CN102164486B

CN102164486B - s-(+)-脱落酸的盐、包含所述盐的水性液体组合物及其制备方法

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Publication number: CN102164486B
Application number: CN200980138097.XA
Authority: CN
Inventors: B·A·贝尔金德; D·F·海曼; 黄征宇; 刘晓忠; P·D·佩特拉塞克
Original assignee: Valent BioSciences LLC
Current assignee: Valent BioSciences LLC
Priority date: 2008-07-24
Filing date: 2009-07-23
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2029-07-23
Also published as: CN102164486A; CL2011000025A1; EP2320727B1; WO2010011809A1; MX2011000930A; AR074709A1; ES2548355T3; EP2320727A1; US8278480B2; AU2009273979A1; EP2320727A4; CA2731381C; ZA201100535B; AU2009273979B2; CA2731381A1; BRPI0916204A2; BRPI0916204B1; US20100152046A1

Abstract

本发明通常涉及用于农业用途的具有增强性能的S-(+)-脱落酸的盐、包含这些增强性能的S-(+)-脱落酸的盐的水性液体组合物及其制备方法。

Description

S-(+)-脱落酸的盐、包含所述盐的水性液体组合物及其制备方法

发明领域

本发明大体涉及用于农业用途的具有增强性能的S-(+)-脱落酸的盐、包含这些S-(+)-脱落酸盐的水性液体组合物及其制备方法。

发明背景

脱落酸为天然存在的植物激素，其主要作用为抑制植物生长、维持芽休眠、抑制果实成熟、激活病原抗性反应防御措施(pathogen resistance response defense)、诱导已经损坏的细胞及其邻近细胞衰老，并帮助植物耐受应激条件，特别是缺乏充足水分的条件。参见Arteca，R.(1996)，植物生长物质：原理和应用(Plant Growth Substances：Principles and Applications).New York：Chapman & Hall；Mauseth，J.D.(1991)，植物学：植物生物学介绍(Botany：An Introduction to Plant Biology).Philadelphia：Saunders.pp.348-415；Raven，P.H.，Evert，R.F.，and Eichhorn，S.E.(1992)，植物生物学(Biology of Plants).New York：Worth.pp.545-572。

脱落酸因据信这种植物生长调节剂可在秋季引起树叶从落叶树上脱落而得名。Absicin II和休眠素为这种植物激素以前使用的名字。Milborrow，Ann.Rev.Plant Physiol.1974，25，259-307描述了脱落酸及其类似物的化学和生理学。

脱落酸天然存在的对映异构形式为(S)-(+)-脱落酸。在一些文献中报道另一种对映异构体，(R)-(-)-脱落酸被认为是无生物学活性的。在其它研究中，据报道(R)-(-)-脱落酸也有一些生物活性，但是，它们通常与(S)-(+)-对映异构体的活性不同。参见，Zeevart J.A.D.and Creelman，R.A.(1988)脱落酸的代谢和生理学(Metabolism and Physiology of Abscisic Acid)，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol. Biol.39，439-473。因此在用于商业化农产品时，包含(S)-(+)-脱落酸的特定盐和盐的组合作为活性成分的本发明的组合物要优于包含各种外消旋或纯对映异构形式的脱落酸或其普通盐如钠、钾或铵盐的先有技术的组合物，因为可得到大大增强的生物活性，而对目标植物没有当使用表面活性剂增强生物有效性时常见的植物毒性风险。

大部分天然存在的脱落酸侧链的立体化学为2-顺式-，4-反式-，因为其为所有绿色植物和一些微生物生物合成的异构体。也发现天然存在少量的(S)-(+)-2-反式-，4-反式-异构体，因为其是通过阳光对(S)-(+)-2-顺式-，4-反式-异构体的光解作用产生的。(S)-(+)-2-反式-，4-反式-异构体据报道为无生物学活性的。参见P.E.Kreidelmann，et al.，Plant Physiol.49，842-847(1972)，D.-P.Zhang，et al.，Plant Physiol.128，714-725，(2002)或X.-C.Yu，et al.，Plant Physiol.140，558-579(2006)。

先有技术(U.K专利第1251867号以及Railton和Wareing，Planta112，65-69，1973)尤其教导了外消旋脱落酸胺盐的制备。制备外消旋(R，S)-(±)-2-反式-，4-反式-脱落酸与手性生物碱番木鳖碱的盐作为拆分少量的外消旋化合物的工具以研究其对映异构体的物理性质(J.C.Bonnafous，et al.，Tetrahedron Letters，1119-1122，1973)。2008年1月30日提交的序列号为12/011,845的尚未批准的U.S.专利申请公开了 (S)-(+)-脱落酸的某些盐，包括铵、钠、钾、锂、镁、钙金属盐以及与简单伯、仲和叔有机胺形成的盐。但是，此专利申请未公开(S)-(+)-顺式-，反式-脱落酸与重碱金属、季铵阳离子或胍的盐，其也未公开(S)-(+)-脱落酸的普通盐与作为性能增强添加剂的碱金属、季铵阳离子或胍的碘盐的组合。

如上所述，脱落酸为羧酸，因此在介质中具有酸性pH，其为质子化的，并为中性未解离形式。这种不带电荷的未解离的形式比脱落酸盐更具亲脂性，相对于在较高pH存在的脱落酸的带电荷、解离形式，不带电荷的酸形式更有利于渗透到植株表皮内(Blumenfeld and Bukovac 1972，Planta 107：261-268)。不带电荷的、未解离形式的脱落酸预计比盐形式更容易穿过细胞膜从质外体进入细胞溶质。除此之外，我们惊讶地发现与包含同样浓度的(S)-(+)-脱落酸的酸形式的同样的处理相比，包含本发明的脱落酸的特定的盐的处理具有更好的生物活性，并且也更优于(S)-(+)-脱落酸与普通抗衡离子如钠、钾或铵的盐。

在1960年代早期脱落酸被首次被定义为生长抑制剂，其在正在脱落的棉果(cotton fruit)和光周期诱导成为休眠的美国梧桐的树叶中聚积。参见，Finkelstein RR，Rock CD(2002)，脱落酸生物合成和响应(Abscisic Acid Biosynthesis and Response)，The Arabidopsis Book：Vol.45，No.1 pp.1-48。从那以后，脱落酸已被证明可调节植物生长和发育的许多方面，包括胚芽成熟、种子休眠、发芽、细胞分裂和细胞延长等。尽管脱落酸在历史上被认为是生长抑制剂，但是具有高脱落酸水平的幼小组织和脱落酸缺乏的突变植株都有严重的发育障碍，因为其降低蒸腾并建立膨胀(turgor)的能力受损。外源性脱落酸处理的突变体恢复正常细胞的膨胀(expansion)和生长。

脱落酸被认为是通过与受体蛋白结合开始其对细胞的作用，尽管其鉴定和定位大部分都还未知。假定受体的活化引起导致离子通道快速变化和基因转录模式的更慢变化的一系列事件。尽管已鉴定出这一系列事件的许多个体组分，但尚未完全了解。

包含脱落酸的商业制剂以各种目的用于农业，如提高植株的应激耐受力、减缓其生长速度、调节花期和其它目的。据报道脱落酸具有抑制昆虫的性质。参见Visscher的U.S.专利第4,434,180和4,209,530号。粉末形式的脱落酸目前可从一家中国公司Lomon Biotechnology Company，Ltd.购买得到，除其它用途外，该公司将其作为提高某些作物产量和品质的物质上市。

但是，与先有技术脱落酸制剂有关的一个问题是脱落酸在水中的溶解性相对较差：在常温下不超过3克/升或低于0.3％重量溶解。在常温下在纯水中可达到的最高浓度为约3000百万分率(ppm)。脱落酸在硬水中的溶解性更差。虽然脱落酸在一些有机溶剂中溶解性较好，但由于易燃性、毒性或污染原因，脱落酸在有机溶剂中的液体制剂在某些情况下无法被接受。例如，美国加利福尼亚州环境保护局(Environmental Protection Agency of the U.S.state of California)目前要求农产品液体制剂不能包含挥发性有机溶剂，美国其它几个州也有类似的规定。不挥发性有机溶剂具有毒性，因为它们不能蒸发，它们残留在其影响的农产品中并被吸收到目标植株内，具有引起植物毒性并污染食品的可能性，因为所述溶剂的量远远超过活性成分应用的量。此外，甚至在许多有机溶剂中，脱落酸的溶解性也太低以至于没有实用价值。例如，脱落酸在丙二醇中很难溶解，丙二醇为农业制剂中相对需要的溶剂，因为其毒性低且闪点高。

(S)-(+)-脱落酸在有机溶剂中的浓溶液存在的另外的问题是很难通过稀释到水中将其制备成更稀的溶液而不产生一部分胶状形式的(S)-(+)-脱落酸沉淀，所述沉淀只能非常缓慢地再溶解并且十分困难。这实际上非常重要，因为(S)-(+)-脱落酸在农业或园艺学中的主要用途为降低用于移植或销售给消费者的苗圃植株的蒸腾作用，为此目的(S)-(+)-脱落酸通常通过注射系统和自动或手动点样器(applicator)的方式应用。用于这种点样器的溶液必须为比当进行叶喷或浸透(drench)处理时实际到达植株的剂量率浓50-100倍的浓缩液。因此，对于通常应用于苗圃植株的60-600ppm，所述浓缩液中必须包含3000-60,000ppm的(S)-(+)-脱落酸，其可立即并完全与流过胶皮管的水混合，以这种方式，没有形成沉淀堵塞喷嘴的可能性，包含活性成分的水通过所述喷嘴应用于植物或植物的生长介质。如上所释，(S)-(+)-脱落酸在水中的溶解度在常温下不超过3000ppm，因此这样的中间溶液实际上无法在水中制备。(S)-(+)-脱落酸在有机溶剂中的溶液不能用于这样的注射点样器中，因为在与系统中流动的水混合时活性成分会产生沉淀，堵塞喷嘴。由于溶解性的限制，还不可能提供(S)-(+)-脱落酸在有机溶剂中的更高浓度(如10％)的液体制剂，然后在用于制备在水中的中间稀释液时能达到注射点样器(injection applicator)的贮存器所需的3,000-60,000ppm浓度。

在通过通常习惯称为化学灌溉的灌溉系统将(S)-(+)-脱落酸应用于葡萄园、果园或农田时出现了同样的问题。此外，这样的系统需要活性成分在液体溶剂中的浓溶液，这种形式的所述溶液能与流过灌溉系统的水流立即并完全混溶。如果出现任何沉淀，将会堵塞通过其水和溶解的活性成分到达目标植株的喷嘴(又称喷射器)。此外，在这种情况下，由于低水溶性的问题，包含(S)-(+)-脱落酸有机溶液的制剂也不可取。

虽然可用脱落酸粉末制剂，但通常更方便使用浓液体溶液代替粉剂。因此，本领域对包含比其酸本身在水中可溶性更强的(S)-(+)-脱落酸盐的脱落酸制剂具有未满足的需求。

脱落酸比较昂贵。目前仅通过发酵进行商业规模的生产，据此将其制成与营养素和生物碎片混合的稀溶液，因此提取和纯化非常困难。当(S)-(+)-脱落酸应用于植株时，吸收很差，因此需要大大过量使用。通过将其与各种表面活性剂组合，可能改善(S)-(+)-脱落酸的吸收；但是，众所周知，表面活性剂的使用会损伤敏感性植株的叶、花和果实，产生植物毒性并降低价值或破坏作物。因此，本领域对包含(S)-(+)-脱落酸的可增强其生物活性而对其所应用的植株没有损伤可能性的制剂存在着未满足的需求。

发明简述

本发明涉及用高分子量或大立体体积(large steric bulk)的碱金属阳离子制备的S-(+)-脱落酸盐和包含某些增强其生物活性的另外的组分的(S)-(+)-脱落酸的组合物。

在另外的实施方案中，本发明通常涉及包含有效量的用高分子量或大立体体积的碱金属阳离子制备的S-(+)-脱落酸的盐或盐的组合的水性组合物，其中所述(S)-(+)-脱落酸浓度至少为水性组合物的0.5％重量。申请人意外发现用高分子量或大立体体积的碱金属阳离子制备的S-(+)-脱落酸盐可使(S)-(+)-脱落酸的生物性能显著增强，同时也增大了(S)-(+)-脱落酸在水中的溶解性，因此可得到浓缩溶液。因此，可得到浓度高至50％重量的(S)-(+)-脱落酸溶液。本发明发明了便于包装、储存、运输和操作但在使用前必须稀释的(S)-(+)-脱落酸浓缩制剂，尤其是这些制剂的任何中间稀释液可被配制到水中而没有活性成分沉淀的风险。

本发明的组合物通常包含盐、抗微生物剂和任选非植物毒性量的表面活性剂。可任选包含增强(S)-(+)-脱落酸长期储存稳定性或生物活性的其它组分。

本发明的代表性合适的盐包括但不限于铷盐或铯盐、有机季铵盐、胍盐或包含任何数量的这些盐的混合物。在一个实施方案中，所述有机季铵盐为四甲基铵盐。在另一实施方案中，所述有机季铵盐为四丁基铵盐。在另一实施方案中，所述有机季铵盐为胆碱盐。在又另一实施方案中，所述胍盐为四甲基胍盐。这些盐的实例并非为了限制，其它盐也可适用于本发明。一种目前优选的盐为胆碱盐。

本发明还涉及制备包含(S)-(+)-脱落酸盐的水性组合物的方法。在一个实施方案中，本发明涉及制备脱落酸铷盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与化学当量的氢氧化铷、碳酸氢铷或碳酸铷在水溶液中反应。在另一实施方案中，本发明涉及制备铯盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与氢氧化铯、碳酸氢铯或碳酸铯在水溶液中反应。在另一实施方案中，本发明涉及制备四甲基铵盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与化学当量的四甲基氢氧化铵在水溶液中反应。在另一实施方案中，本发明涉及制备四丁基铵盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与化学当量的四丁基氢氧化铵在水溶液中反应。在另一实施方案中，本发明涉及制备胆碱盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与氢氧化胆碱在水溶液中反应。在又另一实施方案中，本发明涉及制备四甲基胍盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与一化学当量的四甲基胍在水中反应。

本发明的另外的实施方案包括包含用高分子量或大立体体积的碱金属阳离子制备的S-(+)-脱落酸盐与有效量的增强(S)-(+)-脱落酸和整个混合物的长期化学稳定性的另一种盐或组分或多种组分的组合的混合物。这样的组分包括但不限于柠檬酸或其水溶性盐的一种、二氧化硫或水溶性重亚硫酸盐或亚硫酸盐。

本发明另外的实施方案包括包含用高分子量或大立体体积的碱金属阳离子制备的S-(+)-脱落酸盐与基本量的增强(S)-(+)-脱落酸生物活性的组分或多种组分的组合的混合物，所述组分包括但不限于碘盐如碘化钾、碘化铷、碘化铯、碘化胆碱或其它碘化季铵、胍类如硫氰酸胍或四甲基碘化胍或表面活性剂。优选的表面活性剂为凝胶形成组分，如Brij家族的成员。

本发明目前优选的实施方案为包含约5-约45重量％的(S)-(+)-脱落酸的铯盐或胆碱盐和约0.1-约0.5重量％山梨酸钾的水性组合物。

本发明的另一目前优选的实施方案为包含约5-约45重量％的(S)-(+)-脱落酸的铯盐或胆碱盐；0-约0.5重量％山梨酸钾；约0.2-约1.0重量％柠檬酸钠；和约0.1-约0.5重量％亚硫酸钠的水性组合物。

除非另有说明，所公开的实施方案为本文公开的本发明概念的示例性实施方案，不应被认为是限制。

发明详述

本发明涉及(S)-(+)-脱落酸盐的水性液体组合物。脱落酸为旋光活性的15-碳羧酸。2-顺式-，4-反式-(S)-(+)-脱落酸的结构式如下：

本发明的液体组合物采用(S)-(+)-对映异构体和碳链的2-顺式-，4-反式-立体化学，而不是对映异构体的外消旋混合物和碳链立体化学的任何其它可能组合。除非另有说明，在所有情况下，当本申请提到脱落酸或(S)-(+)-脱落酸时，其特指2-顺式-，4-反式-(S)-(+)-脱落酸。

在一个方面，本发明涉及处理植物的水性组合物，所述组合物包含有效量的至少一种(S)-(+)-脱落酸与高分子量或大立体体积的碱金属阳离子制备的盐，其中所述盐的浓度至少为0.5％重量的所述盐。

本文所用的所有有关量、重量百分数等的数值都被定义为“约”或“大约”每个特定值，即±10％。例如，短语“至少5％重量”应被理解为“至少4.5％-5.5％重量”。因此，所要求值的10％以内的量都包含在权利要求的范围内。

短语盐的“有效量”是指足以提供所需的生物学或化学作用同时不引起另外的毒性作用的盐的量。根据特定的农业用途、特定的盐等，不同组合物的盐或其它配方组分的“有效”量各不相同。因此，通常不可能指定确切的“有效量”。但是，在任何个别情况下本领域普通技术人员都可采用例行实验来确定适当的“有效量”。

本发明的液体组合物可被制成随时可用的稀释液或可稀释浓缩液。根据本发明，可得到包含0.5％多至50％重量的脱落酸的溶液。可稀释的浓缩液可稀释到水中直接成为终应用浓度或为任何中间稀释液，没有活性成分沉淀的风险。本发明的水性制剂生产成本低，操作和使用安全，且(S)-(+)-脱落酸活性成分在储存和运输条件下稳定。本发明的组合物没有像包含可燃性或易燃性有机溶剂的液体制剂那样的火灾风险。也没有像包含挥发性有机溶剂的制剂那样引起大气污染或烟雾形成的风险。与包含有机溶剂的类似制剂相比，本发明的水性制剂对人或动物的毒性更低。本领域普通技术人员可确定如何制备直接应用于植物的终水溶液浓度，或如何制备用于化学灌溉装置或注射稀释器或类似装置的中间浓度，无需过度实验，没有任何引起活性成分沉淀的机会，且无需使活性成分进入溶液的长时间费力的搅拌。

本发明的水溶液制剂还可任选包含有效量的另外的成分或几种另外的成分以增强(S)-(+)-脱落酸或整个制剂的长期化学稳定性。这样的增强成分包括但不限于柠檬酸或其水溶性盐的一种、二氧化硫或水溶性重亚硫酸盐或亚硫酸盐。使用水作为溶剂可允许有包含任何或几种这些无机组分的组合液体制剂，如果需要，其可包含等于(S)-(+)-脱落酸盐浓度的增强成分的水平或更高。

本发明的水溶液制剂还可任选包含基本量的另外的成分或几种另外的成分以增强(S)-(+)-脱落酸的生物活性。这样的增强成分包括但不限于碘盐如碘化钾、碘化铷、碘化铯、碘化胆碱或四烷基碘化铵，胍盐如硫氰酸胍或四甲基碘化胍，或表面活性剂。水作为溶剂使用使得包含任何或几种这些无机组分或尿素的组合液体制剂可包含等于(S)-(+)-脱落酸盐浓度的增强成分水平或甚至高达10倍于(S)-(+)-脱落酸重量的量或更多。此外，这还提供了优于使用有机溶剂的优势，在有机溶剂中这些无机组分或有机盐溶解性很差。

另外，本发明的水溶液制剂还可任选包含基本量的表面活性剂，其重量等于(S)-(+)-脱落酸盐的含量或甚至高出几倍。可包含在本发明组合物中的表面活性剂的实例包括但不限于聚氧乙烯脂肪醇醚的Brij家族的产品(得自Uniquema，Castle DE)、聚氧乙烯去水山梨醇酯的吐温家族的产品(得自Uniquema，Castle DE)、有机硅的Silwet家族的产品(得自Union Carbide，Lisle IL)、烷基酚乙氧基化物的Triton家族的产品(得自Dow Chemical Company，Midland MI)、乙氧基化线性醇的Tomadol家族的产品(得自Tomah3 Products，Inc.，Milton WI)、聚氧乙烯脂肪酸酯的Myrj家族的产品(得自Uniquema Castle DE)、乙氧基化山梨醇和乙氧基化山梨醇酯的Trylox家族的产品(得自Cognis Corporation，Cincinnati OH)或Latron B-1956的任何特定市售产品(得自Rohm & Haas，Philadelphia PA)、Capsil(得自Aquatrols，Paulsboro NJ)、Agral 90(得自Norac Concepts，Inc.，Orleans ON，Canada)、Kinetic(得自Setre，Memphis TN)或Regulaid(得自KALO，Overland Park KS)。目前优选的表面活性剂为Brij或吐温家族的表面活性剂。包含在本发明组合物中的最优选的表面活性剂为Brij 98、Brij 78、吐温20和吐温40。本发明组合物中的表面活性剂的浓度范围可为约0.02％高至约40％重量。本发明组合物中表面活性剂浓度的优选范围为约0.1％-30％重量。本发明组合物表面活性剂浓度的最优选范围为约0.25％-约25％重量。所述表面活性剂可与任何一种或多种无机盐或尿素活性增强成分一起包含在本发明的组合物中或不包含其中任何一种。

终端用户可为了各种目的将本发明的组合物应用于植株，如提高应激耐受力、降低其对水的利用、减缓其生长速度、调节花期、用于种子处理、防止采前落果和落花，以及提高果实的品质和色泽。可能的应用还可包括，如，(S)-(+)-脱落酸的各种浓溶液的分配和销售。在运输和操作中采用这样的高浓度可使用水体积减少，因此可简化运输和操作程序并降低成本。然后终端用户可将产品稀释至1％浓度(或根据终端用户的需要稀释为其它百分比)，装入用于喷雾或浸透(drench)的混合装置的供给贮存器，应用于准备运输的观赏花坛植物。或者，另一终端用户可在适当时间配制稀溶液注入葡萄园滴灌系统，以提高酿酒葡萄或鲜食葡萄的色泽或酚含量。

本发明代表性的合适的盐包括但不限于铷或铯盐、有机季铵盐、胍盐或包含任何数量的这些盐的混合物。在一个实施方案中，所述有机季铵盐为四甲基铵盐。在另一实施方案中，所述有机季铵盐为四丁基铵盐。在另一实施方案中，所述有机季铵盐为胆碱盐。在又另一实施方案中，所述胍盐为四甲基胍盐。盐的这些实例并非为了限制，其它盐也可适用于本发明。目前优选的一种盐为胆碱盐。

可用于本发明组合物的有效盐的有机季铵化合物为那些包含可形成R₁R₂R₃R₄N⁺的季铵阳离子的有机季铵化合物，其中R₁、R₂、R₃和R₄独立为直链或支链排列的1-6个碳原子低级烷基、烯基或炔基，包含或连在一起形成0或1个环结构，并带有0、1或2个卤素或羟基，且其中一个或多个R基团可带有苯基取代基。

在一个实施方案中，本发明涉及制备脱落酸铷盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与化学当量的氢氧化铷、碳酸氢铷或碳酸铷在水溶液中反应。在另一实施方案中，本发明涉及制备铯盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与氢氧化铯、碳酸氢铯或碳酸铯在水溶液中反应。在另一实施方案中，本发明涉及制备四甲基铵盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与化学当量的四甲基氢氧化铵在水溶液中反应。在另一实施方案中，本发明涉及制备四丁基铵盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与化学当量的四丁基氢氧化铵在水溶液中反应。在另一实施方案中，本发明涉及制备胆碱盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与氢氧化胆碱在水溶液中反应。在又另一实施方案中，本发明涉及制备四甲基胍盐的方法，所述方法包括将(S)-(+)-脱落酸与一化学当量的四甲基胍在水中反应。

在优选的实施方案中，当制备(S)-(+)-脱落酸盐时，将至少约 0.25％重量的Tween-20，清洁剂聚山梨酯，加入到反应混合物和所得制剂中。

在另一优选的实施方案中，所述水溶液包含抗微生物剂以防止在长期储存过程中微生物生长。目前最优选的抗微生物剂为山梨酸钾。当本发明的(S)-(+)-脱落酸盐水溶液用于长期储存或用于分配和销售给用户时，优选掺入抗微生物剂的浓度范围为约0.01％-约1.0％重量。

在另一优选的实施方案中，所述水溶液包含防止在长期储存过程中不需要的显色或沉淀出现的试剂。目前用于此目的的最优选的试剂为柠檬酸钠或钾或亚硫酸或重亚硫酸钠或钾。

在优选的实施方案中，浓缩的本发明组合物和从浓缩液配制的在最终使用稀释的任何水溶液的pH都约为中性(近似pH 7)。

本发明优选的组合物包含0.5-50重量％的盐形式的(S)-(+)-脱落酸，0.01-1.0重量％的抗微生物剂，任选约0.01-约5重量％的稳定增强剂，任选0.25-35重量％的表面活性剂，任选约1-约50重量％的另一活性增强组分，余量为水。

下面的实施例旨在示例本发明并指导本领域普通技术人员如何制备和使用本发明。它们并非为了以任何方式限制本发明或其保护范围。

实施例

实施例1

包含(S)-(+)-脱落酸铷盐的水溶液组合物的制备

将吐温20(25mg)、柠檬酸三钠二水合物(125mg)和焦亚硫酸钠(62.5mg)溶于10mL去离子水中。加入(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)，搅拌混合物直至得到均匀混悬液。将所得溶液用50％的氢氧化铷水溶液滴定至终pH6.8，用pH计监控，得到澄清无色溶液。然后将该溶液用去离子水稀释至总重量为25g，储存于棕色瓶中。

如此制备包含10.0％重量的(S)-(+)-脱落酸的铷盐还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

实施例2

包含(S)-(+)-脱落酸铯盐的水溶液组合物的制备

将吐温20(25mg)、柠檬酸三钠二水合物(164mg)和焦亚硫酸钠(62.5mg)溶于10mL去离子水中。加入(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)，搅拌混合物直至得到均匀混悬液。在良好搅拌下逐滴加入氢氧化铯的50％水溶液直至所有脱落酸都进入溶液。终pH为6.96。将该溶液用去离子水配制为25.0g总重量，储存于棕色瓶中。

如此制备包含10.0％重量的脱落酸的铯盐还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

实施例3

包含(S)-(+)-脱落酸四甲基铵盐的水溶液组合物的制备

将(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)悬浮于溶有25mg吐温20、125mg柠檬酸三钠二水合物和62.5mg焦亚硫酸钠的10mL去离子水中。将混合物用1.0摩尔的四甲基氢氧化铵水溶液滴定至中性(pH 7.0)，得到澄清无色溶液。将该溶液用去离子水配制为总重量25.0g，储存于棕色瓶中。

如此制备包含10.0％重量的脱落酸的四甲基铵盐还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

实施例4

包含(S)-(+)-脱落酸四丁铵盐的水溶液组合物的制备

将(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)悬浮于溶有25mg吐温20、142mg柠檬酸三钠二水合物和62.5mg焦亚硫酸钠的15mL去离子水中。加入四丁基氢氧化铵的40％水溶液(约6.5mL)，混合物机械搅拌直至所有脱落酸溶解。终pH为约8.0。将该溶液用去离子水配制为终总重量31.25g，储存于棕色瓶中。

如此制备包含8.0％重量的脱落酸的四丁铵盐还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

实施例5

包含(S)-(+)-脱落酸胆碱盐的水溶液组合物的制备

将吐温20(25mg)、柠檬酸三钠二水合物(125mg)和焦亚硫酸钠(62.5mg)溶于10mL去离子水中。加入(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)，搅拌混合物直至得到均匀混悬液。将混合物滴定至pH 6.9，，用pH计监控，得到澄清无色溶液。然后将该溶液用去离子水稀释至总重量25g，储存于棕色瓶中。

如此制备包含10.0％重量的(S)-(+)-脱落酸的胆碱盐还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

实施例6

包含(S)-(+)-脱落酸四甲基胍盐的水溶液组合物的制备

将吐温20(25mg)、柠檬酸三钠二水合物(164mg)和焦亚硫酸钠(62.5mg)溶于10mL去离子水中。加入(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)，搅拌混合物直至得到均匀混悬液。在良好搅拌下逐滴加入四甲基胍(约1.15g)，用pH计帮助监控最终几滴的加入。当所有脱落酸溶解时的终pH为6.9。将该溶液用去离子水配制为终总重量25.0g，储存于棕色瓶中。

如此制备包含10.0％重量的脱落酸的四甲基胍盐还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

实施例7

包含(S)-(+)-脱落酸铵盐并包含碘化钾作为性能增强添加剂的水溶液组合物的制备

将吐温20(25mg)、柠檬酸三钠二水合物(164mg)和焦亚硫酸钠(62.5mg)溶于10mL去离子水中。加入(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)，搅拌混合物直至得到均匀混悬液。逐滴加入市售浓氨水溶液直至几乎所有固体脱落酸溶解。加入碘化钾(1.66g，1.0摩尔当量)，搅拌混合物使其溶解。加入少量稀氨水溶液调节溶液的pH至6.5，用去离子水配制为总重量25.0g。

如此制备包含10.0％重量的脱落酸的铵盐，包含1当量碘化钾，还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

实施例8

包含(S)-(+)-脱落酸铵盐还包含碘化铵作为性能增强添加剂的水溶液组合物的制备

将吐温20(25mg)、柠檬酸三钠二水合物(164mg)和焦亚硫酸钠(62.5mg)溶于10mL去离子水中。加入市售浓氢碘酸(1.28g，10毫摩尔)。加入(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％，10毫摩尔)，搅拌混合物直至得到均匀混悬液。将混合物用浓氨水滴定至pH 7.45，产生澄清溶液。加入去离子水将该溶液配制为总重量25.0g，储存于棕色瓶中。

如此制备包含10.0％重量的脱落酸的铵盐，包含一当量碘化铵，还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

实施例9

包含(S)-(+)-脱落酸铵盐还包含碘化胆碱作为性能增强添加剂的水溶液组合物的制备

将吐温20(25mg)、柠檬酸三钠二水合物(164mg)和焦亚硫酸钠(62.5mg)溶于8mL去离子水中。加入(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)，搅拌混合物直至得到均匀混悬液。逐滴加入市售浓氨水溶液直至几乎所有固体脱落酸溶解。加入碘化胆碱(2.31g，1.0摩尔当量)，搅拌混合物使其溶解。加入少量稀氨水溶液调节溶液的pH至6.8，用去离子水配制为总重量25g。

如此制备包含10.0％重量的脱落酸的铵盐，包含一当量碘化胆碱，还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

实施例10

包含(S)-(+)-脱落酸铵盐还包含硫氰酸胍作为性能增强添加剂的水溶液组合物的制备

将吐温20(25mg)、柠檬酸三钠二水合物(142mg)和焦亚硫酸钠 (62.5mg)溶于10mL去离子水中。加入(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％，10毫摩尔)，搅拌混合物直至得到均匀混悬液。逐滴加入市售浓氨水溶液直至几乎所有固体脱落酸溶解，剩余的固体通过用浓氨水的1+9稀释液滴定至pH 6.5进入溶液。加入硫氰酸胍(1.18g，10毫摩尔)，搅拌溶液使其溶解。将混合物转移到去了皮重的棕色瓶中，用去离子水配制为总重量25g。

如此制备包含10.0％重量的脱落酸的铵盐，包含一当量硫氰酸胍作为性能增强添加剂，还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

比较实施例11

包含(S)-(+)-脱落酸铵盐还包含山梨酸钾、柠檬酸三钠和亚硫酸钠的水溶液组合物的制备

用水(1609g)配制包含2.0g吐温20、5.0g山梨酸钾、5.0g亚硫酸钠和10g柠檬酸三钠的溶液。加入110g的(S)-(+)-脱落酸(95％纯度)，然后加入20.7g浓氨水使大部分脱落酸溶解。再加入101g(S)-(+)-脱落酸和21.6g浓氨水，再使大部分脱落酸溶解。再小心加入6.8g氨水溶液使所有固体进入溶液。加入水使总批重量为2000g，将该溶液通过500-目筛。终pH为6.62。

如此制备包含10％重量的(S)-(+)-脱落酸的铵盐还包含0.25％重量的山梨酸钾、0.25％重量的亚硫酸钠和0.5％重量的柠檬酸三钠作为稳定增强添加剂的水溶液组合物。

比较实施例12

包含(S)-(+)-脱落酸钾盐还包含山梨酸钾、焦亚硫酸钠和柠檬酸三钠的水溶液组合物的制备

将25mg吐温20、125mg柠檬酸三钠二水合物和62.5mg焦亚硫酸钠的10mL去离子水溶液与2.64g纯度95％的(S)-(+)-脱落酸一起搅拌，直至所有粉末悬浮。将混合物用3M KOH滴定至pH6.87，所有固体溶解。然后将溶液用适量去离子水稀释配制为25g 总重量，储存于棕色瓶中。

如此制备包含10.0％重量的(S)-(+)-脱落酸的钾盐还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的组合物。

比较实施例13

包含(S)-(+)-脱落酸三甲基胺盐还包含山梨酸钾的水溶液组合物的制备

将(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)悬浮于包含50mg吐温20的15mL去离子水中。加入三甲基胺水溶液(1.5mL，6.6M浓度)，其使大部分脱落酸溶解。然后小心滴加三甲基胺水溶液进行剩余的中和，得到pH 6.8的澄清溶液。加入防腐剂(63mg山梨酸钾)，其快速溶解。用去离子水配制终体积为25mL的溶液，得到10％水性组合物重量的(S)-(+)-脱落酸的三甲胺盐。

比较实施例14

包含(S)-(+)-脱落酸三丁胺盐的水溶液组合物的制备

将吐温20(25mg)、柠檬酸三钠二水合物(164mg)和焦亚硫酸钠(62.5mg)溶于10mL去离子水中。加入(S)-(+)-脱落酸(2.64g，纯度95％)，将混合物搅拌约20分钟直至得到均匀混悬液。加入大部分计算量的三丁胺，得到胶状物，其仅缓慢溶解，且仅在加入更多水时溶解。持续搅拌后，得到均匀溶液，将其用剩余化学计算量的三丁胺滴定至pH 6.5。将混合物转移到去了皮重的棕色瓶中，配制为总重量50g，得到含5％重量的(S)-(+)-脱落酸的三丁胺盐还包含柠檬酸钠和亚硫酸氢钠作为稳定增强添加剂的溶液。

用于实施例处理研究的植株样本按以下方法制备。将番茄(品种：Rutgers)种子播种于填充有Promix PGX(得自Premier Horticulture Inc.，Quakertown PA)的18-单元平地(18-cell flat)中种植3周，使其发芽并开始生长。然后将植株转移至填充有Promix BX(得自Premier Horticulture Inc.，Quakertown PA)的盆(直径18cm，高18cm)中，根据温度和有效光照在处理前再种植一或两周。对植株每日浇灌，每周施肥(1g/L通用肥20-20-20，得自The Scotts Company，Marysville，OH)。

所有处理溶液均用蒸馏水配制。(S)-(+)-脱落酸(95％活性成分)得自Lomon BioTechnology Co.，Ltd.(中国四川)。在上面的实施例11中制备的先有技术的(S)-(+)-脱落酸铵盐的水溶液组合物用作大多数研究的阳性处理对照。

所有实验采取随机完全区组实验设计而进行。(S)-(+)-脱落酸溶液和空白处理(净水)通过喷雾以24mL/6植株的速度应用于番茄植株的地上部分。然后将植株置于湿度控制在相对湿度范围为40-60％的透明室中。在处理后的1、2、3、4和7天测定叶蒸腾速度。测定采用LI-1600 Steady State Porometer(LI-Cor，Lincoln，NE)进行。每天将每个处理组植株的蒸腾速度标准化为未处理植株(只喷水的植株)蒸腾速度的百分数，以便控制由环境条件如光强度和温度的变化引起的植株状态的每日变异。将每个植株三天期间的数据加以平均以平衡(S)-(+)-脱落酸对番茄叶蒸腾作用的短期和长期影响并降低实验变异。重要的是要注意用本发明组合物处理的任何植株都未观察到植物毒性。

对于受试的每种盐，相对蒸腾速度和(S)-(+)-脱落酸盐浓度的以10为底的对数之间的关系都是线性的。计算了每种(S)-(+)-脱落酸盐的回归方程和50％蒸腾抑制作用的脱落酸浓度。两种ABA盐的相对功效为每种组合物达到50％蒸腾抑制作用所需的(S)-(+)-脱落酸浓度比率的倒数。

实施例15

本发明实施例1的铷盐组合物的相对功效因此是比较实施例的铵盐组合物的2.4倍，非常实质性地增强了生物活性。

在此实验中，还在实验最后和应用处理后7天测定了番茄植株地上部分的鲜重，以评价所述组合物的相对生长抑制活性。表3中显示了结果。

表3中的数据表明，虽然比较实施例11的(S)-(+)-脱落酸铵盐组合物能以剂量依赖型方式延缓番茄植株的生长，但是本发明的(S)-(+)-脱落酸铷盐可明显更有效地以剂量依赖型方式延缓所述生长且不产生植物毒性。在喷雾溶液中加入表面活性剂甚至能进一步增强效果，在此浓度仍没有植物毒性的迹象。

实施例16

本发明实施例2的铯盐组合物的相对功效因此是比较实施例11的铵盐组合物的3.2倍，非常实质性地增强了生物活性。

在此实验中，还测定了实验最后和应用处理后7天的番茄植株地上部分的鲜重，以评价所述组合物的相对生长抑制活性。表6中显示了结果。

表3中的数据表明，虽然比较实施例11的(S)-(+)-脱落酸铵盐组合物能以剂量依赖型方式延缓番茄植株的生长，但实施例2的(S)-(+)-脱落酸铯盐可明显实质上更有效地以剂量依赖型方式延缓所述生长且不产生植物毒性。在喷雾溶液中加入表面活性剂甚至可进一步增强效果，在此浓度仍没有植物毒性的迹象。

比较实施例17

先有技术比较实施例12的钾盐组合物的相对功效因此是比较实施例11的铵盐组合物的0.98倍，可忽略生物活性差异。

表7和8中的数据明确显示比较实施例11的铵盐制剂和比较实施例12的钾盐制剂的生物活性之间没有本质差异。因此，特别令人惊讶的是，如上面的实施例15和16所示，本发明实施例1的铷盐制剂和实施例2的铯盐制剂比比较实施例11的铵盐制剂具有非常实质性的增强的生物活性，既然钾、铷和铯都为碱金属，是元素周期表中的相邻成员。

实施例18

本发明实施例2的四丁基铵盐组合物的相对功效因此是比较实施例11的铵盐组合物的2.8倍，非常实质性地增强了生物活性。

实施例19

本发明实施例4的四丁基铵盐组合物的相对功效因此是比较实施例14的三丁胺盐组合物的1.9倍，在生物活性上有本质差异。这尤其令人惊讶，因为两种阳离子都由氮组成并带有相同类型的烷基，仅在丁基的数量上有所不同。

在此实验中，还在实验最后和应用处理后7天测定了番茄植株地上部分的鲜重，以评价所述组合物的相对生长抑制活性。表13中显示了结果。

表13中的数据表明，虽然比较实施例14的(S)-(+)-脱落酸三丁胺盐组合物能以剂量依赖型方式延缓番茄植株的生长，但本发明实施例4的(S)-(+)-脱落酸四丁铵盐能明显实质上更有效地以剂量依赖型方式延缓所述生长且不产生植物毒性。

实施例20

表14和15中列出的数据显示本发明实施例3的四甲基铵盐组合物的相对功效因此是比较实施例13的三甲胺盐组合物的4.6倍，非常实质性地增强了生物活性。这尤其令人惊讶，因为两种阳离子都由氮组成并带有相同类型的烷基，仅在甲基的数量上有所不同，即3个对4个。

实施例21

本发明实施例5的胆碱盐组合物的相对功效因此是比较实施例11的铵盐组合物的2.6倍，非常实质性地增强了生物活性。

在此实验中，还在实验最后、应用处理后7天测定了番茄植株地上部分的鲜重，以评价所述组合物的相对生长抑制活性。表18中显示了结果。

表18的数据表明岁然比较实施例11的(S)-(+)-脱落酸铵盐组合物能以剂量依赖型方式延缓番茄植株的生长，但本发明实施例5的(S)-(+)-脱落酸胆碱盐明显实质上更有效地以剂量依赖型方式延缓所述生长。在喷雾溶液中加入表面活性剂甚至能进一步增强效果，在此浓度仍没有植物毒性迹象。

实施例22

本发明实施例5的四甲基胍盐组合物的相对功效因此是比较实施例11的铵盐组合物的4.2倍，非常实质性地增强了生物活性。

实施例23

本发明实施例7的组合物的相对功效因此是比较实施例11的2.3倍，非常实质性地增强了生物活性。

在此实验中，还在实验最后、应用处理后7天测定了番茄植株地上部分的鲜重，以评价所述组合物的相对生长抑制活性。表23中显示了结果。

表23中的数据表明虽然比较实施例11的(S)-(+)-脱落酸铵盐组合物能以剂量依赖型方式延缓番茄植株的生长，但本发明实施例7的(S)-(+)-脱落酸组合物明显能更有效地以剂量依赖型方式延缓所述生长。在喷雾溶液中加入表面活性剂甚至可进一步增强效果，在此浓度仍没有植物毒性迹象。

实施例24

本发明实施例8的组合物的相对功效因此是比较实施例11的铵盐组合物的1.6倍，实质性地增强了生物活性。

实施例25

表27和28中的数据显示本发明实施例9的组合物的相对功效因此是比较实施例11的铵盐组合物的1.8倍，实质性地增强了生物活性。

在此实验中，还在实验最后和应用处理后7天测定了番茄植株地上部分的鲜重及其高度，以评价所述组合物的相对生长抑制活性。表28中显示了结果。

表28中的数据表明，虽然比较实施例11的(S)-(+)-脱落酸铵盐组合物能以剂量依赖型方式延缓番茄植株的生长，如对其高度和重量的测定，但本发明实施例9的(S)-(+)-脱落酸组合物明显能更有效地以剂量依赖性方式延缓所述生长，且不产生植物毒性。在喷雾溶液中加入表面活性剂甚至可进一步增强效果，在此浓度仍没有植物毒性迹象。

实施例26

本发明实施例10的组合物的相对功效因此是比较实施例11的铵盐组合物的1.9倍，实质性地增强了生物活性。

在此实验中，还在实验最后、应用处理后7天测定了番茄植株地上部分的鲜重，以评价所述组合物的相对生长抑制活性。表31中显示了结果。

表31中的数据表明，虽然比较实施例11的(S)-(+)-脱落酸铵盐组合物能以剂量依赖型方式延缓番茄植株的生长，如对其高度和重量的测定，但本发明实施例10的(S)-(+)-脱落酸组合物明显能更有效地以剂量依赖型方式延缓所述生长，且不产生植物毒性。在喷雾溶液中加入表面活性剂甚至可进一步增强效果，在此浓度仍没有植物毒性迹象。

实施例27

在此实验中，剂量率增加的碘化胆碱和保持固定剂量率的实施例11的铵盐一起应用，以研究这种本发明的性能增强添加剂的剂量响应。表32中显示了结果。

注意，在没有(S)-(+)-脱落酸时，无论是碘化胆碱本身还是碘化胆碱加上Brij 98，都对蒸腾作用的速度没有实质性影响(表32最后两行)。

实施例28

在此实验中，保持固定剂量率的实施例6的四甲基胍盐组合物与剂量率增加的碘化胆碱一起应用，以研究这种本发明的性能增强添加剂的剂量响应。同一组剂量还同样加入Brij 98一起应用。表33中显示了结果。

表33中的数据表明，本发明(S)-(+)-脱落酸盐的增强性能可通过加入一种本发明的性能增强添加剂进一步增强，通过再加入表面活性剂再进一步增强。在任何处理中均未观察到植物毒性。

在此实验中，还在实验最后、应用处理后7天测定了番茄植株地上部分的鲜重，以评价所述组合物的相对生长抑制活性。表34中显示了结果。

表34中的数据表明，通过加入本发明的一种性能增强添加剂碘化胆碱，对本发明实施例6的组合物形式的(S)-(+)-脱落酸的生长抑制作用具有剂量依赖型增强作用。因此，可同时采用本发明的两个方面以进一步增强所述有效性。另外加入表面活性剂更加增强所述效果。

实施例29

在此实验中，保持固定剂量率的实施例6的四甲基胍盐组合物与剂量率增加的碘化铯一起应用，以研究这种本发明的性能增强添加剂的剂量响应。高剂量的碘化铯还与高剂量率的第二种本发明性能增强添加剂碘化胆碱一起应用。表35中显示了结果。

同样，在此实验中，在实验最后和应用处理后7天对番茄植株地上部分的鲜重及其高度进行测定，以评价所述组合物的相对生长抑制活性。表36中显示了结果。

表35和36中的数据清楚地显示了本发明实施例6的四甲基胍盐组合物对(S)-(+)-脱落酸功效的增强作用，和由加入本发明的一种性能增强添加剂碘化铯以剂量依赖型方式引起的另外的增强作用。最后，表35和36的最后一行显示由在与本发明的性能增强盐的单个组合物中加入两种本发明的性能增强添加剂而达到的进一步增强作用。在任何处理中均未观察到植物毒性。

实施例30

在此实验中，保持固定剂量率的先有技术的实施例11的铵盐组合物与剂量率增加的碘化钾一起应用，以研究本发明的这些性能增强添加剂的剂量响应。同一组剂量还同样加入Brij 98一起应用。结果如表37所示。

表37中的数据表明本发明的性能增强添加剂碘化钾的确可增强脱落酸的蒸腾抑制作用；但是剂量与作用的关系不是线性的。

实施例31

在此实验中，保持固定剂量率的先有技术的实施例11的铵盐组合物与剂量率增加的硝酸铯或碘化锂一起应用，以研究本发明的这些性能增强添加剂的剂量响应。每个性能增强添加剂的最低剂量率还加入Brij 98一起应用。结果如表38所示。

表38中的数据清楚地表明，本发明的性能增强添加剂硝酸铯或碘化锂的确以剂量依赖型方式相当实质性地增加了脱落酸的蒸腾抑制作用。该作用通过加入表面活性剂而增强，通过盐添加剂而产生的增强作用比通过表面活性剂而产生的增强作业更持久。

因此，我们惊奇地发现，当应用于植物时，本发明的(S)-(+)-脱落酸盐组合物比先有技术的脱落酸盐组合物实质上更有效，同时还保持低植物毒性。

Claims

1.一种用R₁R₂R₃R₄N⁺形式的季铵阳离子制备的(S)-(+)-脱落酸的盐或盐的混合物，其中R₁、R₂、R₃和R₄独立为以直链或支链排列的1-6个碳原子的低级烷基、烯基或炔基，并包含或连接在一起形成0-1个环结构，并带有0、1或2个卤素或羟基，且其中R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或多个可带有苯基取代基。

2.权利要求1的盐，其中所述盐为四甲基铵盐。

3.权利要求1的盐，其中所述盐为四乙基铵盐。

4.权利要求1的盐，其中所述盐为四丙基铵盐。

5.权利要求1的盐，其中所述盐为四丁基铵盐。

6.权利要求1的盐，其中所述盐为胆碱盐。

7.权利要求1的盐，其中所述盐为二甲基哌啶鎓盐。

8.权利要求1的盐，其中所述盐为氯乙基三甲基铵盐。