后的第14天和第3个月，ELISPOT用来量化骨髓CγG特异性IgG分泌ASC的数目。

图14通过体外Ag-BCR相互作用的亲合力来调节BCR介导的Ag-CpG结合物的摄取

在(上图片)没有或(下图片)存在CpG的情况下，用1μl的未涂布(充满灰色)或涂布有HEL、HELK或HELRKD的荧光颗粒刺激MD4B细胞。流式细胞术用来评估颗粒的结合：示出的门(gate)表明颗粒的活细胞结合(左门)中等水平和(右门)高水平的百分比。

图15在含Ag颗粒上存在的CpG的量调节体外B细胞增殖和分化以形成PC的程度

(A，B)用1μl的结合于不同密度的CpG的颗粒HEL刺激CFSE标记的B细胞。从左到右，CpG的密度表示为从最高到最低。在刺激后72小时，测量了MD4B细胞的增殖和分化。(A)流式细胞术用来测量在刺激(黑线)和未刺激(充满灰色)的MD 4细胞中的CFSE稀度。(B)通过ELISA评估了(左图片)IL-6和(右图片)IgMa分泌。

图16颗粒Ag-CpG体内促进B细胞增殖和分化以形成短寿命的EFPC

(A-D)将CFSE标记的MD4B细胞过继转移到C57BL/6小鼠中，并用10μl的包含仅HELRD、仅CpG或HELRD-CpG的颗粒激发。(A)转移后4天，流式细胞术用来测量在受体小鼠的脾脏的HEL结合细胞中的(左上图片)CFSE稀度以及(左下图片)CD138上调；(右上图片)存在的MD4PC(HEL细胞内，CD138+)的百分比表示为总脾细胞的比例；(右下图片)通过ELISA(B)流式细胞术测得的血清HEL特异性IgMa用来在激发以后的指定时间测量在刺激(黑线)和未刺激(充满灰色)的MD 4细胞中在受体小鼠的脾脏中在HEL结合细胞中的CFSE稀度。(C)(左图片)ELISPOT用来检测脾HEL特异性ASC，而(右图片)ELISA用来测量血清HEL特异性IgMa。(D)在5天以后，免疫荧光显微术(Zeiss LSM 510meter)用来检测HEL结合细胞(细胞内HEL，绿色Alexa488)和脾卵泡B细胞(抗B220，红色Alexa543)。放大率10x，NA 0.3。

图17Ag-BCR相互作用的亲合力和TLR9信号强度调节体内PC形成的程度

将CFSE标记的MD4B细胞过继转移到C57BL/6小鼠中，并用10μl的包含HEL和不同密度的CpG的颗粒激发。从左到左，CpG的密度表示为从最高到最低。流式细胞术用来量化(上图片)已经受增殖的活HEL结合B细胞的百分比，以及(下图片)MD4PC(HEL细胞内，CD138+)的百分比，作为总脾细胞的比例。

图18

(E)将HyHEL10B细胞过继转移到C57BL/6小鼠中并用10μl的涂布有仅HEL、仅CpG或HEL-CpG的颗粒激发。在7天以后，ELISA用来测量受体小鼠的血清中的HEL特异性Ig的水平。(左图片)IgM(空心条)和IgG(充满条)，以及(右图片)IgG亚型IgG1(浅灰色条)、IgG2b(中等灰色条)以及IgG2c(暗灰色条)。(F)用1μl的仅颗粒HEL、仅颗粒CpG或颗粒HEL-CpG刺激HyHEL10B细胞7天。ELISA用来测量分泌到培养基中的HEL特异性Ig的水平，如在(E)中所描述的。

图19用HEL-CpG颗粒进行的刺激产生持续的p38磷酸化并且取决于体外功能性TLR9(A)将生物素化Ag(左图片)OVA和(右图片)CγG固定在链抗生物素蛋白涂布的颗粒上，然后在存在(充满灰色)或没有(黑线)CpG的情况下，通过流式细胞术并在结合抗OVA接着抗小鼠IgG-AlexaFluor-488或抗CγG FITC以后加以可视化。(B)在存在(充满灰色)或没有(黑线)CpG的情况下，通过：(上图片)蛋白质印迹使用多克隆抗HEL以及(下图片)流式细胞术并借助于抗HEL F10AlexaFluor-488的结合来检测生物素化HEL与链抗生物素蛋白涂布的微球的结合。(C)MD4B细胞(上图片)和来自骨髓的DC(下图片)没有被刺激(充满灰色)或用0.2μl的涂布有仅HEL、仅CpG或HEL-CpG(实线)的颗粒刺激。流式细胞术用来评估颗粒的结合。门(gate)表示结合于颗粒的活细胞的百分比。

图20

用1μl的仅颗粒HEL(空心条)、仅颗粒CpG(灰色条)或颗粒HEL-CpG(充满条)来刺激MD4B细胞。在刺激以后的指定时间获取样品，然后使等量的全细胞溶胞产物经受SDS-PAGE。(上图片)随后利用对于磷酸化p38(pp38)、总p38以及肌动蛋白(负载对照)的特异性抗体进行蛋白质印迹，以进行检测。(下图片)通过密度测定法来量化条带的密度，进行背景校正，归一化到在相同样品中的肌动蛋白条带的密度，然后对于每种条件并相对于未刺激的零时间点进行。

图21体外通过Ag-CpG颗粒进行的B细胞增殖和分化的刺激取决于Ag亲合力

用1μl的连同(上图片和充满条)高密度或(下图片和空心条)低密度的(左图片)HEL或(右图片)HEL^K一起涂布有CpG的颗粒刺激MD4B细胞72小时。(A)通过流式细胞术评估了刺激细胞(黑线)和未刺激细胞(充满灰色)B细胞的CFSE稀度。(B)通过ELISA评估了(左图片)IL-6和(右图片)IgM^a分泌。

具体实施方式

抗原与BCR的结合导致抗原内化和呈递到T细胞，在引起体液免疫反应中的关键步骤。通过几个小组描述了B细胞内化和处理颗粒性抗原的能力(22-24)。这是特别有关的，因为在体内经常遇到不溶性形式或束缚于细胞表面的抗原(23)。

可以通过许多不同的参数来描述用于形成复合物(PL)的蛋白(P，如BCR)与它的配体(L，如抗原)的相互作用。因此，在生物化学中，平衡解离常数可以用来度量蛋白与配体之间的相互作用的亲和力。

当正向和逆向反应的速率相等使得

k_off[PL]＝k_on[P][L]时，来定义平衡解离常数(K_D)，

因而平衡解离常数定义为：

K_D＝k_off/k_on＝[P][L]/[PL]。

解离常数具有摩尔单位(M)，其对应于在特定蛋白上结合位点被占据一半的配体[L]的浓度，即配体的浓度，在该浓度下，结合有配体的蛋白[PL]的浓度等于未结合有配体的蛋白[P]的浓度。解离常数越小，则配体更牢固地被结合，或配体与蛋白之间的亲和力越高。例如，与具有微摩尔(μM)解离常数的配体相比，具有纳摩尔(nM)解离常数的配体更加牢固地结合于特定蛋白。可替换地，通常通过以K_D的倒数给出的缔合常数(K^A，以M^-1给出)来描述亲和力。

此外，用复合物的半衰期来描述PL复合物的寿命，因此：

t_1/2＝ln2/k_off

更长的t_1/2表示更稳定的相互作用，并且由更慢的速率常数k_off引起。复合物的特定寿命将决定所述蛋白的刺激/激活，如果配体是激动剂。在生物化学中这是重要的量，因为反应并不简单地取决于相互作用(K_A或K_D)的‘亲和力’而是取决于蛋白所看到的配体的亲和力。

虽然术语亲和力描述单键的强度，但亲合力(avidity)是用来描述多重键相互作用的组合强度的术语。

因为配体可以以不同的密度存在于表面上，因此这可能影响在短寿命的PL复合物崩溃以后再结合的可能性。因此，在更高的密度下具有快速k_off的配体能够诱导与具有高亲和力的配体类似的反应。

颗粒性抗原与靶细胞(通常为B细胞)的总亲合力因此取决于特异性抗原的亲和力并取决于在载体表面上抗原的密度。

本发明的发明人已发现，颗粒性抗原与BCR的特异性结合以及随后的内化取决于总抗原亲合力。载体如珠的使用便于精细调节抗原密度(以及因此调节亲合力)。因此这还确保，甚至低“亲和力”的抗原(就K_A而言)也能够刺激特异性免疫反应，如果它们以足够密度被呈递在表面上。也附着于载体的免疫刺激剂连同抗原一起被细胞内化，导致特异性免疫反应的增强。观察到的增强可以由激活的细胞内刺激或通过募集可以导致激活的刺激的其它细胞因子产生。

如上面所讨论的，载体上抗原的密度也影响亲合力。

US2007/0104776(Ishii et al)描述了包含卵清蛋白和a-半乳糖神经酰胺的脂质体的使用，其中卵清蛋白被封装在脂质体中。脂质体显示出对抗体生产的抑制作用。

因此，在一个方面，本发明提供了一种能够BCR介导内化的产品，包括：

(i)载体，以及

(ii)附着于载体的BCR结合抗原。

换句话说，借助于BCR-衔接(engagement)，产品适合于被靶细胞(通常为B细胞)内化。该产品可以进一步包含附着于载体的免疫刺激剂。在BCR介导内化以后，该产品可以诱发抗原特异性免疫反应。

可以使用任何合适的载体。载体必须适合于在其上附着抗原和/或免疫刺激剂并且必须具有合适的尺寸以被表达BCR的细胞内化和处理。在一些实施方式中，载体可以是颗粒，例如珠。载体可以是微球。术语“微球’是指由任何材料制成的球壳，其具有非常小的直径，通常在微米或纳米范围内。

载体可以是任何合适的材料，例如，可以使用聚合物或硅石载体，如聚合物或硅质珠或微球。合适的珠在本领域是已知的。

颗粒可以是脂质体。脂质体通常是指由围绕含水核心的一个或多个脂双层构成的囊泡结构。每个脂双层由两个脂单层构成，其每一个具有疏水性“尾”区和亲水性“头”区。在双层中，脂单层的疏水性“尾”朝向双层的内侧定向，而亲水性“头”朝向双层的外侧定向。Bangham(Bangham et al，1965，J Mol Biol，13：238)描述了用于制备脂质体制剂的方法，并且在WO2006/002642中描述了用于稳定脂质体悬浮液的组合物和方法，将上述两个参考文献以引用方式结合于本文。

根据本发明，可以使用涂布有脂质体的珠。

载体/颗粒的尺寸可以为1nm至10μm，优选在10nm至10μm的范围内，优选在10nm至1μm的范围内，优选在50nm至1μm的范围内，优选在100nm至1μm的范围内，更优选在100nm至500nm的范围内。更优选地，载体的尺寸在100nm至150nm的范围内，更优选在100nm至130nm的范围内。然而，载体/颗粒可以更小或更大。

颗粒的尺寸可以是100nm或130nm。

在一些实施方式中，可以优选的是，颗粒的尺寸类似于天然抗原载体如病原体的尺寸。

可以采用将免疫刺激剂和/或抗原附着于载体的任何方法，只要免疫刺激剂和抗原仍然能够诱发所期望的增强的和特异性免疫反应。例如，可以使用生物素-链抗生物素蛋白接头系统。此外，可以使用脂质体以便用特定的免疫刺激脂质来涂布二氧化硅微球。

本发明的产品和方法便于精细调节载体上的抗原量和抗原密度。取决于所使用的特定抗原，可以将或多或少的抗原附着于载体表面，从而增加或降低抗原密度(以及因此增加或降低亲合力)。不同抗原可以需要不同密度，这取决于它们的不同K_A和k_off，以便超过BCR介导内化所需的亲合力阈值。例如，与高亲和力抗原相比，低亲和力抗原可能需要在载体表面上的更高密度。

例如，本发明的发明人已采用具有一定范围亲和力的抗原，其涵盖在用抗原免疫以前将包含在生理学所有组成成分中的那些抗原(K_A在8×10⁵M^-1至2.1×10¹⁰M^-1的范围内)。关于所测试的抗原，需要最小K_A 8×10⁵M^-1(其对应于2.5秒^-1的k_off)以刺激体内从转移的抗原特异性B细胞的特异性抗体生产。

要强调的是，本文描述的任何亲和力值仅用于说明而绝不是限制本发明的范围。根据本发明，可以使用适于诱导BCR介导内化的任何抗原。本发明并不限于具有特别低或高亲和力的抗原。

测量载体表面上的抗原量以及调节其密度的方法在本领域是已知的。例如，可以利用定量蛋白质印迹或通过将荧光标记加入到抗原中以通过FACS确定存在的抗原量来量化伴随珠的抗原的精确量，以及由此(获得的)其密度。

在一个方面，本发明提供了一种产品，该产品包括(i)载体，(ii)附着于载体的至少一种BCR结合抗原，以及，可选地，(iii)附着于载体的至少一种免疫刺激剂。

应当理解，本发明的产品包含载体，该载体带有足够密度(因而足够亲和力)的抗原，以使靶细胞，通常B细胞，可以进行BCR介导的内化。因此它们适合于BCR介导的内化。

可以例如通过(i)生成其上附着有不同量抗原的载体，(ii)使所述载体与靶细胞，如B细胞接触，(iii)测试靶细胞激活，来确定为获得足以进行BCR介导内化所需的总亲合力的特定抗原的必要的密度。靶细胞的激活表明颗粒性抗原的特异性摄取，其表明，在所述特定载体上的抗原具有足够的密度和亲合力以触发根据本发明的内化。

为了在载体上产生不同密度水平，可以，例如，通过用抗原饱和载体来首先产生具有最高可能密度的载体。然后可以测试获得的载体是否能够诱导BCR介导的内化。然后可以通过使抗原涂布载体与不同量的药剂(其竞争出结合于载体表面的抗原)接触来减小密度。例如，如果经由基于生物素的附着机制将抗原附着于载体，则竞争剂可以是生物素化剂，例如生物素化非免疫原性蛋白。然后可以使产生的载体与B细胞接触以确定所获得的特定抗原的密度是否适合于BCR介导的B细胞激活。如果亲合力低于特定抗原所需的阈值，则观察不到足够的细胞激活，因此观察不到足够的免疫反应。通过逐步减小载体上的密度，可以确定每种抗原所需的最小密度(以及由此(获得的)亲合力)。

如果多种抗原存在于载体上，则可以优化每种抗原的密度。

可以通过任何合适的方法来测量B细胞的激活。例如，可以通过测量，响应于颗粒性抗原的摄取，特异性抗体、细胞因子或趋化因子的分泌来测试B细胞的激活。还可以在用iNKT细胞体外温育以后，通过IL-2分泌到培养基中的测量结果，来测量在B细胞表面上CD1d介导的脂质免疫刺激剂呈递的激活。

尤其是，以下测试可以用来测试抗原是否以足够的亲合力存在于载体上以诱发抗原特异性免疫反应。在转基因的抗原特异性小鼠B细胞中，可以采用以下体外测定。(细胞是‘转基因的’，因为它们富集这样的B细胞，其表达对于所述抗原特异性的BCR。)

例如，如果使用带有抗原和CpG的载体，则早在用颗粒刺激以后的24或48小时，就可以通过ELISA来测量培养的上清液中的IL-6分泌。可以在72小时以后通过ELISA来评估IgM的生产。仅当已发生足够刺激时，才可以检测到IL-6和IgM两者。

另外，如果在刺激以前用CFSE标记B细胞，则可以在刺激以后72小时，通过FACS来评估作为B细胞激活的示值读数的增殖(CFSE的稀度)。

如果，例如，使用带有抗原和aGalcer的载体，则可以通过检查B细胞激活iNKT细胞的能力来测定呈递在B细胞表面上的aGalCer-CD1d的量。如在本文实施例的方法和材料中所详细描述的，可以使用来自DN32.D3杂交瘤的iNKT细胞来进行这些测定。为了在它们的表面上呈递aGalCer-CD1d，载体上的抗原必须已超过用于BCR介导的内化的亲合力阈值。用颗粒温育抗原特异性转基因B细胞过夜，然后在PBS中充分洗涤。随后用iNKT细胞温育B细胞，并在20小时以后，iNKT细胞的IL-2的分泌(如通过ELISA测得的)给出呈递在B细胞表面上的aGalCer-CD1d的度量。

每种B细胞可以吸收多种载体。接触B细胞的载体数目因而可以影响所得的免疫反应。通过改变所用载体的数目，可以优化载体的数目以达到所期望的反应。

还可以采用一种免疫策略来鉴定刺激体内特异性免疫反应所需的抗原亲合力的阈值。例如，可以通过对用本文描述的颗粒性抗原免疫的个体的血清进行ELISA或其它合适的免疫测定来测量特异性抗体的生产。

载体的使用不仅便于调节载体上抗原和/或免疫刺激剂的密度，而且还便于调节抗原与免疫刺激剂之间的比率。这代表用来优化对特定抗原的特异性免疫反应的另外的方式。因为更弱的抗原，如在许多抗菌疫苗中所使用的，缺乏相关的T细胞表位，所以这样的抗原可能需要更高量的免疫刺激剂。与将需要更强的抗原相比，载体提供了增加结合的免疫刺激剂的量的机会。确实，本发明的发明人已证明了，利用例如在C57/BL6背景(本底)中用模型抗原鸡卵溶菌酶进行的免疫，甚至在没有特异性辅助T细胞存在的情况下也可以发生增强的和特异性免疫反应。在相同载体中呈递抗原和免疫刺激剂可确保细胞同时摄取，与摄取仅抗原或摄取抗原和可溶性免疫刺激剂相比，会导致甚至更加增强的特异性反应。

在一些实施方式中，可以将多种抗原分子附着于载体。

在一些实施方式中，可以将不同类型的抗原附着于载体；例如可以将2、3、4或更多种不同抗原附着于载体。通常，每种抗原以足够的密度/亲合力存在以激活表达BCR的细胞，即每种抗原将触发一种抗原特异性免疫反应。因此带有多种抗原的载体将刺激对每种抗原的免疫反应，并且将因此能够生产针对病原体的抗原成分的免疫反应。该策略将确保最佳保护以避免入侵病原体，防止单‘逃逸’突变的选择。(病毒将经常突变它们的一些蛋白(因而抗原)以逃逸免疫系统的检测，使得它们可以不再被免疫细胞结合或被特异性受体识别)。因此，将不同抗原附着于载体并且同时将抗体增加至抗原的数目，会增加单逃逸突变体将仍然被免疫系统击退的机会。

在一些实施方式中，可以将多种免疫刺激剂分子附着于载体。

在一些实施方式中，可以将不同类型的免疫刺激剂附着于载体。例如，可以将2、3、4或更多种不同类型的免疫刺激剂附着于载体。因为不同类型的免疫刺激剂可以使用不同的增强免疫反应的机制，所以组合不同的免疫刺激剂可以导致协作，从而产生甚至更强增强的免疫反应。

在一些实施方式中，不同类型的抗原和不同类型的免疫刺激剂的组合可以存在于载体表面上。

另外，在一些实施方式中，其上附着有一种或多种抗原和一种或多种免疫刺激剂的载体可以合并于一种或多种可溶性免疫刺激剂，以进一步加强特异性免疫反应。可溶性免疫刺激剂可以是与用在载体上的相同的免疫刺激剂，或可以是不同的可溶性免疫刺激剂。

在一些实施方式中，其上附着有一种或多种抗原以及其上可选地附着有一种或多种类型的免疫刺激剂的载体可以与一种或多种可溶性免疫刺激剂一起共同给予。

免疫刺激剂

本文中术语“免疫刺激剂”用来描述一种物质，该物质可以诱发、增加和/或延长针对抗原的免疫反应。虽然本申请区分“抗原”和“免疫刺激剂”，但应该注意的是，这仅是为清楚和容易描述起见。应当理解，免疫刺激剂可以具有并在许多情况下优选具有抗原潜能本身。因而，在实施例中，“免疫刺激性脂质”，例如，因此还称作“抗原脂质”。本文中“抗原”和“免疫刺激剂”之间的区别是指以下事实：诱导的特异性BCR介导免疫反应将针对抗原，因为“抗原”决定了对BCR的特异性结合。

具有免疫刺激活性的化合物在本领域是已知的。根据本发明，可以使用任何适宜的免疫刺激剂，如例如蛋白，多肽，肽，多糖如聚糖，多糖结合物，肽和多糖的非肽类模拟物以及其它分子，小分子，脂质，糖脂，以及碳水化合物。

如下文更详细地描述的，在一些实施方式中，免疫刺激剂是iNKT激动剂或TLR激动剂。

iNKT激动剂

多年来，假设肽是引发T细胞反应的仅有的抗原决定簇。然而，显然的是，T细胞还能够识别和应答由CD1分子呈递的抗原脂质和糖脂(8)。通过它们的高度多态的T细胞受体(TCR)，T细胞可以识别各种各样的潜在抗原。称作iNKT(不变的天然杀伤T)细胞的T细胞的亚群是通过它们表达限制性TCR所有组成成分来定义的，在小鼠和人类中分别包括规范Vα14-Jα18或Vα24-Jα18α链。响应于由表达在APC表面上的非多态CD1d分子呈递的自体或外源抗原脂质，iNKT细胞可以识别并变得激活(8，11)。响应于各种感染，并且在炎性疾病和自身免疫病期间，iNKT细胞被激活(12，13)。iNKT细胞提供了连接和协调先天性和适应性免疫反应的方式，因为它们的刺激可以诱导DC、NK细胞、B和T细胞的下游激活(11)。体外已证明，iNKT细胞刺激B细胞增殖和抗体生产(16)，虽然这似乎独立于外源性iNKT细胞-配体的呈递和BCR特异性。因为免疫系统的有效操作需要体内细胞激活的严格调控，所以期望，iNKT介导的激活必须经受严格的调节，然而，其发生的机制仍然未表征。在本申请中，本发明的发明人证明了，特异性BCR内化可以增强体内B细胞呈递颗粒脂质抗原到iNKT细胞。随后，激活的iNKT细胞有助于特异性B细胞增殖、分化成滤泡外PC以及分泌高滴度的特异性IgM和早期类别转换抗体。

先前已表明，NKT细胞可以由α-半乳糖-神经酰胺(α-GalCer)或其合成类似物KRN 7000激活(US 2003/0157135)。已进一步表明，α-GalCer可以刺激NK活性和(通过NKT细胞的)细胞因子生产并呈现出体内强效抗肿瘤活性。因为在CD1d^-/-和NKT-缺损小鼠中均缺少α-GalCer的免疫调节功能，所以这表明α-GalCer必须由MHC I类样分子CD1d呈递(US2003/0157135)。

US2003/0157135进一步陈述了，α-GalCer和相关糖基神经酰胺不仅用作抗原而且还用作可溶性佐剂，其能够增强和/或延长由其它抗原诱导的保护性免疫反应的持续时间。

因此，在本发明的一些实施方式中，免疫刺激剂可以是iNKT细胞激动剂。该激动剂可以是外源性或内源性激动剂。它可以是糖苷激动剂(如α-半乳酶糖神经酰胺)或非糖苷激动剂(如苏糖醇神经酰胺)。

在一些实施方式中，免疫刺激剂可以是脂质或糖脂。由CD1呈递的糖脂可以分为不同类别，包括例如二酰甘油脂、鞘脂、霉菌酸酯以及phosphomycoketides(Zajonc and Krenenberg，Current Opinion in Structural Biology，2007，17：521-529)。当由I组CD1分子呈递时，来自致病性分枝杆菌的微生物抗原，如葡萄糖单霉菌酸酯(GMM)、甘露糖phosphomycoketides以及磷脂酰肌醇甘露糖苷已知是人T细胞的强效配体(Zajonc an Kronenberg，上文)。本发明的免疫刺激剂可以是糖基神经酰胺，例如α-半乳糖苷神经酰胺(KRN 7000，US2003/0157135)或其类似物，如例如苏糖醇神经酰胺(IMM47)或其它非糖苷iNKT细胞激动剂(如在Silk et al.Cutting Edge J.Immunol，2008中所描述的)。根据本发明可以使用的另外的类似物以及生产上述类似物的方法披露在WO2007/050668中，其以引用方式结合于本文。例如，根据本发明可以使用的类似物包括具有化学式I的化合物

其中

R¹表示适于占据人CD1d的C’通道的疏水性部分，R²表示适于占据人CD1d的A’通道的疏水性部分，使得当结合于人CD1d时，与由α-半乳糖苷神经酰胺的鞘氨醇链的末端nC₁₄H₂₉占据的体积相比，R1填充至少30％的C’通道的占据体积，并且当结合于人CD1d时，与由α-半乳糖苷神经酰胺的酰基链的末端nC₂₅H₅₁占据的体积相比，R²填充至少30％的A’通道的占据体积，

R³表示氢或OH，

R^a和R^b各自表示氢，此外，当R³表示氢时，R^a和R^b一起可以形成单键，

X表示-CHA(CHOH)nY或-P(＝O)(O-)OCH₂(CHOH)_mY，其中Y表示CHB1B2，

n表示1至4的整数，m表示0或1，

A表示氢，

B1和B2之一表示H、OH或苯基，而另一个表示氢，或B1和B2之一表示羟基，而另一个表示苯基，

此外，当n表示4时，A连同B1和B2之一一起形成单键，而B1和B2中的另一个表示H、OH、或OSO₃H，

以及其药用盐。

免疫刺激剂可以是阿拉伯糖醇-神经酰胺、甘油-神经酰胺、6-脱氧和6-硫-肌醇神经酰胺。

本发明的发明人表明，BCR介导的摄取便于将颗粒免疫刺激性脂质有效呈递至iNKT细胞。这种机制允许，在BCR识别甚至低亲和力抗原以后，CD1介导呈递脂质，只要超过规定的亲合力阈值。结果，激活的iNKT细胞有助于特异性B细胞增殖、滤泡外浆B细胞分化以及高滴度的特异性IgM和早期类别转换抗体的生产。

本发明的发明人已利用BCR作为一种方式来实现递送的选择性和特异性B细胞对颗粒抗原脂质的有效内化。

已主要体外表征了iNKT细胞诱导B细胞增殖的能力(16)。本发明的发明人表明，甚至在没有特异性CD4T细胞的情况下，体内iNKT细胞也可以帮助B细胞增殖和抗体生产。这些观测结果与以前的研究结果是一致的，其中用抗原和αGalCer免疫MHC II缺损小鼠会诱导可检测水平的IgG，这表明iNKT细胞可以代替辅助CD4T细胞功能(27)。因此，这涉及更弱抗原的免疫反应的刺激，如那些经常用于抗菌疫苗的抗原，其中上述抗菌疫苗缺乏相关的T细胞表位。iNKT细胞具有抗原遭遇型表型并且它们可以非常快速地应答CD1d呈递抗原而无需克隆扩充。本发明的发明人已证明，在BCR衔接以后，直接iNKT细胞辅助导致滤泡外PC分化和早期抗体生产。滤泡外PC负责在T依赖性反应中抗体的初始波的生成(5)。这些抗体可以具有中和效应，以免受病毒和细菌的影响。这提示在抵抗不同病原体的早期免疫反应的诱导中直接iNKT细胞辅助相对于B细胞的主要作用。与此一致，iNKT缺损小鼠在清除多种微生物方面呈现出严重缺陷，上述微生物包括肺炎链球菌、Sphingomonas ssp.、以及柏氏疟原虫(28)。在脑型疟的模型中，在用柏氏疟原虫感染以后，在早期抗体反应的发展中，已提出iNKT细胞作为参与者(29)。在这种情况下，在CD1-/-小鼠中，尤其是在寄生物激发以后的早期时间点，减少了特异性抗体生产。

因此，iNKT在形成体内早期抗体反应中可以发挥关键作用，从而提供相对于入侵病原体的增强的保护。

因此，在免疫反应的范围内，本文描述的观测结果的功能上的意义是什么？通过来自LPS-阴性菌如鞘氨醇单胞菌、Erlichia以及疏螺旋体的糖脂可以激活iNKT细胞(25)(26)(30)。可替换地，iNKT细胞可以识别仍不明确的内源性脂配体，其中经由CD1d呈递，并响应于TLR信号由DC加以上调(25)(31)(32)(33)。虽然已知所有B细胞表达CD1d，但这种表达在边缘区B细胞中被增强，使得它们呈现CD21^高CD23^低CD1d^高表型。这种表型提示，边缘区B细胞在感染以后的CD1d依赖性iNKT激活中可以起重要作用。确实，这些细胞定位在脾脏的边缘窦中，其中它们可以提供相对于血液传染颗粒抗原的早期免疫反应(34)(35)。我们假设，表达对于细菌糖脂特异性的BCR的边缘区B细胞便于更有效募集辅助iNKT细胞以及伴随生成特异性抗体反应。可替换地，能够内化颗粒微生物的B细胞可以接收TLR信号以及随后的辅助iNKT细胞(在CD1d限制性内源性配体的上调以后)。

本文提供的结果可以鉴定颗粒性抗原和免疫刺激性脂质的BCR内化，作为体内调节iNKT介导的B细胞反应的方式。B细胞与iNKT细胞之间的协作导致早期特异性抗体反应的发展，从而强调了iNKT细胞在协调先天性和适应性免疫反应中的重要性。

TLR激动剂

细胞内TLR如TLR3、7、8以及9可以识别核酸。因此，合成寡脱氧核苷酸(ODN)如TLR9激动剂CpG已先前用作免疫刺激剂(Klinman，2004，Nature Reviews，4：249)。这些TLR免疫刺激剂的操作机制不同于脂质如αGalCer所采用的机制。这些免疫刺激剂直接激活它们被其吸收的细胞，最终达到，例如，细胞因子和趋化因子的分泌，其导致免疫反应的进一步刺激。

TLR表达模式是每种细胞类型特有的(Chiron et al，2009)。在人B细胞中TLR表达的特征在于TLR 1、6、7、9以及10的高表达，其中在B细胞分化期间表达模式会变化。

可溶性CpG ODN被免疫细胞快速内化并与存在于胞吞泡中的TLR9相互作用。通过TLR家族的大多数成员(包括TLR9)的细胞激活涉及信号级联反应，其通过髓样分化初次应答基因88(MYD88)、白细胞介素-1(IL-1)、受体激活激酶(IRAK)以及肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关因子6(TRAF6)进行，并最终达到多种转录因子的激活，包括核因子-κb(NF-κB)、激活蛋白1(AP1)、CCAAT增强子结合蛋白(CEBP)以及cAMP效应元件结合蛋白(CREB)。这些转录因子直接上调细胞因子/趋化因子基因表达。B细胞和浆细胞样树突细胞(pDC)是表达TLR9和直接应答CpG刺激的主要人细胞类型。通过CpG DNA，这些细胞的激活可以引发免疫刺激级联反应，其最终达到天然杀伤(NK)细胞、T细胞以及单核细胞/巨噬细胞的间接成熟、分化以及增殖。共同地，这些细胞分泌细胞因子和趋化因子，其产生促炎(IL-1、IL-6、IL-18和TNF)以及T_H1偏爱(干扰素-γ、IFN-γ、以及IL-12)免疫环境(Klinman，2004，Nature Reviews，4：249)。

因此，在一些实施方式中，免疫刺激剂是TRL激动剂。例如，它是内体TLR激动剂，尤其是核酸，如例如DNA、RNA(双链或单链)。免疫刺激剂可以，例如包含CpG寡聚脱氧核苷酸或多聚U核酸。

永生化细胞的产生

如本文描述的用于抗原特异性递送免疫刺激剂的方法可以用于产生生产抗原特异性单克隆抗体的永生化B细胞和B细胞系。

因此，在一个方面，提供了一种用于生成永生化细胞的方法，所述方法包括以下步骤

(i)使B细胞与如本文描述的产品或组合物接触，以及

(ii)永生化步骤(i)的B细胞。

可以在步骤(i)以后进行上述步骤(ii)，或可以同时进行两个步骤。

可以离体进行步骤(i)，即在B细胞所源自的生物之外。

可以通过任何合适的方法来实现B细胞的永生化，如例如(但不限于)用合适的病毒进行转化、和/或融合于另一种永生化细胞和/或附着于CD40。

用转化病毒来永生化B细胞的方法以及合适的病毒在本领域是已知的。(Lanzavecchia et al，Curr Opin Biotechnol，2007Dec；18(6)：523-8，Epub2007Dec 11，将其内容以引用方式结合于本文)。可以使用任何合适的转化病毒。病毒可以例如是EB病毒(EBV)。EBV适合于转化大多数灵长类的B细胞，但必要时对于其它生物可以选择合适的病毒。例如，在递送涂布有抗原和例如TLR激动剂的载体以后，仅在已接受TLR刺激的抗原特异性B细胞中大大增强通过EB病毒转化的感染(使用在Traggiai E et al(Traggiai E，Becker S，Subbarao K，Kolesnikova L，Uematsu Y，Gismondo MR，Murphy BR，Rappuoli R，Lanzavecchia A.Nature Medicine 2004vol.10pp.871-5)中所描述的方法)。与非激活的B细胞相比，在TLR激活细胞中转化效率显著增加。因此，在那些被转化成永生化细胞系的细胞中抗原特异性细胞的总比例显著增加，即转化群体特别富集有抗原特异性B细胞。因此，本发明提供了一种用于快速生产对所需要的特定抗原特异性的永生化B细胞系的方法，而没有在EBV转化以后的费力的筛查程序。

可以例如通过融合于另一种永生化细胞来实现永生化。合适的方法和材料对于本领域技术人员来说是已知的。例如，Shirahata et al，Methods Cell Biol，1998；57：111-45描述了这样的方法，将其以引用方式结合于本文。(在Shirahata等中，建立了具有高融合效率的NAT-30和HO-323，人亲代细胞系，以制备许多产生癌特异性人单克隆抗体的杂交瘤细胞系。因为NAT-30和HO-323细胞系是IgM生产者，所以难以获得产生IgG的杂交瘤，这是由于由杂交瘤产生的免疫球蛋白的类型受到亲代细胞特性的强烈影响。因此，建立了来自人T淋巴瘤的产生非免疫球蛋白的人亲代细胞系，A4H12，其可以有效地获得产生IgG的人杂交瘤。制备人杂交瘤的另一个问题在于，出于道德的理由，难以获得用可选抗原免疫的B淋巴细胞。为了克服该问题，作者描述了体外免疫方法，其已开发用来便于将大量的B淋巴细胞暴露于培养的癌细胞或可溶性抗原。作者讨论了人融合配偶体、体外免疫方法、以及利用电融合方法来制备人际杂交瘤。)

可以例如通过CD40的刺激，(CD40连接)来实现永生化，如例如由Wiesner et al，PLoS ONE，Jan 2008，issue 1：1-13所报道的，将其内容以引用方式结合于本文。(作者表明，通过在白细胞介素-4存在的情况下触发它们的表面受体CD40，通过T辅助细胞模拟B细胞激活的信号的组合，可以激活和诱导人B淋巴细胞以体外增殖。为了建立没有EBV的CD40刺激的B细胞培养物，在白细胞介素-4和环孢素A存在的情况下，将来自EBV阳性供体的未分离的外周血单核细胞(PBMC)以不同数目/微量培养平板接种在表达CD40L的刺激细胞上。每5至7天用新鲜刺激细胞再刺激细胞并当发展突出时加以扩大。作者观察到，如果使用较少的最初细胞数/培养物(2×10⁴至5×10⁵PBMC)，则有利于B细胞的快速发展。在27天以后，借助于10⁵PBMC建立的来自5个供体的培养物，关于B细胞，已增殖平均282倍，并且主要为B细胞(87±5％CD19+细胞)。)

然后，利用本领域已知的方法，可以将永生化细胞加入到培养物中以建立永生化细胞系。

虽然以上描述的方法适用于任何物种，但它们特别适用于产生单克隆人抗体。用于生成人或人样单克隆抗体的常用方法包括例如小鼠抗体的人源化、从不同复杂性的文库分离抗体以及在转基因用于人Ig基因座的小鼠(“异种小鼠”)中利用经典方法来生产杂交瘤。然而，小鼠单克隆抗体的人源化是费力且不完全的程序。随机抗体文库表示非偏爱所有组成成分，因而可以用来选择相对于高度保守抗原的抗体特异性，但导致低亲和力的抗体。选自抗原引发B细胞的文库富集有特定的特异性，但并不保存最初的VH-VL配对，并且通常导致这样的抗体，与在最初的抗体所有组成成分中存在的那些抗体相比，其对于抗原具有更低的亲和力。可以相对于所选择的抗原来免疫异种小鼠，但该系统和经典的小鼠杂交瘤技术共享以下限制：在不同于人的物种中选择抗体。

在一些实施方式中，在步骤(i)中的B细胞是原初B细胞，即B细胞以前还没有与感兴趣的抗原接触。因此本发明提供了从头产生抗原特异性抗体的改善的方法。

优选地，B细胞是人B细胞。

在一个方面，提供了一种用于产生永生化B淋巴细胞的方法，该方法包括以下步骤(i)：在如本文描述的产品或组合物，即能够BCR介导内化并且包含载体和附着于载体的BCR结合抗原的产品、或包含上述产品和合适载体的组合物，存在的情况下，离体永生化B淋巴细胞。

如上所述，可以通过任何合适的方法来实现永生化。

在一个方面，提供了一种用于产生永生化B淋巴细胞的克隆的方法，其中永生化B淋巴细胞能够产生具有期望的抗原特异性的单克隆抗体，该方法包括：

(i)使B淋巴细胞与如本文描述的产品或组合物离体接触，以及

(ii)永生化步骤(i)的B细胞。

可以通过任何合适方法，例如上文描述的方法，来实现永生化。

该方法可以进一步包括筛查转化的淋巴细胞的抗原特异性。该方法可以进一步包括分离永生化的B淋巴细胞。

可以顺序或同时进行步骤(i)和(ii)。

在一个方面，提供了一种用于产生永生化B淋巴细胞的克隆的方法，其中上述永生化B淋巴细胞能够产生具有期望的抗原特异性的人单克隆抗体，该方法包括：

(i)在如本文描述的产品或组合物存在的情况下，永生化包含B淋巴细胞或由B淋巴细胞组成的细胞群体。

该方法可以进一步包括以下步骤：

(ii)筛查转化淋巴细胞的抗原特异性。

该方法可以进一步包括步骤(iii)：分离永生化B淋巴细胞。

在以上描述的方法中，B淋巴细胞可以是未分化的或原初B淋巴细胞或记忆B淋巴细胞或两者的混合物。虽然B细胞可以具有任何起源，如哺乳动物(或非人哺乳动物)，但它优选是人B细胞。

在一些实施方式中，待永生化的B细胞是记忆B淋巴细胞，其获自先前已接触感兴趣的抗原的生物。因此，如本文描述的产品或组合物可以用来再激活记忆B淋巴细胞，并且本发明提供了用来再激活记忆B淋巴细胞的改善的方法。优选地，记忆B淋巴细胞是人记忆B淋巴细胞。WO2004/076677，将其全部内容以引用方式结合于本文，描述了一种用于生产永生化人B记忆淋巴细胞的方法，该方法包括以下步骤：在多克隆B细胞激活因子存在的情况下，利用转化病毒，转化人B记忆淋巴细胞。多克隆B细胞激活因子(如CpG序列)发现可以增强EBV永生化和克隆EBV永生化细胞的效率。

Li等人(Li et al，PNAS March 7，2006，vol 103：3557-3562)描述了一种采用原代B细胞来生成产生特异性抗体的细胞系的方法。该方法需要离体将原代B细胞和T细胞的混合物暴露于所述抗原以产生分泌特异性抗体的永生化B细胞。可以在没有T细胞存在的情况下实施上述方法。

上述方法可以进一步包括在没有T细胞存在的情况下使用B淋巴细胞。

待转化的B细胞可以来自任何合适的物种和来自各种来源(例如，来自全血、来自外周血单核细胞(PBMC)、来自血液培养物、来自骨髓、来自器官等)。优选地，B细胞是人B细胞。用于获得人B细胞的合适的方法在本领域是众所周知的。样品可以包括不是记忆B细胞的细胞，例如，其它血细胞。

可以在永生化步骤以前通过利用本领域已知的方法来选择呈现期望的抗原特异性的特定的B淋巴细胞亚群。

B细胞的筛查和分离

筛选转化的B细胞，以获得具有期望的抗原特异性的那些B细胞，然后可以由阳性细胞产生个别的B细胞克隆。可以通过ELISA、通过组织或细胞(包括转染细胞)的染色、中和测定或本领域已知的用于鉴定期望的抗原特异性的许多其它方法之一，来进行筛查步骤。测定的选择可以基于简单的抗原识别，或可以另外基于期望的功能例如选择中和抗体而不只是抗原结合抗体，选择可以改变靶细胞的特性的抗体，如它们的信号级联反应、它们的形状、它们的生长速率、它们影响其它细胞的能力、它们对其它细胞或其它试剂或条件的变化的影响的反应、它们的分化状态等。

可以利用有限稀释、微操作、单细胞沉积(通过细胞分选或本领域已知的另一种方法)，来进行从阳性细胞的混合物分离单个克隆的克隆步骤。优选地，利用有限稀释来进行克隆。

本发明的方法可以产生永生化B细胞，其产生具有期望的抗原特异性的抗体。因此本发明提供了一种通过本发明的方法可获得或获得的永生化B细胞克隆。可以以各种方式来使用这些B细胞，例如，作为单克隆抗体源、作为编码感兴趣的单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)源、用于递送到患者供进行细胞疗法、用于研究等。

本发明提供了一种可获自或获自本发明的B细胞克隆的单克隆抗体。本发明还提供了这些单克隆抗体的片段，尤其是保留抗体的抗原结合活性的片段。

抗原

根据本发明，可以使用任何合适的抗原。

如果用于用来预防性或治疗性接种疫苗或用来治疗疾病，如例如恶性、传染病或变态反应，的药物组合物中，则抗原可以来自真核细胞(例如，肿瘤、寄生物、真菌)、细菌细胞、病毒颗粒或它们的任何部分。

根据本发明有用的抗原的实例包括但不限于(i)疟疾特异性抗原如照射疟原虫子孢子或合成肽抗原，其包含疟原虫环子孢子(CS)蛋白的至少一个T细胞和/或B细胞表位(参见下文)；(ii)病毒蛋白或肽抗原如那些病毒蛋白或肽抗原，其来自流感病毒(例如，表面糖蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)[如火鸡流感HA或A型禽流感/Jalisco/95H5HA)；免疫缺陷病毒(例如，猫免疫缺陷病毒(FIV)抗原、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)抗原、或人免疫缺陷病毒抗原(HIV)如gp120、gp160、p18抗原[描述在实施例2中，下文])、Gag p17/24、Tat、Pol、Nef、以及Env；疱疹病毒(例如，糖蛋白，例如，来自猫疱疹病毒、马疱疹病毒、牛疱疹病毒、假狂犬病病毒、犬疱疹病毒、单纯疱疹病毒(HSV，例如，HSV tk、gB、gD)、马雷克病病毒、疱疹病毒或火鸡(HVT)、或巨细胞病毒(CMV)、或EB病毒)；肝炎病毒(例如，乙肝表面抗原(HBsAg))；乳头状瘤病毒；牛白血病病毒(例如，gp51，30包膜抗原)；猫白血病病毒(FeLV)(例如，FeLV包膜蛋白，纽卡斯尔病病毒(NDV)抗原，例如，HN或F)；劳斯相关病毒(如RAV-1env)；传染性支气管炎病毒(例如，基质和/或preplomer)；黄病毒(例如，日本脑炎病毒(JEV)抗原、黄热病抗原、或登革热病毒抗原)；麻疹病毒属(例如，犬瘟热病毒抗原、麻疹抗原、或牛瘟抗原如HA或F)；狂犬病(例如，狂犬病糖蛋白G)；细小病毒(例如，犬细小病毒抗原)；痘病毒(例如，缺肢抗原、金丝雀痘病毒抗原、或禽痘病毒抗原)；水痘病毒(水痘带状疱疹抗原)；传染性粘液囊病病毒(例如，VP2、VP3、或VP4)；汉滩病毒；流行性腮腺炎病毒；(iii)细菌抗原如脂多糖，其分离自革兰氏阴性细菌细胞壁和葡萄球菌特异性蛋白质或肽、链球菌特异性蛋白质或肽、肺炎球菌特异性蛋白质或肽(例如，PspA[参见PCT公开号WO 92/14488])、淋病奈瑟菌特异性疏螺旋体特异性蛋白质或肽(例如，与莱姆病有关的疏螺旋体如布氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、以及嘎氏疏螺旋体的OspA、OspB、OspC抗原[参见，例如，美国专利号5,523,089；PCT公开号WO 90/04411、WO 91/09870、WO 93/04175、WO 96/06165、WO 93/08306；PCT/US92/08697；Bergstrom et al.，Mol.Microbiol.，3：479-486，1989；Johnson et al.，Infect.and Immun.60：1845-1853，1992；Johnson et al.，Vaccine 13：1086-1094，1995；The Sixth International Conference on Lyme Borreliosis：Progress on the Development of Lyme Disease Vaccine，Vaccine 13：133-135，1995])、以及假单胞菌特异性蛋白质或肽；(iv)真菌抗原如那些分离自念珠菌、毛癣菌、或ptyrosporum的真菌抗原；以及(v)肿瘤特异性蛋白如ErbB受体、Melan A[MART1]、gp100、酪氨酸酶、TRP-1/gp75、以及TRP-2(在黑色素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱、头部和颈部、以及非小细胞癌中)；HPV EG和E7蛋白(在宫颈癌中)；粘蛋白[MUC-1](在乳、胰、结肠、以及前列腺癌中)；前列腺特异性抗原[PSA](在前列腺癌中)；癌胚抗原[CEA](在结肠、乳以及胃肠癌中)以及这样的共享的肿瘤特异性抗原如MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1，2，8、CAGE-3至7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV、以及TRP2-INT2。

根据本发明使用的抗原的实例以及它们的制备方法描述在US2007/0231344中，将其以引用方式结合于本文。

用于选择和制备用于本文所描述的治疗的组合物和方法的抗原的方法对于本领域技术人员来说是已知的。这样的抗原的代表性实例包括但不限于来自病原细菌、分枝杆菌或病毒的外被或外膜的抗原；来自细胞例如癌细胞的脂质、聚糖或肽；或合成分子。在特异性抗原决定簇是已知的情况下，这可以用于偶合反应，并且，对于本发明来说，在这些情况下，将被看作“抗原”。

抗原包括但不限于蛋白，多肽，肽，多糖如聚糖，多糖结合物，多糖和其它分子的肽和非肽类模拟物，小分子，脂质，糖脂，以及碳水化合物。

使用本文描述的产品和方法，可以提高对抗原的免疫反应，上述抗原通常是弱免疫原，如例如小肽，修饰肽如例如磷酸肽，或碳水化合物。因此根据本发明使用的抗原可以包括，例如，肽，修饰肽如例如磷酸肽，或碳水化合物。抗原可以是，例如，肽、磷酸肽、或碳水化合物。

抗原呈递细胞将抗原肽呈递到MHC分子上。T辅助细胞(T_H细胞)与MHC第II类分子相互作用。响应于激活，TH细胞会分泌细胞因子，其有助于B细胞的激活。MHC第II类分子结合通常长度为约15至24个氨基酸的肽。更小或更长的肽不可能经由MHC第II类分子被呈递，因此不能诱导T_H细胞反应。

然而，如果由于其特异性序列(即，肽可能缺乏T细胞表位)，T_H细胞受体不能识别结合于MHC分子的肽，则甚至具有适当长度的肽也可以不能诱导强有力的TH细胞反应。

本发明的产品和方法因而便于诱导对抗原的免疫反应，其中上述抗原并不诱导T_H细胞反应(当以可溶形式给予时，即并不附着于如本文描述的载体)。

在一个方面，本发明因此提供了一种用于在受试者中诱导或增加对BCR结合抗原的抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括给予受试者包含载体和附着于载体的所述抗原的产品，并且其中免疫刺激剂附着于载体或与所述产品共同给予，并且其中当给予受试者时，可溶形式(即不附着于载体)的抗原不能诱导T_H细胞反应。在这方面，“诱导”是指这样的情况，其中可溶形式的抗原不能诱导抗原特异性免疫反应，而当抗原附着于如本文描述的载体时，可以诱导免疫反应。在这方面，“增加”是指这样的情况，其中可溶形式的抗原仅诱导弱抗原特异性免疫反应，而当抗原附着于如本文描述的载体时，可以诱导更强的免疫反应。抗原可以，例如，包括肽、磷酸肽、或碳水化合物。抗原可以是，例如，肽、磷酸肽、或碳水化合物。

用于将抗原给予受试者的方法在本领域中是众所周知的。通常，可以通过任何方式将如本文描述的抗原，即颗粒性抗原，直接给予受试者，如，例如，胃肠道外给予如静脉内、肌内、或皮下给予，透皮、粘膜、鼻内、皮内或气管内给予或口服给予。可以全身或局部给予抗原。

抗原可以来自细菌、分枝杆菌、病毒、真菌以及寄生物。应当理解，来自特定微生物的抗原可以用来预防和/或治疗上述微生物的感染。以下提供了可以从其衍生抗原的微生物的清单。

细菌包括但不限于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌包括但不限于巴氏杆菌物种、葡萄球菌物种、以及链球菌物种。革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌物种、以及沙门菌物种。感染菌的具体实例包括但不限于幽门螺杆菌、布氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、分枝杆菌物种(例如，结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌)、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、单核细胞增多利斯特菌、化脓链球菌(A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、链球菌属(草绿色链球菌组)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌属(厌氧物种)、肺炎链球菌、致病性弯曲杆菌属、肠球菌属、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、棒杆菌属、猪红斑丹毒丝菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、破伤风梭状芽孢杆菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀巴斯德氏菌、拟杆菌属、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、苍白密螺旋体、细弱密螺旋体、钩端螺旋体属、立克次氏体、以及衣布放线菌。

病毒包括但不限于interoviruses(包括但不限于小核糖核酸病毒科，如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒)、轮状病毒、腺病毒、肝病毒。在人类中已发现的病毒的具体实例包括但不限于逆转录病毒科(例如，人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也被称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III；以及其它分离物，如HIV-LP；细小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如，引起肠胃炎的菌株)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，泡疹性口炎病毒、狂犬病病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，泡疹性口炎病毒、狂犬病病毒)；纤丝病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(例如，汉滩病毒、邦加病毒、白蛉热病毒以及内罗毕病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒、环状病毒以及轮状病毒)；双RNA病毒科；肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如，非洲猪瘟病毒)；以及未分类病毒(例如，海绵状脑病的病原体、δ肝炎的病原体(认为是乙型肝炎病毒的缺损卫星)、非甲型肝炎、非乙型肝炎的病原体(1类＝内部传播；2类＝胃肠道外传播(即，丙型肝炎)；诺沃克及相关病毒、以及星形病毒)。

感染人和非人脊椎动物的病毒包括逆转录病毒、RNA病毒以及DNA病毒。该组逆转录病毒包括简单逆转录病毒和复杂逆转录病毒。简单逆转录病毒包括B型逆转录病毒、C型逆转录病毒以及D型逆转录病毒的亚组。B型逆转录病毒的一个实例是鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C型逆转录病毒包括亚组C型A组(包括劳斯肉瘤病毒(RSV)、禽白血病病毒(ALV)、以及禽成髓细胞病毒(AMV))和C型B组(包括鼠白血病病毒(MLV)、猫白血病病毒(FeLV)、小鼠肉瘤病毒(MSV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、脾坏死病毒(SNV)、网状内皮组织增生病毒(RV)以及猴肉瘤病毒(SSV))。D型逆转录病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和1型猴逆转录病毒(SRV-1)。复杂逆转录病毒包括慢病毒、T细胞白血病病毒以及泡沫病毒的亚组。慢病毒包括HIV-1，但还包括HIV-2、SIV、绵羊髓鞘脱落病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、以及马传染性贫血病毒(EIAV)。T细胞白血病病毒包括HTLV-I、HTLV-II、猴T细胞白血病病毒(STLV)、以及牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)、猴泡沫病毒(SFV)以及牛泡沫病毒(BFV)。

在有脊椎的动物中为抗原的其它RNA病毒的实例包括但不限于呼肠孤病毒科的成员，包括正呼肠病毒属(哺乳动物和禽逆转录病毒的多种血清型)、环状病毒属(蓝舌病病毒、Eugenangee病毒、凯默诺夫病毒、非洲马疫病毒、以及科罗拉多蜱热病毒)、轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、小鼠轮状病毒、猿猴轮状病毒、牛或羊轮状病毒、禽轮状病毒)；小核糖核酸病毒科，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A和B、人肠道细胞病变孤儿(ECHO)病毒、甲型肝炎病毒、猴肠道病毒、鼠脑脊髓炎(ME)病毒、鼠脊髓灰质炎病毒、牛肠道病毒、猪肠道病毒)、心脏病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)、门哥病毒)、鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113种亚型；其它鼻病毒)、Aptho病毒属(口蹄疫病毒(FMDV)；杯状病毒科，包括猪水疱性疱疹病毒、圣米格尔海狮病毒、猫细小核糖核酸病毒以及诺沃克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东部马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、切昆贡亚热病毒、翁-尼病毒、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒)、黄病毒属(蚊子传播的黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、昆津病毒、中欧蜱传播的病毒、远东蜱传播的病毒、科萨努尔森林病毒、跳跃病病毒、波瓦生病毒、鄂木斯克出血热病毒)、风疹病毒属(风疹病毒)、瘟病毒属(粘膜病病毒、猪霍乱病毒、边界病病毒)；布尼亚病毒科，包括布尼亚病毒属(布尼雅和相关病毒、加利福尼亚脑炎组病毒)、白蛉热病毒属(白蛉热西西里病毒、裂谷热病毒)、内罗毕病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕羊病病毒)、以及吴孔病毒属(尤尤库尼米和相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，许多人亚型)；猪流感病毒、以及禽和马流感病毒；B型流感(许多人亚型)、以及C型流感(可能独立的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(副流感病毒1型、仙台病毒、血细胞吸附病毒、副流感病毒2型至5型、纽卡斯尔病病毒、流行性腮腺炎病毒)、麻疹病毒属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒、温热病病毒、牛瘟病毒)、肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒以及小鼠的肺炎病毒)；森林病毒、辛德毕斯病毒、切昆贡亚热病毒、翁-尼病毒、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒)、黄病毒属(蚊子传播的黄热病病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、昆津病毒、中欧蜱传播的病毒、远东蜱传播的病毒、科萨努尔森林病毒、跳跃病病毒、波瓦生病毒、鄂木斯克出血热病毒)、风疹病毒属(风疹病毒)、瘟病毒属(粘膜病病毒、猪霍乱病毒、边界病病毒)；布尼亚病毒科，包括布尼亚病毒属(布尼雅和相关病毒、加利福尼亚脑炎组病毒)、白蛉热病毒属(白蛉热西西里病毒、裂谷热病毒)、内罗毕病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕羊病病毒)、以及吴孔病毒属(尤尤库尼米和相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，许多人亚型)；猪流感病毒、以及禽和马流感病毒；B型流感(许多人亚型)、以及C型流感(可能的独立的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(副流感病毒1型、仙台病毒、血细胞吸附病毒、副流感病毒2型至5型、纽卡斯尔病病毒、流行性腮腺炎病毒)、麻疹病毒属(麻疹病毒、亚急性硬化性全脑炎病毒、温热病病毒、牛瘟病毒)、肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒以及小鼠的肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水疱病毒属(VSV)、钱迪普病毒、佛朗德-哈特公园病毒)、狂犬病毒属(狂犬病病毒)、鱼类弹状病毒、以及两种可能的弹状病毒(马尔堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)、塔卡里伯病毒组、以及拉沙病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒、人肠道冠状病毒、以及猫传染性腹膜炎(猫冠状病毒)。

感染有脊椎的动物的示例性的DNA病毒包括但不限于痘病毒科，包括正痘病毒属(大天花、小天花、猴痘牛痘、牛痘、水牛痘、兔痘、缺肢)、兔痘病毒属(黏液瘤、纤维瘤)、禽痘病毒属(禽痘、其它禽痘病毒)、山羊痘病毒属(羊痘、山羊痘)、猪痘病毒属(猪痘)、副痘病毒属(接触传染性脓疱性皮炎病毒、假牛痘、牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒、蛙病毒2和3、鱼类淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(1型和2型单纯疱疹、水痘-带状疱疹、马流产病毒、马疱疹病毒2和3、假狂犬病病毒、牛传染性角膜结膜炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猫鼻气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒)、β-疱疹病毒(人巨细胞病毒以及猪、猴和啮齿动物的巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)、马雷克病病毒、鼠猴疱疹、蛛猴疱疹病毒、兔疱疹病毒、豚鼠疱疹病毒、蛙疱疹病毒)；腺病毒科，包括乳腺腺病毒属(人亚组A、B、C、D、E以及未分组的；猿猴腺病毒(至少23种血清型)、传染性犬肝炎、以及牛、猪、羊、蛙以及许多其它物种的腺病毒、禽腺病毒属(禽腺病毒)；不可培养的腺病毒；乳多空病毒科，包括乳头瘤病毒(人乳头状瘤病毒、牛乳头状瘤病毒、肖普兔乳头状瘤病毒、以及其它物种的各种病原乳头状瘤病毒)、多瘤病毒属(多瘤病毒、猿猴空泡剂(SV-40)、兔空泡剂(RKV)、K病毒、BK病毒、JC病毒、以及其它灵长类多瘤病毒如亲淋巴性乳头状瘤病毒)；细小病毒科，包括腺相关病毒属、细小病毒属(猫全白细胞减少病病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、阿留申水貂病病毒等)。最后，DNA病毒可以包括并不属于上述科的病毒如库鲁病和克-雅病病毒以及慢性传染性神经系病病毒(CHINA病毒)。

真菌是真核生物，仅它们的几种可以在有脊椎的哺乳动物中引起感染。由于真菌是真核生物，所以它们在大小、结构的组织化、生命周期以及增殖机制方面显著不同于原核细菌。真菌通常是基于形态特征、再生方式以及培养特性来分类的。虽然真菌可以在受试者中引起不同类型的疾病，如在吸入真菌抗原以后的呼吸道变态反应，但由于摄取有毒物质引起的真菌中毒，如毒伞肽和毒蕈肽(由毒蘑菇产生)以及黄曲霉毒素(由曲霉菌产生)，并不是所有的真菌都会引起传染病。

感染性真菌可以引起全身或表面感染。原发性全身性感染可以发生在正常健康受试者中，而机会性感染最经常存在于免疫能力受损的受试者中。引起原发性全身性感染的最常见真菌剂包括芽生菌、球孢子菌、以及组织胞浆菌。在免疫受损或免疫抑制的受试者中引起机会性感染的常见真菌包括但不限于白色念珠菌(一种生物，其是呼吸道菌群的正常一部分)、新型隐球菌(有时在呼吸道的正常菌群中)、以及各种曲霉菌。系统性真菌感染是内部器官的侵袭性感染。生物通常通过肺、胃肠道、或静脉内管道进入体内。这些类型的感染可以由原发性病原真菌或机会性真菌引起。

真菌包括但不限于小孢子菌属或traicophyton species，即，犬小孢霉、石膏样小孢霉、tricofitin rubrum、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、以及白色念珠菌。

寄生物包括但不限于镰状疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、微小巴贝虫、分岐巴贝虫、克氏锥虫、鼠弓形体、旋毛虫、硕大利什曼原虫、杜诺万利什曼原虫、巴西利什曼原虫和热带利什曼原虫、冈比亚锥虫、罗得西亚锥虫以及曼森裂体吸虫。

在文献中已广泛描述了其它医学相关微生物，例如，参见C.G.AThomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，将其全部内容以引用方式结合于本文。每个上述清单是说明性的而不是限制性的。

其它病原体包括淋病、幽门螺旋杆菌、葡萄球菌属、链球菌属、如肺炎链球菌、梅毒；病毒如SARS病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、HIV病毒、西尼罗河病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒；寄生物如贾第虫、以及三日疟原虫(疟疾)；以及分枝杆菌如结核分枝杆菌。

抗原可以包括由微生物产生的毒素或其它分子。下面提供了这样的分子的实例。

毒素的实例包括相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白以及士的宁。毒素的另外的实例包括由白喉棒状杆菌(白喉)、百日咳鲍特杆菌(百日咳)、霍乱弧菌(霍乱)、炭疽杆菌(炭疽)、肉毒杆菌(肉毒中毒)、破伤风梭状芽孢杆菌(破伤风)、以及肠出血性大肠杆菌(出血性腹泻和溶血性尿毒症综合征)产生的毒素，金黄色葡萄球菌α毒素、志贺菌毒素(ST)、1型细胞毒性坏死因子(CNF1)、大肠杆菌热稳定毒素(ST)、肉毒杆菌、破伤风神经毒素、金黄色葡萄球菌中毒性休克综合症毒素(TSST)、嗜水气单胞菌气单胞菌溶素、产气荚膜梭状芽胞杆菌产气荚膜梭菌溶血素O、大肠杆菌溶血素、单核细胞增多利斯特菌素O、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素、化脓链球菌链球菌溶血素O、绿脓假单胞菌外毒素A、大肠杆菌DNF、大肠杆菌LT、大肠杆菌CLDT、大肠杆菌EAST、炭疽杆菌水肿因子、百日咳鲍特杆菌皮肤坏死毒素、肉毒杆菌C2毒素、肉毒杆菌C3毒素、难辨梭状芽胞杆菌毒素A、以及难辨梭状芽胞杆菌毒素B。

细菌的另外的实例包括但不限于链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、难辨梭状芽胞杆菌、军团杆菌属、肺炎球菌属、嗜血菌属(例如，流感嗜血杆菌)、克雷伯菌属、肠杆菌属、柠檬酸细菌属、奈瑟菌属(例如，脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌)、志贺氏菌属、沙门氏菌属、利斯特菌属(例如，单核细胞增多利斯特菌)、巴斯德菌属(例如，多杀巴斯德菌)、链杆菌属、螺菌属、密螺旋体属(例如，苍白密螺旋体)、放线菌属(例如，衣布放线菌)、疏螺旋体属、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、加德纳菌属(例如，阴道加德纳菌)、弯曲杆菌属、螺旋体属、变形杆菌属、拟杆菌属以及幽门螺旋杆菌。

病毒的另外的实例包括但不限于HIV、单纯疱疹病毒1和2(包括脑炎、新生以及生殖形式)、人乳头状瘤病毒、巨细胞病毒、EB病毒、甲型、乙型以及丙型肝炎病毒、轮状病毒、腺病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、小痘、猴痘以及SARS病毒。

可以使用的真菌的另外的实例包括但不限于念珠菌病、癣菌病、组织胞浆菌病、芽生菌病、副球孢子菌病、隐球菌病、曲霉菌病、着色真菌、足分枝菌病、假性阿利什利菌病、以及花斑癣。

可以使用的寄生物的另外的实例包括但不限于原生生物和线虫如阿米巴病、克氏锥虫、片形吸虫病(例如，Facioloa hepatica)、利什曼病、疟原虫(例如，镰状疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫)、盘尾丝虫病、并殖吸虫病、布氏锥虫、肺孢子虫属(例如，卡氏肺囊虫)、阴道滴虫、绦虫属、膜壳绦虫属(例如，微小膜壳绦虫)、棘球蚴属、血吸虫病(例如，曼森裂体吸虫)、神经囊虫病、美洲板口线虫、以及毛首鞭虫。

可以使用的病原体的另外的实例包括但不限于衣原体属、结核分枝杆菌、和M.1eprosy、以及立克次氏体。

可以在受试者中使用的具有或发展癌症的风险的抗原包括但不限于癌抗原。癌抗原包括但不限于HER 2(p185)、CD20、CD33、GD3神经节苷脂、GD2神经节苷脂、癌胚抗原(CEA)、CD22、乳黏蛋白核心蛋白、TAG-72、路易斯A抗原、卵巢相关抗原如OV-TL3和MOv18、高Mr黑色素瘤抗原，其由抗体9.2.27.HMFG-2.SM-3识别，B72.3.PR5C5、PR4D2等。在美国专利号5,776,427中描述了其它癌抗原。

可以按照各种方式来分类癌抗原。癌抗原包括由已经历染色体改变的基因编码的抗原。许多这些抗原存在于淋巴瘤和白血病中。甚至在该分类中，抗原可以表征为那些涉及休眠基因的激活的抗原。这些抗原包括BCL-1和IgH(套细胞淋巴瘤)、BCL-2和IgH(滤泡性淋巴瘤)、BCL-6(弥漫性大B细胞性淋巴瘤)、TAL-1和TCR-或SIL(T细胞急性成淋巴细胞白血病)、c-MYC和IgH或IgL(伯基特淋巴瘤)、MUN/IRF4和IgH(骨髓瘤)、PAX-5(BSAP)(免疫细胞瘤)。

涉及染色体改变并从而产生新融合基因和/或蛋白的其它癌抗原包括RAR-、PML、PLZF、NPM或NuMA(急性早幼粒细胞白血病)、BCR和ABL(慢性髓样/急性成淋巴细胞白血病)、MLL(HRX)(急性白血病)、E2A和PBX或HLF(B细胞急性成淋巴细胞白血病)、NPM、ALK(间变性大细胞性白血病)、以及NPM、MLF-1(骨髓增生异常综合症/急性髓细胞白血病)。

其它癌抗原对于组织或细胞谱系是特异性的。这些癌抗原包括细胞表面蛋白如CD20、CD22(非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL))、CD52(B细胞CLL)、CD33(急性髓细胞源性白血病(AML))、CD10(gp100)(常见(前B)急性淋巴细胞白血病和恶性黑色素瘤)、CD3/T细胞受体(TCR)(T细胞淋巴瘤和白血病)、CD79/B细胞受体(BCR)(B细胞淋巴瘤和白血病)、CD26(上皮和淋巴系统恶性肿瘤)、人白细胞抗原(HLA)-DR、HLA-DP、以及HLA-DQ(淋巴系统恶性肿瘤)、RCAS1(妇科癌、胆道腺癌以及胰管状腺癌)、以及前列腺特异性膜抗原(前列腺癌)。

组织特异性癌抗原或谱系特异性癌抗原还包括表皮生长因子受体(高表达)如EGFR(HER1或erbB1)和EGFRvIII(脑、肺、乳、前列腺以及胃癌)、erbB2(HER2或HER2/neu)(乳癌和胃癌)、erbB3(HER3)(腺癌)、以及erbB4(HER4)(乳癌)。

组织特异性癌抗原或谱系特异性癌抗原还包括细胞相关蛋白如酪氨酸酶、Melan-A/MART-1、酪氨酸酶相关蛋白(TRP)-1/gp75(恶性黑色素瘤)、多形性上皮粘蛋白(PEM)(乳腺肿瘤)、以及人上皮粘蛋白(MUC1)(乳、卵巢、结肠以及肺癌)。

组织特异性癌抗原或谱系特异性癌抗原还包括分泌蛋白如单克隆免疫球蛋白(多发性骨髓瘤和浆细胞瘤)、免疫球蛋白轻链(多发性骨髓瘤)、甲胎蛋白(肝癌)、激肽释放酶6和10(卵巢癌)、胃泌素释放肽/蛙皮素(肺癌)、以及前列腺特异性抗原(前列腺癌)。

另外其它的癌抗原是睾丸癌(CT)抗原，其在一些正常组织如睾丸中表达并且在一些情况下在胎盘中表达。它们的表达常见于不同谱系的肿瘤并且作为一组上述抗原形成免疫疗法的靶。肿瘤表达的CT抗原的实例包括MAGE-A1、-A3、-A6、-A12，BAGE，GAGE，HAGE，LAGE-1，NY-ESO-1，RAGE，SSX-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9，HOM-TES-14/SCP-1，HOM-TES-85以及PRAME。CT抗原的其它实例和它们表达在其中的癌症包括SSX-2、和-4(成神经细胞瘤)、SSX-2(HOM-MEL-40)、MAGE、GAGE、BAGE以及PRAME(恶性黑色素瘤)、HOM-TES-14/SCP-1(脑膜瘤)、SSX-4(少突胶质瘤)、HOM-TES-14/SCP-1、MAGE-3以及SSX-4(星形细胞瘤)、SSX成员(头部和颈部癌、卵巢癌、淋巴样肿瘤、结肠直肠癌以及乳癌)、RAGE-1、-2、-4、GAGE-I、-2、-3、-4、-5、-6、-7以及-8(头部和颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、HOM-TES14/SCP-1、PRAME、SSX-1以及CT-7(非霍奇金淋巴瘤)、以及PRAME(急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞源性白血病(AML)以及慢性淋巴细胞白血病(CLL))。

其它癌抗原对于特定的组织或细胞谱系并不是特异性的。这些癌抗原包括癌胚抗原(CEA)家族的成员：CD66a、CD66b、CD66c、CD66d以及CD66e。这些抗原可以在许多不同的恶性肿瘤中表达并且可以通过免疫疗法加以靶向。

其它癌抗原是病毒蛋白并且这些癌抗原包括人乳头状瘤病毒蛋白(宫颈癌)、以及EBV编码的核抗原(EBNA)-1(颈部淋巴瘤和口腔癌)。

其它癌抗原是突变或异常表达的分子，如但不限于CDK4和β-联蛋白(黑色素瘤)。

其它癌抗原可以选自由MART-1/Melan-A、gp100、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、FAP、亲环素b、结肠直肠相关抗原(CRC)--C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)、CAP-1、CAP-2、etv6、AML1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSA-1、PSA-2、PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、以及CD20组成的组。癌抗原还可以选自由MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5组成的组。在又一种实施方式中，癌抗原选自由GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9组成的组。并且，在另一种实施方式中，癌抗原选自由BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM--1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、[α]-甲胎蛋白、E-钙粘着蛋白、[α]-联蛋白、P-联蛋白、[γ]-联蛋白、p120ctn、gp100<Pmel117>、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤样结肠息肉蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2神经节苷脂、GD2神经节苷脂、人乳头状瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的Smad家族、Imp-1、P1A、EBV-编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、以及c-erbB-2组成的组。

抗原可以是蛋白质抗原。它可以是酶抗原，如非人哺乳动物酶。它可以是例如鸡卵溶菌酶(HEL)或鸡γ球蛋白(CGG)。它可以是可用于体外模型系统的抗原。

在另外的方面，本发明进一步提供了一种药物组合物，该组合物包含本发明的产品以及一种或多种药用载体或稀释剂，以及所述组合物在用于治疗或预防人或动物受试者的免疫疗法的方法中的应用。所述药物组合物可以进一步包含可溶性免疫刺激剂。

药用载体或稀释剂包括那些用于剂型的药用载体或稀释剂，其适合于口服、直肠给予、鼻给予、局部(包括颊和舌下)给予、阴道或胃肠道外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内以及硬膜外)给予。剂型可以方便地以单位剂型提供并且可以通过制药领域中众所周知的任何方法来制备。

本文描述的产品和组合物可以用来诱发体外或体内增强的免疫反应。它们可以用来增加抗原的免疫原性。本发明提供了这样的方法，该方法包括以下步骤：使本文描述的产品和组合物与靶细胞接触，通常B细胞，以诱发抗原特异性BCR介导的免疫反应。以本文描述的方式调节结合于载体的抗原的密度(因而亲合力)，以实现期望的效果。

可以将本发明的产品和组合物给予受试者以治疗、预防或缓和疾病。所述疾病可以是用本发明的组合物和产品可以治疗的任何疾病，例如恶性疾病如癌症、以及传染病、变态反应或自身免疫病。用本发明的产品和组合物对受试者的治疗可以联合其它治疗。

在一个方面，本发明提供了一种用于在受试者中诱导抗原特异性BCR介导的免疫反应的方法，该方法包括以下步骤：给予受试者有效量的如本文描述的产品或组合物，以便于特异性BCR介导的内化和B细胞激活。

在一个方面，本发明提供了一种诱导BCR介导的对抗原的免疫反应的方法，该方法包括以下步骤：给予受试者有效量的产品，该产品包含(i)载体、(ii)至少一种附着于载体的BCR结合抗原，以及，可选地，(iii)至少一种附着于载体的免疫刺激剂，或包含所述产品的组合物。抗原以足够的密度(因而足够的亲合力)存在于载体上，以便于抗原特异性免疫反应的BCR介导激活。该方法可以用于预防性或治疗性接种疫苗。

在一个方面，本发明提供了一种诱导BCR介导的对抗原的免疫反应的方法，该方法包括给予受试者有效量的产品(或包含该产品的组合物)的步骤，所述产品包含(i)载体、以及(ii)至少一种附着于载体的BCR结合抗原，该方法进一步包括共同给予受试者可溶性免疫刺激剂。抗原以足够的密度(因而足够的亲合力)存在于载体上，以便于抗原特异性免疫反应的BCR介导激活。该方法可以用于预防性或治疗性接种疫苗。

给予本发明的产品和组合物的合适方式在本领域是已知的。可以使用任何合适的给予方法。

受试者可以是非人哺乳动物、例如兔、羊、豚鼠等。受试者可以是人。受试者可以是健康受试者，或可以是患有疾病、或怀疑患有疾病、可用本文描述的产品、组合物或方法加以治疗的受试者。疾病可以是，例如但不限于，恶性疾病，如癌症，传染病，如感染有寄生物，或变态反应，或一般地自身免疫病。

在一个方面，本发明提供了一种用于在受试者中增加BCR结合抗原的免疫原性的方法，该方法包括给予受试者包含载体和附着于载体的所述抗原的产品，并且其中免疫刺激剂附着于载体或与所述产品一起共同给予。

在一个方面，本发明提供了一种用于在受试者中增加BCR结合抗原的免疫原性的方法，该方法包括给予受试者如本文描述的产品或组合物，其中抗原以足够的密度(因而足够的亲合力)存在于载体上，以便于抗原特异性免疫反应的激活。

“增加”是指增强或延长免疫反应的持续时间。因此，甚至当以可溶形式单独给予时也不会诱发免疫反应或诱发弱免疫反应的抗原，当在如本文描述的产品上给予时，也可以诱发强免疫反应。因此，与单独以可溶性或颗粒形式给予抗原时相比，可以增强对抗原的免疫反应。与连同可溶性免疫刺激剂一起给予抗原相比，也可以增强免疫反应。

在另外的方面，本发明提供了一种用于制备如本文描述的产品的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将BCR结合抗原附着于载体，以及可选地，

(b)将免疫刺激剂附着于载体。可以可选地在步骤(a)以前进行步骤(b)。

在另外的方面，本发明提供了一种用于在受试者中增加对BCR结合抗原的抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将抗原附着于载体，以及

(b)将免疫刺激剂附着于载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(a)和(b)，以及

(c)将载体给予受试者，

其中抗原以足够的密度(因而足够的亲合力)存在于载体上，以便于特异性BCR激活。

可替换地，免疫刺激剂并不附着于载体，但共同给予受试者。

在另外的方面，本发明提供了一种用于制备如本文描述的产品的载体，其中将免疫刺激剂附着于载体。

在另外的方面，本发明提供了一种用于在受试者中增强BCR介导的抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括给予受试者如本文描述的产品或组合物。

在另外的方面，本发明提供了一种诱导通过细胞特异性摄取免疫刺激剂的方法，该方法包括以下步骤：

(i)将BCR结合抗原附着于载体，

(ii)将免疫刺激剂附着于所述载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(i)和(ii)，以及

(iii)使细胞与如此制备的载体接触，以便于特异性BCR介导的内化和B细胞激活。

所述细胞表达BCR并且通常是B细胞。如此制备的载体因此适合于被B细胞内化。所述细胞可以存在于组织或受试者中。

在另外的方面，本发明提供了一种用于抑制通过B细胞非特异性摄取免疫刺激剂的方法，该方法包括以下步骤：在接触所述B细胞以前，将所述免疫刺激剂附着于载体。可以将抗原附着于载体，如BCR结合抗原。

抑制包括部分抑制，即限制非特异性摄取。在载体中呈现免疫刺激剂可以防止B细胞的非特异性摄取。如果将BCR结合抗原附着于载体，则防止或限制非特异性摄取会导致载体的增加的特异性摄取(经由BCR衔接)。

在另外的方面，本发明提供了一种将BCR结合抗原和免疫刺激剂递送到细胞以诱发抗原特异性免疫反应的方法，该方法包括：

(i)以第一密度将BCR结合抗原附着于载体，

(ii)将免疫刺激剂附着于所述载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(i)和(ii)，

(iii)使如此获得的载体与细胞接触，

(iv)测试细胞的抗原介导激活，

可选地重复步骤(ii)至(iv)，其中变化载体上抗原的密度。

疫苗-抗体的产生-医疗用途

在另外的方面，本发明提供了本文描述的产品和方法在用于预防性或治疗性接种疫苗以用于BCR介导的免疫反应中的应用。

本发明提供了产品、组合物和方法，它们可以用于在人类和/或其它受试者中刺激免疫反应，其可以有利于(但不限于)预防和/或治疗疾病。如在本文中所使用的，治疗受试者是指向受试者提供一些治疗性或预防性益处。这可以通过部分或完全减少与特定病症有关的症状来实现。然而，治疗受试者并不限于治愈特定病症的受试者。

本文描述的产品、组合物和方法可以用作疫苗。它们可以用于预防性或治疗性接种疫苗。

本文描述的产品或组合物可以刺激免疫反应，从而导致产生免疫分子，其包括结合于抗原的抗体。本发明包括足以减少症状的数目、严重性和/或持续时间的疫苗。疫苗还可以包含自由形式的抗原并且这样的抗原可以相同或不同于载体上的抗原。

除如上所述的产品或组合物以外，疫苗还可以包括盐、缓冲剂、佐剂以及其它物质、或赋形剂，其可以是为改善其效率所期望的。合适的疫苗成分的实例以及关于用于制备有效组合物的方法的一般指导原则可以在标准教科书如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co.，(1990))中发现。在所有情况下，如本文描述的产品或组合物应当以有效量，即产生期望的效果的量存在。疫苗的其它组分应当是生理上可接受的。可以通过单个或多个剂量的有效量的产品或组合物来给予本发明的疫苗。

通常以有效量，即足以诱导期望的免疫反应的量给予疫苗。

可以通过本领域已知的任何途径来给予受试者疫苗，包括胃肠道外途径(即注射)、吸入、局部途径或通过口服给予。合适的方法包括，例如，肌内、静脉内、或皮下注射，或皮内或鼻内给予。可以用于注射制剂的合适载体包括无菌水溶液(例如，生理盐水)或非水溶液和悬浮液如丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、以及可注射有机酯如油酸乙酯。利用由标准参考文献提供的指导，可以开发治疗和给药策略(参见例如N.Engl.J.Med.345(16)：1177-83(2001)，关于儿重的治疗，以及Arch.Intern.Med154(22)：2545-57(1994)，关于成人治疗；关于临床试验的综述，参见Arch.Intern.Med 28，154(4)：373-7(1994))。

可以在已出现症状以后将疫苗给予受试者以治疗疾病。在这些情况下，有利的是，在症状发作以后尽快并根据情况开始治疗，以组合疫苗给予和其它治疗，例如给予抗生素，或抗癌治疗如化疗或放射疗法。

在另外的方面，本发明提供了一种产生相对于抗原的免疫分子如抗体的方法，所述方法包括将本发明的产品或组合物引入非人哺乳动物，并从所述哺乳动物回收免疫血清。通过这种方法可以获得的免疫血清也是本发明的一部分。

提高血清和抗体，包括单克隆抗体，以及不同形式的抗体，包括抗体片段，的方法在本领域是已知的(Roitt’s Essential Immunology，eleventh edition，Blackwell Publishing)。

产生抗体的方法包括用本文描述的产品或组合物免疫哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、马、山羊、羊或猴)。利用本领域已知的各种技术中的任一种，抗体可以获自免疫动物，并且可以加以筛选，优选利用抗体与感兴趣的抗原的结合。

例如，可以使用蛋白质印迹技术或免疫沉淀(Armitage et al，1992，Nature 357：80-82)。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

可以以许多方式来修饰抗体。确实，术语“抗体”应视为包括任何特异性结合物质，其具有带有所需要的特异性的结合域。因此，该术语涵盖抗体的抗体片段、衍生物、功能等效物以及同源物，包括包含免疫球蛋白结合域的任何多肽(不管是天然的或合成的)。作为免疫哺乳动物的替换或补充，具有适当结合特异性的抗体可以获自表达的免疫球蛋白可变域的重组产生的文库，例如利用λ噬菌体或丝状噬菌体，其在它们的表面上呈现功能性免疫球蛋白结合域；例如参见WO92/01047。

在另外的方面，本发明提供了一种用于加速生产特异性抗体的方法，该方法包括将如本文描述的产品或组合物引入到非人哺乳动物中，然后从所述哺乳动物回收抗体。

与用抗原(有或没有可溶性免疫刺激剂)免疫相比，在抗原特异性血清或特异性抗体的产生中使用本文描述的方法、产品和/或组合物会在免疫的受试者中缩短在免疫和产生特异性抗体的时间之间的时间间隔。换句话说，与常规免疫方法相比，当使用本文描述的方法时，可以更早地检测和回收特异性抗体。

这在临床实践中具有优势。例如，缩短的疫苗接种间隔有利于在限定的时间内需要可靠免疫的人，如例如旅游者。

如上所述，本文描述的产品和方法还导致对给定抗原的增强的免疫反应。这进一步提供了临床和实际益处。例如，由于增强的免疫反应，可以减少给予疫苗的次数。例如，通常在第0、1以及6个月，三次给予HBV预防性疫苗。经常，人们在第0和1个月接收疫苗，但未能返回接收最后第6个月的给予。因此能够减少为达到可靠免疫所必要的给予次数是有利的。能够诱导增强的免疫反应进一步有利于具有减弱或较少响应免疫系统的个体的疫苗接种，如例如老人。通常，如果疫苗的正常给予周期未能在这些个体中建立可靠的免疫，则他们必须接收另外的给予。使用本发明的产品和方法，在这些个体中也可以实现强烈反应，从而使得无需额外的给予步骤。

因而本文描述的方法和产品便于在更短的时间内和/或用更少的给予次数来实现免疫。

缩短的响应时间和增强的响应还有利于治疗和疗法，其中对给予药剂的快速和强烈反应对于治疗是关键的或便于患者的更快恢复和/或症状的更快缓解。

因此，本文描述了用于加速抗原特异性BCR介导的免疫反应的方法、产品以及组合物。

通过用疫苗免疫产生的免疫分子，例如抗体，可以被转移到另一个个体，从而被动转移免疫性。

在另外的方面，本发明提供了一种针对疾病的被动免疫的方法，所述方法包括给予受试者免疫血清，该免疫血清包含可通过本文描述的方法获得的抗体。

本发明的产品和组合物可以用作药物。

相对于B细胞，优先将药剂递送至树突细胞。

作者已表明，虽然B细胞非特异性地吸收可溶性免疫刺激剂，B细胞并不吸收附着于载体的免疫刺激剂(图1B、图C)，但仍然被树突细胞内化(图19)。通过将药剂附着于载体，因此可以防止被B细胞摄取，而是实现优先递送至树突细胞。因为在例如人的血液中B细胞的数目大于树突细胞的数目，所以，如果以可溶形式给予药剂，则较大比例的药剂分子通常被B细胞吸收。因而必须给予更多药剂以实现充分递送至树突细胞。利用本发明的方法，可以实现定向(特异性)递送至树突细胞(相对于B细胞，优先递送至树突细胞)。这具有许多益处。可以给予更少的药剂，因为它被更有效地递送至树突细胞并且不被B细胞吸收。另外，可以预期更少或更小的严重副作用，因为存在减少的B细胞的非特异性激活。

在另外的方面，本发明提供了一种相对于B细胞将药剂优先递送至树突细胞的方法，该方法包括

(i)将药剂附着于载体，

(ii)使细胞群体与附着于载体的药剂接触，其中细胞群体包含B细胞和树突细胞。

载体没有BCR抗原，使得不能诱导B细胞的BCR介导的摄取(或没有将诱导BCR介导摄取的量的BCR抗原)。

该方法可以体内或体外进行。

在另外的方面，本发明提供了一种在受试者中相对于B细胞将药剂优先递送至树突细胞的方法，该方法包括

(i)将药剂附着于载体，

(ii)将载体上的药剂给予受试者。

在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，优选人。

在一些实施方式中，药剂是如上所述的免疫刺激剂。在一些实施方式中，载体如上所述。

实施例

实施例1-免疫刺激性脂质

材料和方法

抗原、脂质制剂以及微球涂层

HEL和OVA购买自Sigma，而CGG购买自Jackson Immuno Research。如果需要，通过使用磺基-NHS-LC-LC-生物素(Pierce)来对抗原进行生物素化。1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和N-帽生物素基-磷脂酰乙醇胺(PE-生物素)均购买自Avanti Polar Lipids。αGalCer购买自Alexis Biochemical。IMM47是来自Dr Vincenzo Cerundolo的赠品(WO2007/050668)。αGalCer-Alexa 488的合成是基于用于合成生物素化αGalCer(36)所采用的方法，其中使用Alexa Fluor 488(Invitrogen)。为了制备包含DOPC/PE-生物素(98/2，m/m)或DOPC/PE-生物素/αGalCer(88/2/10，m/m/m)的脂质体，在氩气下干燥脂质并再悬浮在Tris 25mM/NaCl 150mM，pH 7.0中，同时剧烈混合。

二氧化硅微球(100nm)购买自Kisker GbR。为了进行涂布，用脂质体温育微球，接着添加链抗生物素蛋白和饱和量的生物素化蛋白。对于涂布有不同HEL密度/亲和力的珠，通过使用生物素化(Fab’₂)-F10抗HEL抗体将抗原结合于颗粒。在需要不同抗原密度的情况下，用不同量的生物素化CGG竞争生物素化抗体。通过FACS利用抗HEL单克隆抗体来检测珠上的HEL密度。通过蛋白质印迹检测了抗原与脂质体涂布珠的结合。

为了量化结合于颗粒的αGalCer的量，使它们涂布有包含αGalCer-Alexa 488的脂质体。通过利用EnVision Multilabel Reader测量了来自脂质体涂布珠的荧光强度以及关于包含不同量αGalCer-Alexa 488的脂质体的荧光强度。

小鼠和细胞系

在Cancer Research UK和John Radcliffe Hospital，Oxford的动物设施中饲养和供养MD4、D1.3、D1.3-H2、以及Jα18-/-小鼠。C57BL/6小鼠购买自Charles River。所有实验均得到Cancer Research UK Animal Ethics Committee和United Kingdom Home Office的认可。iNKT杂交瘤DN32.D3由A.Bendelac(University of Chicago，Chicago，IL)友好提供。

B细胞纯化和呈递测定

利用B细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec)通过阴性选择将脾B细胞富集至＞99％的纯度。为了分析αGalCer呈递，用包含αGalCer和/或HEL的颗粒温育B细胞过夜，充分洗涤，然后在5×10⁴个细胞/孔下用相同数目的DN32.D3细胞加以培养。通过测量培养上清中的IL-2生产来测定NKT激活。关于阻断实验，在用iNKT细胞温育以前，用抗CD1d阻断抗体(25μg/ml；克隆1B1)温育MD4B细胞2小时。

过继转移和FACS分析

用2μM CFSE(Molecular Probes)标记5百万至1千万个MD4B细胞，然后通过尾静脉注射过继转移到WT C57BL/6或Jα18-/-小鼠中并连同包含αGalCer和/或HEL的颗粒。5天以后从受体小鼠收获脾脏并针对表面分子和细胞内HEL结合对脾细胞进行染色，如先前描述的(37)。

免疫

用1-10μl包含不同抗原和/或αGalCer的珠腹腔内免疫小鼠。通过ELISA确定了小鼠血清中的抗原特异性Ig水平。

ELISA和ELISPOT

通过ELISA使用JES6-1A12捕捉抗体(BD Pharmingen)来确定培养上清液中IL-2的浓度。生物素化JSE6-5H4(BD Pharmingen)用于检测。利用涂布有抗原(HEL、OVA或CGG)和连续稀释的血清的平板测量了小鼠血清中的特异性抗体。用生物素标记的山羊抗小鼠IgM、IgG、IgG1、IgG2b、IgG2c或IgG3(BD Pharmingen)检测了结合的抗体。

通过ELISPOT检测了抗HEL抗体分泌细胞的频率。在涂布有HEL的多屏幕过滤板(Millipore)上温育脾细胞的单细胞悬浮液15-18小时。用山羊抗小鼠生物素化IgMa，接着用链抗生物素蛋白-过氧化物酶和3-氨基-9-乙基-咔唑(Sigma)揭示斑点。

免疫组织化学

固定脾脏的冷冻切片(10μm厚度)，然后用大鼠抗小鼠CD45R/B220(BD Biosciences)染色。通过添加HEL(200ng/ml)接着抗HELF10抗体alexa-488来检测HEL+细胞。用PNA-生物素(Vector Labs)和链抗生物素蛋白-alexa 633来染色生发中心。

结果

我们追求研究，在免疫反应发展期间，靶向iNKT辅助细胞对抗原特异性B细胞的影响。为此，在αGalCer存在的情况下，我们已用包含DOPC和PE-生物素的脂质体涂布硅质珠(100nm)(图1A)。Alexa-488-标记-αGalCer用来量化加载在珠上的αGalCer的量，并且我们发现其是150ng/μl的珠(10⁸个珠/μl)。为了评估B细胞体外呈现αGalCer的能力，在用来自小鼠杂交瘤(DN32.D3)的iNKT细胞温育以前，用颗粒或可溶性αGalCer刺激B细胞20小时。IL-2分泌到培养基中用来测量iNKT细胞激活。与先前的报道(17)一致，B细胞有效地呈递可溶性αGalCer并诱导IL-2生产(图1B)。相反，在用颗粒αGalCer刺激以后，我们观察到来自iNKT细胞的IL-2生产的严重衰减。因此，通过针对可溶性αGalCer所观察到的非选择性方式，B细胞吸收少得多的颗粒脂质抗原。

BCR介导的摄取增强了颗粒抗原脂质向iNKT细胞的CD1d依赖性呈递

通过链抗生物素蛋白接头，我们已将生物素化鸡卵溶菌酶(HEL)结合于加载有或没有αGalCer的颗粒。利用蛋白质印迹，估计了结合蛋白的总量(图1A)。为了评估B细胞介导这些颗粒的BCR特异性摄取和呈递的能力，我们已使用了HEL特异性转基因的原代B细胞(MD4)和DN32.D3细胞。用颗粒HEL-αGalCer刺激的MD4B细胞会诱导强iNKT激活(图1C)。相反，在仅用颗粒HEL或αGalCer温育以后，没有检测到IL-2生产。此外，在用结合于αGalCer的颗粒HEL刺激WTB细胞以后，没有观察到iNKT激活。有趣的是，边缘区MD4B细胞(通过FACS分选CD21^highCD23^low B细胞群体加以纯化)比卵泡B细胞更加有效地向iNKT细胞呈现颗粒HEL-αGalCer(图6)。重要的是，通过用针对CD1d的单克隆抗体预温育B细胞会完全阻断iNKT细胞的激活，这表明该过程绝对依赖于CD1d介导的呈递(图1D)。这些观测结果表明，通过BCR的特异性抗原识别可以显著增强颗粒脂质抗原呈递到iNKT细胞。

为了探索改变抗原亲和力的影响，我们已利用了各种HEL蛋白，其对于MD4BCR具有宽范围的亲和力(HEL^WT K_a＝2.1×10¹⁰M^-1；HEL^RDGNK_a＝5.2×10⁷M^-1；HEL^RKD K_a＝8.0×10⁵M^-1)(18)。如图1E和图1F所示，在抗原的最高密度下，我们观察到类似水平的iNKT细胞激活，而不管结合于颗粒αGalCer的抗原的亲和力。有趣的是，甚至低亲和力HEL^RKD抗原也增强颗粒αGalCer呈递到iNKT。然而，降低在颗粒表面上的该抗原密度20倍会消除颗粒αGalCer的呈递(图1F)。因此这些发现表明，甚至非常低亲和力抗原也可以诱导有效的颗粒αGalCer呈递，只要它们超过用于刺激BCR的严格调节的亲合力阈值。

虽然BCR抗原识别是必要的，但它不足以驱动最佳B细胞呈递。我们观察到，表达信号缺损BCR(IgM-H2)(对于HEL具有高亲和力)的转基因B细胞呈现减弱的诱导iNKT激活的能力(图1G)。与这些发现一致，结合于αGalCer或Gal(α1→2)αGalCer的颗粒HEL导致iNKT细胞的同样有力的激活(图1H)。因为在可以被iNKT细胞有效识别以前，Gal(α1→2)αGalCer需要细胞内加工(19)，所以可以得出结论：在呈递到iNKT细胞以前，包含脂质的珠被内化在B细胞中。

此外，本发明的发明人已证明，通过使用另一种iNKT细胞激动剂(称作IMM47)，所描述的观测结果具有更广的适用性。类似于αGalCer，我们观察到，当结合于抗原时，通过IL-2的生产，颗粒IMM47导致体外刺激iNKT细胞(图1I)。

因此，BCR介导的抗原识别和内化是B细胞介导呈递颗粒αGalCer到iNKT细胞所需要的。

颗粒αGalCer的BCR介导摄取导致iNKT辅助细胞的募集，从而导致体内广泛的B细胞增殖和抗体生产

鉴于证明了颗粒抗原脂质的BCR介导摄取导致体外iNKT细胞激活，我们研究了颗粒αGalCer的BCR介导摄取对体内B细胞的激活和命运的影响。为此，在没有任何其它佐剂存在的情况件下，将来自MD4小鼠的CFSE标记的HEL特异性B细胞过继转移到C57BL/6受体，该受体受到有或没有结合αGalCer的颗粒HEL的静脉内激发。刺激后5天，收获受体小鼠的脾脏，并且CFSE在HEL特异性B细胞群体中的稀度用作B细胞增殖的度量。

如图2A所示，观察到响应于结合于αGalCer的颗粒HEL的HEL特异性B细胞的广泛的增殖-在5天以后MD4B细胞构成多于7％的总脾淋巴细胞。这些HEL特异性B细胞来自过继转移的MD4细胞，因为在颗粒HEL-αGalCer刺激C57BL/6以后它们未被检测到。重要的是，在仅用颗粒αGalCer或HEL激发以后，没有检测到增殖，因为HEL本身不能诱发对C57BL/6背景的T细胞依赖性反应(20)。此外，HEL特异性B细胞增殖依赖于iNKT细胞的存在，因为它在使用Jα18-/-小鼠作为受体的类似过继转移实验中没有观察到(图2B)。

脾脏切片的免疫组织化学分析证实了，响应于HEL-αGalCer颗粒的HEL特异性B细胞的扩张(图2C)。有趣的是，这些增殖的HEL特异性B细胞主要定位为桥通道中的滤泡外灶和脾脏的红髓并且呈现PC特有的强烈的细胞质HEL染色(图2C)。通过流式细胞术并基于高细胞内HEL染色和CD138表达，证实了特异性PC的存在(图2D)。PC分化伴随高IgMa抗HEL抗体滴度的生产(图2F)。这些抗体专门来自转移的MD4B细胞，因为由C57BL/6小鼠产生的抗体将具有IgH^b同种异型。在仅用颗粒HEL或αGalCer激发的小鼠中未检测到HEL特异性PC或抗HEL抗体(图2D和图2F)。通过HEL特异性ELISPOT仅在用包含HEL-αGalCer的颗粒激发的受体中还鉴定了抗体分泌细胞(图2E)。此外，在颗粒HEL-αGalCer刺激过继转移到Jα18-/-小鼠中的MD4B细胞以后，脾HEL⁺CD138⁺细胞不存在(图2D和图2F)。因此，响应于颗粒HEL-αGalCer，HEL特异性B细胞的PC分化依赖于iNKT细胞的存在。

值得注意的是，与我们的体外观测结果一致，B细胞增殖和抗体生产取决于BCR对存在于颗粒上的抗原的亲合力(图3A-C)。在颗粒αGalCer上HEL的亲和力或密度的减小导致减小的B细胞增殖和抗体生产。因而，颗粒αGalCer的BCR介导内化的亲合力阈值在体内也是存在的。然而，显而易见的是，甚至低亲和力抗原也可以有效地诱导αGalCer呈递到iNKT，从而便于刺激B细胞反应。

与针对仅连同可溶性αGalCer给予的颗粒HEL所观察到的相比，经由颗粒来连接蛋白抗原和脂质抗原免疫刺激剂可以产生大大增强的B细胞增殖和抗体生产(图3D-F)。显然这表明，与由可溶性αGalCer采用的内化方式相比，抗原脂质的特异性BCR摄取是更加有效的内化方式。用颗粒HEL-αGalCer进行的刺激导致iNKT介导的特异性B细胞反应的更大刺激。因此，我们已确定了一种涉及颗粒抗原脂质的策略，以能够获得增强的和特异性B细胞增殖以及体内功能性滤泡外PC的发育。

用结合于αGalCer的颗粒抗原进行的免疫可以增强特异性抗体反应

鉴于具有结合抗原的颗粒αGalCer对B细胞命运的影响，我们寻求研究了它们体内诱导全身性免疫反应的能力。为了对此进行评估，我们已使用了单剂量腹腔内免疫策略，其中采用鸡γ球蛋白(CGG)作为抗原。先前已证明，CGG在小鼠中诱导强T细胞依赖性反应。用结合于αGalCer的颗粒CGG激发C57BL/6和Jα18-/-小鼠，并在7天和14天以后利用ELISA来分析特异性抗体反应。

早在用结合于αGalCer的颗粒CGG免疫C57BL/6小鼠以后的第7天，我们检测了特异性抗CGG抗体生产，包括高滴度的IgM和类别转换IgG(图4A)。在仅用颗粒CGG或αGalCer免疫的小鼠中，在该时间点，没有检测到特异性抗体。用颗粒CGG对C57BL/6和Jα18-/-小鼠进行的免疫会在免疫以后的整个测量时间进程中产生类似的特异性抗体反应(图4B)。相反，与Jα18-/-小鼠相比，用结合于αGalCer的颗粒CGG进行的免疫会在C57BL/6小鼠中诱导特异性CGG抗体生产的显著增加。这说明，响应于结合于抗原的颗粒αGalCer，特异性抗体生产需要iNKT。重要的是，响应用结合于αGalCer的颗粒HEL对C57BL/6小鼠的免疫，检测到利用CGG作为抗原所观察到的相同模式的类别转换抗原特异性抗体(图4C)。因此，在免疫以后，iNKT细胞可以有效地激活特异性抗体生产和类别转换而没有募集特异性CD4+辅助性T细胞。

到目前为止，我们已证明了，特异性BCR识别是有效B细胞呈递颗粒抗原脂质到iNKT细胞所需要的，并且iNKT辅助细胞的募集可以调节B细胞激活。然而，我们热衷于评估在全身性免疫反应的发展期间在特异性抗体的生产中共摄取抗原和αGalCer的影响。为了解决该问题，我们用颗粒的两种不同组合免疫C57BL/6小鼠：用结合于αGalCer的颗粒CGG并连同颗粒卵清蛋白(OVA)一起免疫第一组小鼠，而第二组则接受结合于αGalCer的颗粒OVA以及颗粒CGG(图5A)。响应结合于αGalCer的抗原，在每组中，产生增加水平的特异性抗体，这表明抗原-αGalCer的共摄取会增强特异性B细胞激活和抗体生产(图5A)。值得注意的是，与颗粒CGG和可溶性αGalCer相比，我们还观测到，响应用结合于αGalCer的颗粒CGG的免疫，特异性抗体生产的增强(图5B)。该结果，与我们的体内增殖实验一致，表明，颗粒αGalCer的BCR介导摄取比可溶性αGalCer摄取更加有效，从而导致增强的特异性B细胞反应。

实施例2-TLR激动剂

材料和方法(其中不同于在实施例1中所描述的材料和方法)

材料

具有硫代磷酸酯键的生物素化CpG OD1668购买自Sigma。涂布有链抗生物素蛋白的聚苯乙烯微球(130nm)购买自Bangs Laboratories。

B细胞纯化和体外增殖

通过阴性选择并利用B细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec)，将脾B细胞富集至＞99％的纯度。用2μm CFSE标记MD4B细胞，培养成1×10⁶个细胞，然后用包含HEL和/或CpG的颗粒温育。在72小时以后，收获细胞并经受流式细胞术分析。收集上清并通过ELISA确定IL-6和HEL特异性IgMa分泌。

颗粒抗原-CpG刺激体外B细胞增殖和分化

我们已使用免疫刺激剂CpG，、TLR9的激动剂作为用于触发细胞内TLR反应的模型系统。首先我们研究是否抗原-BCR介导摄取是颗粒CpG被内化所需要的。因此，在有或没有生物素化CpG存在的情况下，我们用生物素化模型抗原鸡卵溶菌酶(HEL)涂布尺寸类似于病毒(130nm)的链抗生物素蛋白聚苯乙烯微球。我们已采用了直径类似于典型病毒病原体的链抗生物素蛋白聚苯乙烯珠，以便研究颗粒CpG起始TLR9介导的B细胞反应的机制。通过用HEL特异性单克隆抗体F10染色(图11A)、通过流式细胞术以及通过用多克隆抗体检测HEL(通过蛋白质印迹)，来证明HEL对颗粒的成功涂布。通过在珠表面上HEL的竞争，评估了CpG的存在，从而它显示为F10结合于HEL CFSE标记的MD4的减少。在用HEL和CpG涂布珠体外刺激以后第3天，收获HEL特异性转基因B细胞(Goodnow et al.，1988)。流式细胞术用来监测B细胞增殖和PC分化，其中分别通过CFSE的稀度和CD138表达的上调。此外，在培养上清液中，检测了IL-6分泌，伴随TLR9刺激(Barr et al.，2007)，以及浆细胞分化以后的IgM分泌。

在用包含HEL和CpG的珠刺激以后，观察到MD4B细胞经受广泛的增殖和浆细胞分化，如通过它们的CFSE稀度和CD138上调所证明的(图7A，左图片)。这对应于B细胞的IL-6和IgMa的分泌，如在上清中所检测到的(图7A，中和右图片)。重要的是，在用包含仅HEL或仅CpG的珠刺激以后，没有观察到增殖或浆细胞分化(图7A)。

因此，显而易见的是，颗粒CpG的摄取取决于通过BCR的抗原介导内化以便可用于它的受体。另外，在B细胞中TLR9的共衔接导致增殖和分化成PC。

抗原亲合力影响体外B细胞对颗粒性抗原-CpG的反应

在实施例1中，B细胞对颗粒性抗原的BCR刺激的反应被证明是取决于总抗原亲合力，所以我们检查了在体外用包含HEL和CpG的珠刺激以后，抗原亲合力对B细胞增殖和分化的影响。我们采用了涵盖一系列BCR亲合力的三种HEL突变体，如前所述(Batista and Neuberger，1998)：高亲和力突变体HEL^RD(K_a8×10⁸M^-1)；中亲和力突变体HEL^KD(K_a4×10⁶M^-1)；以及低亲和力突变体HELR^KD(K_a8×10⁵M^-1)。为了确保固定于珠的抗原量是可比较的，生物素化F10被用作各种HEL抗原与链抗生物素蛋白珠的接头。此外，通过在最初涂布阶段包括不同浓度的生物素化CGG，我们还产生了具有不同密度的珠，以与生物素化F10竞争结合于链抗生物素蛋白珠(图11B)。

我们观察到，用包含高或中等亲和力HEL和CpG的珠刺激的MD4B细胞经历显著的增殖和分化(图8A)。然而，在用包含低亲和力HEL和CpG的珠刺激以后，MD4B细胞并不分泌IL-6或IgMa。因此看来，需要抗原亲和力的阈值以便触发BCR介导的内化和刺激TLR9依赖性B细胞增殖以及PC分化。鉴于观察到这种抗原亲和力阈值，我们检查了B细胞反应对涂布在珠上的抗原密度的依赖性。在高和中等亲和力抗原的情况下，我们观察到B细胞增殖和分化(图7C而数据未示出)，并且IgMa和IL-6的生产(图7C)取决于抗原密度。在最低抗原亲和力的情况下，甚至在最高密度的抗原涂布珠的情况下，也不能检测到B细胞增殖和分化(图7C而数据未示出)、或IgMa和IL-6。

因此，我们证明了抗原亲合力(按照亲和力和密度)在确定TLR9介导的体外B细胞增殖和分化的程度方面的重要性。因而我们建议，BCR和抗原之间的相互作用的总强度必须超过为有效摄取珠和在TLR9衔接发生以后所规定的阈值。

颗粒性抗原-CpG刺激体内B细胞增殖和分化

因为我们已观察到，通过用颗粒性抗原-CpG体外刺激，TLR9介导的B细胞增殖和浆细胞分化，所以我们想确定在体内给予颗粒性抗原-CpG以后是否诱导类似的B细胞行为。为了解决该问题，将CFSE标记的MD4B细胞以及包含HEL和CpG的微球共同给予野生型受体小鼠。在过继转移后第4天，如上述分析了脾B细胞的CFSE稀度。通过CD138上调和高细胞内结合于HEL(如前所述)来展示浆细胞。此外，在血清中，确定了HEL特异性IgMa水平。

我们观察到，MD4B细胞以及包含HEL和CpG的珠的共注射导致HEL特异性B细胞的广泛的增殖(图8A)。另外，大约65％的这些细胞形成PC，如通过流式细胞术所确定的。通过在血清中测得的IgMa分泌证实了它们的存在(图2A右图片)。相反，在没有特异性T辅助细胞存在的情况下，MD4B细胞和仅包含HEL的珠的共注射不足以刺激B细胞增殖或分化成PC(图8A)。此外，用仅颗粒CpG的刺激不能触发B细胞增殖和分化。因此，我们已证明了，颗粒CpG的BCR介导内化是促进体内PC分化所需要的。

抗原亲和力影响体内B细胞对颗粒性抗原-CpG的反应

在用颗粒性抗原和CpG体外刺激以后，我们观察到在抗原总亲合力和B细胞反应之间的关联性，因此我们使用上面产生的各种HEL和CpG珠来体内刺激CFSE标记的MD4B细胞。

在用包含结合于高或中等亲和力HEL突变体的CpG的珠刺激以后，我们观察到广泛的B细胞增殖(图9A上图片)。这导致类似水平的PC分化，如通过CD138的上调、细胞内HEL染色以及IgMa的生产所证明的(图9A和图9B)。相反，包含低亲和力HEL突变体和CpG的珠产生B细胞增殖的远不突出的刺激和CD138⁺HEL特异性PC的三倍减少(图9A)。如所预期的，B细胞以及包含仅抗原或仅CpG的珠的共注射并不导致任何可观察到的B细胞增殖，而不管抗原的亲和力(数据未示出)。在CpG存在的情况下，减小高亲和力HEL突变体的抗原密度(从高至中等)并不显著改变增殖和PC分化的程度(图9C上图片)。然而，密度的进一步减小导致所形成的PC的百分比的减小(图9B和图9D，上图片)。使用低亲和力HEL抗原，抗原密度的影响是更加明显的，这表明存在一定阈值，高于该阈值，则包含抗原和CpG的珠可以被吸收，因而刺激增殖和分化。看来，体内观察到的这种抗原亲合力阈值低于体外观察到的抗原亲合力阈值，大概这是对于体内B细胞增殖和分化更有利的环境的结果。

总之，我们观察到，抗原-BCR相互作用的亲合力确定了体内颗粒抗原-CpG TLR9介导的B细胞增殖和浆细胞分化反应的程度。

用结合于CpG的颗粒性抗原进行的免疫可以增强特异性抗体反应

鉴于具有结合抗原的颗粒CpG对B细胞命运的影响，我们寻求研究它们体内诱导全身性免疫反应的能力。为了对此进行评估，我们已使用了单剂量腹腔内免疫策略，其中采用鸡γ球蛋白(CGG)作为抗原。先前已证明，在小鼠中CGG诱导强T细胞依赖性反应。用结合于CpG的颗粒CGG激发C57BL/6小鼠，并在7天和14天以后，利用ELISA分析了特异性抗体反应。

早在用结合于CpG的颗粒CGG免疫C57BL/6小鼠以后的第7天，我们检测了特异性抗CGG抗体生产，包括类别转换IgG(数据未示出)。在仅用颗粒CGG或CpG免疫的小鼠中，在该时间点，没有检测到特异性抗体。在第14天，通过仅用CGG的免疫，可以检测到lgG，然而如果CGG和CpG均存在于微球上，则滴度为10倍更高。有趣的是，在用仅抗原或抗原和CpG免疫以后，可以检测到亚型IgG1的IgG，而仅当颗粒涂布有CGG和CpG时，才发生类别转换到亚类IgG2b和IgG2c(图10A)。

到目前为止，我们已证明了，特异性BCR识别是在B细胞中有效细胞内TLR刺激所需要的。然而，我们热衷于评估，在全身性免疫反应的发展期间，在特异性抗体的生产中，抗原和CpG的共摄取的影响。为了解决该问题，我们用颗粒的两种不同的组合免疫C57BL/6小鼠：用结合于CpG的颗粒CGG并连同颗粒卵清蛋白(OVA)一起免疫第一组小鼠，而第二组则接受结合于CpG的颗粒OVA以及颗粒CGG(图10B)。响应结合于CpG的抗原，在每组中产生增加水平的特异性抗体，这表明，抗原和CpG的共摄取可以增强特异性B细胞激活和抗体生产。

实施例3

用结合于αGalCer的颗粒磷酸肽进行的免疫会增强特异性抗体反应

本发明的发明人寻求研究颗粒磷酸肽-αGalCer结合物体内诱导全身性免疫反应的能力。为了对此进行评估，本发明的发明人已使用了单剂量腹腔内免疫策略，其中采用磷酸肽作为抗原。用结合于aGalCer的颗粒磷酸肽(10μl/小鼠)或仅用颗粒磷酸肽，激发C57BL/6小鼠(第3组)，并在免疫以后的第0天和第7天，利用ELISA分析了特异性抗体反应。

材料和方法

抗原、脂质制备以及微球涂层

为了制备包含1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和N-帽生物素基-磷脂酰乙醇胺(PE-生物素)(均来自Avanti Polar Lipids)、DOPC/PE-生物素(98/2，m/m)或DOPC/PE-生物素/aGalCer(88/2/10，m/m/m)的脂质体，在氩气下干燥脂质并再悬浮在25mM Tris、150mM NaCl，pH 7.0中，同时剧烈混合。αGalCer购买自Alexis Biochemical。为了进行涂布，用脂质体接着用链抗生物素蛋白和生物素化蛋白温育二氧化硅微球(100nm；KiskerGbR)。

磷酸肽具有以下序列：生物素-GDTTST(磷酸基)FCGTPNY-酰胺。免疫和ELISA

WT C57BL/6小鼠购买自Charles River。用10μl包含磷酸肽和/或aGalCer的珠腹腔内免疫小鼠，然后通过ELISA确定了血清抗原特异性Ig水平。通过ELISA并通过使用BSA肽涂层板，测量了血清抗体。将不同稀度的小鼠血清加入平板，洗涤，然后通过使用用于检测的生物素标记的山羊抗小鼠IgM或IgG(BD Pharmingen)检测了在小鼠血清中的肽特异性IgM和IgG抗体。

结果

早在用结合于αGalCer的颗粒磷酸肽免疫C57BL/6小鼠以后的第7天，本发明的发明人检测了特异性抗肽抗体生产，包括高滴度的IgM和IgG(图14)。在仅用颗粒磷酸肽免疫的小鼠中，在该时间点，没有检测到特异性抗体。

实施例4

材料和方法

HEL和OVA(Sigma-Aldrich)、CγG(Jackson Immuno Research)、CFSE(Invitrogen)、5’生物素化CpG 1668(Sigma-Genosys)、以及重组IL-6(BD Biosciences)。先前35描述了HELRD、HELK、HELKD以及HELRKD。0.13μm链抗生物素蛋白涂布微球(Bangs Inc)和0.2μmFluoSpheres Neutravidin微球(Invitrogen)。

抗体

相对于小鼠Ag的单克隆抗体：抗CD138-PE(克隆281-2)和-生物素；抗CD45.2-PerCP-Cy5.5(10G)；抗IL-6(MP5-20F3)；抗IL-6-生物素(MP5-32C11)；抗CD16/32(2.4G2)；抗IgMa-生物素(DS-1)；抗IgG1-生物素(A85-1)；抗IgG2b-生物素(R12-3)；抗IgG3-生物素(R40-82)；以及抗CD45R/B220(RA3-6B2)(均来自BD Biosciences)。已描述36了单克隆抗HEL F10。多克隆抗小鼠-IgG-HRP(Pierce)；单克隆抗β-肌动蛋白(AC-15)和单克隆抗鸡卵清蛋白(OVA-14)(均来自Sigma Aldrich)；抗磷酸基-p38MAP激酶(Thr180/Tyr182)和抗p38MAP激酶抗体(均来自Cell Signalling)。相对于小鼠Ag的多克隆抗体：抗IgM-生物素；抗IgG-生物素；抗IgG2c-生物素；抗IgM；抗IgG；抗IgG1；抗IgG2b；抗IgG2c以及抗IgG3(均来自Southern Biotech Inc)。抗鸡溶菌酶(United States Biological)、AlexaFluor-488山羊抗小鼠IgG(H+L)以及AlexaFluor-546山羊抗大鼠IgG(H+L)(均来自Invitrogen)。

微球涂层

在添加生物素化CpG和/或生物素化Ag(OVA、HEL或CγG)以前，洗涤链抗生物素蛋白涂布的微球并再悬浮在PBS中。为了产生涂布有不同密度的HEL突变体的微球，生物素化抗HEL F10和/或生物素化CpG用于初始涂布，如前所述36。

B细胞纯化、标记以及培养

通过阴性选择并使用B细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec)，将脾B细胞富集至＞99％的纯度并用2μM CFSE加以标记。在补充有10％FCS(PAALabs)、50μM β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、25mM Hepes(Invitrogen)以及10单位/ml青霉素/链霉素(Invitrogen)的RPMI-1640培养基(Invitrogen)中培养B细胞。在温育72小时以后收获用1μl颗粒刺激的1×10⁶CFSE标记的B细胞，以评估增殖和分化。

DC纯化和培养

通过在补充有重组GMCSF(R&D Systems)的上述培养基中培养来自小鼠股骨的前体来产生源自骨髓的DC。在5天以后，利用CD11c+微珠(Miltenyi Biotec)将DC富集至＞99％的纯度。

过继转移和免疫

通过尾静脉注射，将1-5×10⁶CFSE标记的MD4或HyHel10B细胞以及包含HEL和/或CpG的1-10μl颗粒过继转移到WT C57BL/6小鼠中。用1-10μl涂布有OVA或CγG(作为Ag)和/或CpG的颗粒腹腔内免疫小鼠。

流式细胞术

在脾脏中增殖和PC分化的检测是基于先前40描述的方法。简单地说，制备脾脏的单细胞悬浮液并用经纯化的抗CD16/32来阻断样品。用HEL接着用抗HEL F10-AlexaFluor-647来检测HEL特异性B细胞。通过它们与抗CD138-PE的结合来鉴定PC。

为了检测细胞内HEL结合，将B固定在PFA中并利用0.1％皂苷(或皂素)加以透化。在3小时以后，通过流式细胞术，评估了用1μl/10⁶个细胞荧光颗粒刺激的细胞颗粒摄取的程度。

免疫测定和免疫组织化学

以类似于先前36描述的方式，ELISA用来量化血清抗原特异性IgMa和IgG以及IL-6的生产。在用抗IgG-HRP或抗IgMa-生物素显影以前，用如先前描述36的脾细胞来阻断和温育涂布有100μg/ml HEL或CγG(在PBS中)的ELISPOT平板。如前所述36，进行脾切片的免疫组织化学分析。

结果

在体内免疫以后CpG与Ag的直接连锁可以增强特异性抗体反应

本发明的发明人最初寻求研究Ag和CpG的直接结合对体内体液免疫反应的影响。为此，他们已设计了一种方式，该方式涉及将Ag和CpG直接结合到链抗生物素蛋白聚苯乙烯珠上，上述珠的直径类似于典型病毒病原体的直径。通过流式细胞术证实了在用生物素化Ag和/或CpG涂布以后，颗粒结合物的成功产生(图19A)。用两种颗粒Ag、鸡-γ-球蛋白(CγG)和卵清蛋白(OVA)同时免疫C57BL/6小鼠。对于每组免疫小鼠，将颗粒Ag之一结合于CpG。在颗粒给予以后第14天，通过ELISA测量了Ag特异性IgG抗体的生产。对于携带结合CpG的颗粒Ag(Ag-CpG)，观察到在免疫以后Ag-特异性抗体滴度的选择性增强。对颗粒Ag-CpG的这种增强的响应伴随类别转换Ag-特异性抗体的生产，主要为IgG2b和IgG2c同型。有趣的是，IgG2同型的抗体是与病毒中和41有关的免疫反应的特别有效的介质，并且它们的生产与TLR9刺激有关。另外，本发明的发明人观察到，在用颗粒CγG-CpG单剂量免疫以后，在骨髓内，Ag-特异性抗体分泌细胞(ASC)长达三个月(图13)。因此，我们已证明了，用直接附着于Ag和CpG的颗粒进行的免疫可以增强Ag-特异性抗体滴度并体内诱导类别转换主要到IgG2亚型。

Ag-CpG结合物的BCR介导的摄取是刺激体外TLR依赖性分化成PC所需要的

为了阐明特异性抗体滴度增强的机制，本发明的发明人已采用转基因MD4B细胞，其表达对于鸡卵溶菌酶(HEL)特异性的BCR。用包含HEL(作为Ag)和/或CpG的颗粒体外刺激CFSE标记的MD4B细胞(图19B)。在刺激以后第三天，分别通过CFSE的稀度和CD138表达的上调，流式细胞术用来监测B细胞增殖和PC分化。在用颗粒HEL-CpG刺激以后，观察到MD4B细胞的广泛增殖以及分化以形成PC。这些B细胞反应关联于IL-6和HEL-特异性IgMa的分泌，这和先前的报道一致。用各种大小的颗粒获得了类似结果，只要它们的直径不超过0.5μm(数据未示出)。有趣的是，在用仅包含HEL或CpG的颗粒刺激以后，没有观察到增殖或分化。

为了鉴定能够刺激B细胞反应的颗粒的关键特性，本发明的发明人使用流式细胞术来检测荧光标记颗粒的细胞摄取。虽然B细胞能够吸收颗粒HEL-CpG，但我们观察到，它们不能仅捕捉颗粒CpG(图19C)。因此，仅包含CpG的颗粒不能以与针对可溶性CpG所观察到的相同方式来刺激非特异性B细胞反应。颗粒CpG不能进入B细胞并不是由于从细胞普遍排除这些颗粒，因为结合于颗粒并不损害树突细胞对CpG的摄取(图19C)。然而，我们观察到，颗粒上的Ag能够进入B细胞(图19C)，并提示BCR与用来使这些结合物可以进入B细胞的机制有关。

严格Ag-BCR亲合力阈值调节体外Ag-CpG刺激的B细胞激活

先前的观测结果已提示，Ag-BCR相互作用的结合强度会影响B细胞分化的结果5。因为通过BCR的抗原识别是颗粒Ag-CpG刺激B细胞反应所需要的，所以本发明的发明人检查了Ag亲合力(按照亲和力和密度)对体外TLR9依赖性增殖和分化的影响。为了解决该问题，本发明的发明人使用了多种先前描述的重组HEL突变体，其结合具有减小亲和力的BCR：野生型HEL(Ka 2×10¹⁰M^-1)；HELRD(Ka 7.9×10⁸M^-1)；HELK(Ka8.7×10⁶M^-1)；HELKD(Ka 4.0×10⁶M^-1)；以及HELRKD(Ka 0.8×10⁶M^-1)。通过生物素化单克隆抗HEL F10作为桥以确保可比较的涂层密度，将各种HEL蛋白固定于颗粒。当Ag以高密度存在于颗粒CpG上时，降低HEL的亲和力约5000倍(Ka，从2×10¹⁰到4.0×10⁶M^-1)几乎不影响B细胞增殖或IL-6生产(图21A和B)。然而，HEL亲和力的进一步5倍降低(至Ka0.8×10⁶M^-1)则显著降低CpG颗粒刺激B细胞激活的能力。因此，显而易见的是，必须超过Ag亲和力的最小阈值以触发BCR介导的Ag内化、伴随的B细胞增殖和IL-6分泌。观测Ag亲和力的这样的阈值提示，由颗粒Ag-CpG诱导的反应取决于由B细胞吸收的颗粒量。为了证实该假说，我们使用了荧光颗粒来比较B细胞获得不同HEL结合物的能力。如图14所示，在亲和力阈值以上，在整个广泛的亲和力范围内(从Ka 2×10¹⁰至4.0×10⁶M^-1)，吸收的颗粒量是可比较的。相反，以该阈值以下，我们观察到B细胞获得的颗粒量的显著减少。因此，显而易见的是，在严格阈值以上，Ag对于BCR的亲和力会影响内化的Ag-CpG颗粒的量。因为Ag-BCR相互作用的结合强度取决于通过BCR所看到的Ag的亲和力，所以我们假设，通过减少颗粒上HEL的密度，可以观测到刺激能力的进一步区别。为了产生包含减小密度的HEL的颗粒，在最初涂布阶段，我们包括了无关的生物素化蛋白以与生物素化F10竞争结合于链抗生物素蛋白微球。如所预期的，用包含减小密度的各种HEL蛋白的CpG颗粒进行的刺激会产生更少量的B细胞增殖和IL-6分泌。在包含CpG的颗粒上HELRKD密度的2倍减小会使它们不能刺激B细胞增殖和IL-6生产。类似地，更高亲和力HELRD蛋白的密度的4倍减小也使得包含CpG的颗粒不能刺激B细胞反应。有趣的是，为了诱导IgMa分泌，BCRAg相互作用的亲合力阈值似乎低于为刺激增殖和IL-6生产所需要的亲合力阈值。因此，很可能，Ag必须以足够的亲合力存在以诱导颗粒Ag-CpG的内化所需要的最低程度的BCR成簇。因此，甚至以足够高密度存在的低亲和力Ag也可以超过为能够进行BCR介导的内化和伴随的B细胞反应的刺激所需要的阈值。因此，本发明的发明人已证明了，Ag亲合力在决定TLR9介导的体外B细胞增殖和分化的程度方面的重要性。因此我们建议，BCR和Ag之间的相互作用的总强度必须超过规定阈值以便于有效摄取颗粒以及随后的通过颗粒CpG的TLR9刺激。

通过体外TLR9刺激的强度确定了通过颗粒Ag-CpG的B细胞分化的程度

因为由B细胞吸收的颗粒Ag-CpG的总量取决于Ag-BCR相互作用的总亲合力，所以很可能，颗粒的CpG成分会影响所诱导的B细胞激活的程度。因此，本发明的发明人寻求研究结合于颗粒HEL的CpG的不同量对所诱导的B细胞反应的影响。为此，使颗粒涂布有不同量的CpG但相同总量的HEL，以确保恒定Ag亲合力，从而确保BCR介导进入细胞。如图15所示，在颗粒上存在的CpG量的减少直接关联于B细胞增殖、以及IL-6和IgMa的分泌的降低。因此，包含最大量结合CpG的颗粒HEL会刺激分化以在最大程度上形成PC。然而，在用包含10倍减少量的结合CpG的颗粒刺激以后，几乎检测不到B细胞分化。

因此，很明显，B细胞获得的CpG量对于响应颗粒Ag-CpG的EF PC的产生是关键的，这表明，信号通过TLR9的程度在确定B细胞分化的结果方面是重要的。

颗粒HEL-CpG刺激分化以体内形成EF PC

本发明的发明人热衷于确定，是否它们的体外观测结果代表体内对Ag-CpG颗粒的B细胞反应。为了对此进行评估，将CFSE标记的MD4B细胞和包含HEL和/或CpG的颗粒共同给予野生型受体小鼠。在过继转移以后，在指定时间点，通过CFSE稀度，评估了MD4脾B细胞的增殖。此外，利用多色流式细胞术，量化了CD138+细胞内HEL+MD4脾PC的存在。

在共注射MD4B细胞和颗粒HELRD-CpG以后，观测到HEL特异性B细胞的广泛增殖(图16A，左图片)。在刺激后第三天，这种增殖达到最大(图16B)并且与在血清中PC的形成以及HEL-特异性IgMa的出现同时发生(图16A中和右图片；图16C)。这种CD138+PC群体在自然界中似乎是短寿命的，因为在刺激以后约三至四天它们的数目达到峰值。和此一致，对于在脾脏的EF区形成的HEL特异性PC的群体，观测到类似的动力学(图16D)。此外，在仅用颗粒CpG或HEL刺激野生型MD4B细胞以后，没有检测到这些反应(图16A)。因此，并且与本发明的发明人的体外观测结果一致，BCR和TLR9的连续衔接是刺激体内强劲的B细胞反应所需要的。因此，它们已证明了，颗粒HEL-CpG会体内刺激B细胞的TLR9介导增殖和分化成短寿命的EF PC。类似于体外发现，他们观测到，需要超过BCR-Ag相互作用的强度的阈值，以诱导体内B细胞激活。因此，HEL亲和力的大于2000倍的减小(从Ka 2×10¹⁰至8.7×10⁶M^-1)并不减少刺激的B细胞反应。然而，在通过HEL-CpG颗粒刺激以后，Ag亲和力的进一步2倍减小会导致严重受损的B细胞增殖和分化。另外，涂布有更低密度的HEL的颗粒会持续使得能够B细胞增殖和分化，尽管以稍微降低的水平。相反，包含低密度HELK的颗粒不能产生显著的B细胞反应。因此只要低亲和力Ag以足够密度存在，则颗粒就可以用来体内刺激B细胞增殖和分化。这些观测结果说明了，在TLR9介导的体内对颗粒Ag-CpG的B细胞反应的刺激以前，需要超过BCR结合强度的阈值。最后，我们热衷于确定不同量的TLR9刺激对体内B细胞分化的结果的影响。如图17D所示，B细胞增殖和HEL特异性PC的形成的程度直接取决于结合于颗粒HEL的CpG的密度。因此，如在体外一样，TLR9刺激的量在确定体内B细胞反应方面是重要的，并且可以潜在地作为一种机制，其用于微调用Ag-CpG颗粒进行刺激的结果。总之，显而易见的是，在BCR介导内化以后，颗粒Ag-CpG结合物会体内刺激B细胞增殖和分化以形成EFPC，因而确定了我们的体外观测结果的生理意义。

颗粒HEL-CpG刺激Ag特异性类别转换抗体的生产

本发明的发明人的观测结果表明，用颗粒Ag-CpG对小鼠的免疫导致抗原特异性类别转换抗体的生产。然而，因为在我们的研究中采用的转基因MD4B细胞到目前为止不能经历类别转换，所以我们采用一种可替换的转基因模型系统来进一步研究该现象。这种转基因小鼠系统产生B细胞，其表达高亲和力HyHEL10BCR并且能够经历类别转换重组。过继转移到野生型受体中的HyHEL10B细胞经历广泛的增殖和分化以类似于针对MD4B细胞所观测到的方式响应颗粒HEL-CpG形成PC(数据未示出)。所分泌抗体的同型分析揭示了，在用颗粒HEL-CpG刺激以后，发生了类别转换重组，导致IgG的生产，主要为IgG2亚型(图18E)。重要的是，因为在培养物中仅模拟HyHEL10B细胞以后，检测到抗体同型的类似模式，所以我们体内观测到的类别转换很可能与CD4+T辅助细胞无关(图17F)。这些发现与来自进行的最初免疫的观测结果是一致的。因此，显而易见的是，在BCR介导的内化以后，颗粒Ag-CpG不仅刺激B细胞增殖和分化以形成短寿命PC，而且还刺激类别转换重组到IgG2同型。

讨论

TLR9激动剂CpG具有刺激过多的与免疫系统的先天性和适应性分枝的激活有关的反应的能力。在这里，本发明的发明人已确定了，CpG与Ag的直接结合会产生增强的和特异性B细胞反应。该研究涉及开发一种策略以产生具有固定在表面上的Ag和CpG的颗粒，从而通过BCR，B细胞可以摄取它们。本发明的发明人观测到，受体介导的摄取的特征在于严格调节的亲合力阈值并以Ag特异性方式导致递送CpG至B细胞固有的TLR9。重要的是，仅颗粒CpG被禁止使用进入B细胞的非特异性方式，从而使得颗粒Ag-CpG刺激TLR9介导反应的能力具有高度选择性。另外，本发明的发明人已表明，在BCR介导摄取以后，TLR9衔接会触发显著增强的B细胞增殖和短寿命的EF PC的形成。以前关于TLR9刺激对B细胞行为的影响的许多研究已采用可溶性CpG。这样的研究报道了，TLR9的刺激导致B细胞的增强的增殖和分化以形成PC，其能够产生同种型转换抗体。在这里，我们观测到，颗粒CpG(不同于可溶性CpG)不能经由非特异性液相胞饮作用而进入B细胞。相反，CpG与颗粒的结合并不阻止它被专用巨噬细胞如树突细胞摄取。这些巨噬细胞保留潜在地通过与先天性免疫细胞功能有关的模式识别受体来获得颗粒的能力。相反，B细胞需要Ag特异性和信号感受态BCR的存在以使得能够有效摄取颗粒Ag-CpG。已证明了，在自身免疫病发展期间，在包含TLR9-刺激性配体的免疫复合物的内化中BCR的必要性。

本发明的发明人已证明了，在用颗粒Ag-CpG刺激以后，Ag-BCR相互作用的亲合力会影响B细胞激活的结果。T细胞依赖性B细胞反应的早期研究引入以下概念：激活B细胞分化成PC或GC的决定是随机过程。然而，两项最近的研究已使用各种Ag和BCR亲和力来研究总BCR-Ag亲合力对B细胞分化的结果的影响。因为诱导更大信号通过BCR的Ag优先驱动B细胞变成EF PC，所以Brink小组已提出一种简明的模型，借此BCR-Ag相互作用的信号强度可以控制B细胞分化的结果5。在这里，在规定阈值以上，本发明的发明人观测到Ag-BCR相互作用的亲合力、颗粒的内化以及形成EF PC的分化量之间的相关性。因此看来，在内化以后，TLR刺激可以覆盖BCR依赖性信号以确定B细胞分化的结果。此外，一种类似机制可以成为先前在佐剂存在的情况下在用NP(作为Ag)刺激以后的观测结果的基础。因此，本发明的发明人建议，相对于先前Ag-BCR亲合力研究的结果，本文提供的结果不是相反的，而是补充的，因为，如Brink研究5所预计的，B细胞的分化是通过因素的组合来控制的。先前已建议组合信号用来形成B细胞激活的结果的概念31。确实，作者们证明了，原初人B细胞的持续存活和分化需要BCR与Ag的衔接、T辅助细胞的可用性以及信号通过TLR系统。在本文中，本发明的发明人已表明，只要满足BCR介导内化所需要的亲合力阈值，颗粒Ag-CpG对细胞内TLR9的刺激就会影响B细胞分化的结果。另外，利用过继转移策略，他们已决定性地表明，形成短寿命PC的B细胞增殖和分化是依赖于体内固有TLR9的刺激。因此，增加TLR9介导刺激的程度(通过增加结合于颗粒Ag的CpG的量)可以以定量方式增强EF PC的产生。

这些观测结果与以前的研究结果是一致的，以前的研究已确定了固有TLR介导的信号在激活B细胞的分化中的关键作用。此外，最近已经证明，TLR介导信号而不是CD4+T辅助细胞是自身反应B细胞的激活和EF发展所绝对需要的48。有趣的是，并且支持我们的观测结果，已经发现，TLR9介导信号可以暂时与BCR的最初刺激分离31。在免疫反应的早期并通过第一波保护性抗体的快速生产，TLR介导信号覆盖BCR依赖性信号并刺激EF PC生产的能力可能具有重要作用。在BCR介导摄取以后，本发明的发明人观测到，颗粒Ag-CpG进入以刺激B细胞内的TLR9。先前的研究已经证明，BCR刺激导致形成细胞内复合物，其是通过融合许多内体样囊泡而形成的49。该复合物是其中内化受体所定位的部位，并且似乎类似于在BCR刺激以后所观测到的富集有TLR9的自噬体样室20。通过证明新合成的MHC-II分子也位于这些内体室中50，首次理解了胞吞BCR以及相关Ag的定向定位的功能意义。因此，BCR介导的内化可以促进加工Ag并将Ag有效装载到MHC-II上，用于随后呈递到为完全B细胞激活所必要的特异性CD4+辅助性T细胞。此外，已经证明，在表面呈递到iNKT细胞以前，MHC样分子CD1d在内体室内获得脂质Ag，如αGalCer。响应于颗粒Ag-αGalCer，为刺激特异性iNKT介导的B细胞增殖和分化成EF PC，需要BCR介导内化的类似机制36。这些观测结果合起来意味着内体或内体样室作为关键部位，用于协调细胞内通讯，其最终控制细胞过程如分化的结果。在本文中我们证明了通过使用颗粒Ag-CpG结合物来选择性地和受控刺激Ag特异性体液免疫反应。因为这些颗粒提供了将CpG的免疫刺激能力引导到细胞的特定群体的方式，所以在成功疫苗接种策略的未来设计中它们作为有效佐剂具有巨大价值。因此，设想以这种颗粒形式来使用CpG，以防止与非特异性TLR9刺激有关的自身免疫病的发展以及与重复给予可溶性CpG有关的淋巴滤泡破坏53。此外，变化它们的精确组成，颗粒Ag-CpG可以用来精细控制免疫所刺激的免疫反应。确实，在颗粒CpG结合物内包含多种Ag可以潜在地便于更有效地诱导保护性免疫反应。本发明的发明人已经开发了一种用于在颗粒的表面上直接结合Ag和免疫刺激剂CpG的方式。通过BCR介导的胞吞作用，这些颗粒可以选择性地进入Ag特异性B细胞，从而便于细胞内TLR9的衔接。用这些颗粒进行的刺激导致增强的B细胞增殖和分化以形成EF PC，其有能力体内分泌Ag特异性类别转换抗体。采用这些颗粒的研究结果不仅可用于阐明在初次免疫反应的发展期间TLR9的参与的原理，而且还可用于发展在疫苗接种中所需要的Ag特异性免疫刺激剂。

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Claims (58)

1.一种能够进行BCR介导的内化的产品，包括：

(i)载体，以及

(ii)附着于所述载体的BCR结合抗原。

2.根据权利要求1所述的产品，进一步包括：

(ii)附着于所述载体的免疫刺激剂。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的产品，其中，所述载体是颗粒。

4.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中，所述颗粒是脂质体。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的产品，其中，所述颗粒是可选地涂布有脂质体的珠。

6.根据权利要求1至3以及5中任一项所述的产品，其中，所述载体是聚合物或硅石载体。

7.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中，所述载体或颗粒具有1nm至10μm的尺寸。

8.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中，所述抗原和所述免疫刺激剂借助于接头，如亲和素-生物素接头附着于所述载体或颗粒。

9.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中，所述免疫刺激剂包括至少两种不同的免疫刺激剂。

10.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中，所述抗原包括至少两种不同的抗原。

11.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中，所述免疫刺激剂是iNKT细胞激动剂。

12.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中，所述免疫刺激剂是脂质或糖脂。

13.根据权利要求12所述的产品，其中，所述脂质是苏糖醇神经酰胺(IMM47)。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的产品，其中，所述免疫刺激剂是糖基神经酰胺。

15.根据权利要求14所述的产品，其中，所述糖基神经酰胺是α-半乳糖苷神经酰胺(αGal-Cer)。

16.根据权利要求1至10中任一项所述的产品，其中，所述免疫刺激剂是TLR激动剂。

17.根据权利要求16所述的产品，其中，所述TLR激动剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)或多聚U寡核苷酸。

18.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中，所述抗原包括肽、磷酸肽或碳水化合物。

19.根据权利要求18所述的产品，其中，所述抗原包括肽或磷酸肽。

20.一种药物组合物，包括根据前述权利要求中任一项所述的产品以及合适的载体。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，进一步包括可溶性免疫刺激剂。

22.根据前述权利要求中任一项所述的产品或组合物，用作疫苗。

23.一种在受试者中诱导抗原特异性免疫反应的方法，包括以下步骤：

给予受试者有效量的根据前述权利要求中任一项所述的产品或组合物，以允许特异性BCR介导的内化和B细胞激活。

24.根据权利要求23所述的方法，用于预防性或治疗性接种疫苗。

25.一种用于在受试者中增加BCR结合抗原的免疫原性的方法，包括给予所述受试者包括载体和附着于所述载体的所述抗原的产品，并且其中免疫刺激剂附着于所述载体或与所述产品一起共同给予免疫刺激剂。

26.一种用于制备根据权利要求2至19中任一项所述的产品的方法，包括以下步骤：

(a)将BCR结合抗原附着于载体，以及可选地

(b)将免疫刺激剂附着于所述载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(a)和(b)。

27.一种用于在受试者中增加对于BCR结合抗原的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将所述抗原附着于载体，以及

(b)将免疫刺激剂附着于所述载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(a)和(b)，以及

(c)将所述载体给予受试者，

以允许特异性BCR介导的内化和B细胞激活。

28.一种用于制备根据权利要求2至21中任一项所述的产品或组合物的载体，其中，免疫刺激剂附着于所述载体。

29.一种用于在受试者中增强BCR介导的免疫反应的方法，包括给予受试者根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物。

30.一种诱导细胞特异性摄取免疫刺激剂的方法，包括以下步骤：

(i)将BCR结合抗原附着于载体，

(ii)将所述免疫刺激剂附着于所述载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(i)和(ii)，以及

(iii)使细胞与所述载体接触以允许特异性BCR介导的内化和B细胞激活。

31.一种将BCR结合抗原和免疫刺激剂递送至细胞以诱发抗原特异性免疫反应的方法，包括：

(i)以第一密度将BCR结合抗原附着于载体，

(ii)将所述免疫刺激剂附着于所述载体，

可选地以颠倒的次序进行步骤(i)和(ii)，

(iii)使所述载体与细胞接触，

(iv)测试所述细胞的抗原介导激活，

可选地用不同密度的所述抗原重复步骤(ii)至(iv)。

32.一种生产针对抗原的抗血清的方法，所述方法包括将根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物引入到非人哺乳动物中，然后从所述哺乳动物回收免疫血清。

33.一种可通过根据权利要求32所述的方法获得的免疫血清。

34.一种可由根据权利要求33所述的血清获得的抗体。

35.一种针对疾病的被动免疫的方法，所述方法包括给予受试者包含根据权利要求34所述的抗体的免疫血清。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述疾病是癌症、传染病、变态反应或自身免疫病。

37.根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物，用作药物。

38.根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物，用于治疗癌症、传染病、变态反应或自身免疫病。

39.根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物在制备用于治疗癌症、以及传染病、变态反应或自身免疫病的药物中的应用。

40.一种用于生成永生化细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)使B细胞与根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物接触，以及

(ii)永生化步骤(i)的所述B细胞。

41.一种用于生成永生化的B淋巴细胞的方法，所述方法包括步骤(i)：

在根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物存在的情况下，离体永生化B淋巴细胞。

42.一种用于生成能够生产单克隆抗体的永生化B淋巴细胞的克隆的方法，所述方法包括：

(i)使B淋巴细胞与根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物离体接触，以及

(ii)永生化步骤(i)的所述B细胞。

43.一种用于生成能够生产单克隆抗体的永生化B淋巴细胞的克隆的方法，所述方法包括：

(i)在根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物存在的情况下，永生化细胞的群体，所述群体包括B淋巴细胞或由B淋巴细胞组成。

44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：筛查经转化的淋巴细胞的抗原特异性。

45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：分离所述永生化的B细胞。

46.根据权利要求40-45中任一项所述的方法，其中，永生化步骤包括：

用转化病毒转化，用另一种永生化细胞融合，或刺激所述B细胞中的CD40。

47.根据权利要求40-46中任一项所述的方法，其中，所述B细胞是人B细胞。

48.根据权利要求40-47中任一项所述的方法，进一步包括从所述永生化B细胞分离单克隆抗体。

49.可通过根据权利要求48所述的方法获得的单克隆抗体。

50.一种用于加速生产特异性抗体的方法，所述方法包括将根据权利要求1至21中任一项所述的产品或组合物引入到非人哺乳动物中，并从所述哺乳动物回收抗体。

51.一种用于抑制B细胞非特异性摄取免疫刺激剂的方法，所述方法包括以下步骤：在与所述B细胞接触以前，将所述免疫刺激剂附着于载体。

52.一种在受试者中诱导或增加对于BCR结合抗原的抗原特异性免疫反应的方法，所述方法包括给予所述受试者包含载体和附着于所述载体的所述抗原的产品，并且其中免疫刺激剂附着于所述载体或与所述产品一起共同给予免疫刺激剂，并且其中当给予受试者时，可溶形式的所述抗原不能够诱导TH细胞反应。

53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述抗原包括肽、磷酸肽或碳水化合物。

54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述抗原包括肽或磷酸肽。

55.一种将药剂相对于B细胞优先递送至树突细胞的方法，所述方法包括：

(i)将所述药剂附着于载体，

(ii)使细胞群体与附着于所述载体的药剂接触，其中所述细胞群体包括B细胞和树突细胞。

56.根据权利要求55所述的方法，其中，所述药剂是免疫刺激剂。

57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述免疫刺激剂是根据在权利要求11至17任一项中所描述的。

58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中，所述载体是根据在权利要求3至8中任一项中所描述的。

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