CN102161986B - 基质金属蛋白酶13的纯化与复性方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基质金属蛋白酶13的纯化与复性方法，首先进行重组大肠杆菌的发酵与目标蛋白的诱导表达，然后进行破菌，包涵体洗涤、溶解得到含有基质金属蛋白酶13的抽提液，对此抽提液使用Ni2+-亲和色谱进行纯化，然后使用DEAE阴离子交换色谱或Desalting尺寸排阻色谱进行复性。本发明操作简单，耗时短，每升发酵液能够得到更多的活性蛋白，降低了生产成本，MMP-13售价从目前120元/μg降低到8～10元/μg。

Description

基质金属蛋白酶13的纯化与复性方法
技术领域
本发明涉及一种重组基质金属蛋白酶的色谱纯化与复性方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
近年来，癌症已经成为影响人类健康的重要原因之一，基质金属蛋白酶在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着重要作用，也受到了越来越多的关注。MMPs是由多种锌离子依赖性酶组成的能降解细胞外基质蛋白的重要酶类，几乎能降解细胞基质的所有成分（胶原、明胶、粘性蛋白、纤维粘连蛋白、蛋白多糖等）。MMPs除了在肿瘤的生长、浸润、转移、肿瘤血管新生和细胞凋亡中的关键作用外，还在关节炎、神经退性性疾病、心血管疾病和各类炎症在内的多种疾病中有明显的异常表达，基质金属蛋白酶已成为多种疾病治疗的靶点。因此，我们需要大量的蛋白来做为这些研究的支持材料。
体外表达体系已经成为获取蛋白的主要方法之一，大肠杆菌作为体外表达宿主细胞已被普遍应用。用大肠杆菌表达真核生物蛋白具有高水平表达的优点，但由于原核细胞缺乏真核生物蛋白表达所必须的修饰机制，因此高水平表达的蛋白在菌体内是以不可溶的包涵体形式存在。要得到具有生物活性的蛋白，需要对包涵体蛋白进行体外复性。
目前对重组蛋白进行体外复性的方法有稀释复性、透析复性、超滤复性、高蛋白浓度下的复性、柱上复性等。稀释复性是直接接入水或缓冲液降低变性剂的浓度，放置过夜，这种方法的缺点是体积增加较大，变性剂稀释太快，不易控制；透析复性是目前对MMPs复性的主要方法，好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，但在此过程中易形成无活性蛋白质聚集体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模；超滤复性在生产中较多的被使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。而柱上复性以其回收率高、快速、易放大、样品稀释倍数小，大大降低了复性蛋白的成本等优点得到了广泛的应用。
基质金属蛋白酶是一种蛋白水解酶，有活性的蛋白具有自降解作用，很难在体外得到大量的活性蛋白，因此市场上基质金属蛋白酶的售价都很高，例如MMP-1售价为100元/μg，MMP-7售价为140元/μg，MMP-9售价为140元/μg，MMP-13售价为120元/μg。
发明内容
本发明目的是提供一种重组基质金属蛋白酶13的色谱纯化与复性方法，该方法使每升发酵液能够得到更多的活性蛋白，降低了成本。
本发明实现过程如下：
一种基质金属蛋白酶13的纯化与复性方法，包括下述步骤：首先进行重组大肠杆菌的发酵与目标蛋白的诱导表达，然后进行破菌，包涵体洗涤、溶解得到含有基质金属蛋白酶13的抽提液，对此抽提液使用Ni2+-亲和色谱进行纯化，然后使用DEAE阴离子交换色谱或Desalting尺寸排阻色谱进行复性。
DEAE阴离子交换色谱复性的色谱条件是：结合缓冲液为20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，0～8M尿素，pH为6.0～9.0；洗脱液为20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，0.2～1.0M NaCl，pH为6.0～9.0；流速为0.2～2.0mL/min，最好为0.8～1.2mL/min，洗脱方式为10～40min从100%A液到100%B液梯度洗脱。
阴离子交换色谱复性的色谱条件是：结合缓冲液为20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，5M尿素，pH为8.0；洗脱液为20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，1M NaCl，pH为7.0；流速为1.0mL/min；洗脱方式为20min从100%A液到100%B液梯度洗脱。
Desalting尺寸排阻色谱复性的色谱条件是：缓冲液为20 mM Tris-HCl，pH 7.0，流速为0.8mL/min。
通过Ni2+亲和色谱的纯化，MMPs的纯度能达到90%以上，质量回收率为75.61%，达到了纯化的目的，然后分别用阴离子色谱和尺寸排阻色谱分别对纯化后的蛋白进行复性，用阴离子色谱对蛋白复性的回收率为84.90%，蛋白活性为1.168×105mF.U./mn；用尺寸排阻色谱对蛋白复性回收率为30.2%，蛋白活性为0.992×105mF.U./mn，两种方法均能得到活性蛋白，1L菌液能得到约8.4mg活性蛋白。
本发明操作简单，耗时段，每升发酵液能够得到更多的活性蛋白，降低了生产成本，MMP-13售价从目前120元/μg降低到8～10元/μg。
附图说明
图1平衡缓冲液咪唑浓度对蛋白质量回收率的影响；
图2上样量对蛋白质量回收率的影响；
图3 流速对蛋白质量回收率的影响；
图4 Ni2+-亲和色谱纯化图，1：穿透含杂蛋白峰； 2：MMP-13蛋白峰；
图5 纯化蛋白SDS-PAGE电泳图，1：未加IPTG诱导菌体；2：加IPTG诱导菌体；3：加IPTG诱导得到的蛋白抽提液；4：纯化蛋白穿透峰；5：纯化蛋白目标峰；
图6上样量对蛋白复性的影响；
图7 流速对蛋白复性的影响；
图8 洗脱梯度长度对蛋白复性的影响；
图9  pH对蛋白复性的影响；
图10  MMP-13阴离子色谱复性图，1：穿透蛋白峰；2：复性蛋白峰；
图11阴离子色谱复性蛋白SDS-PAGE电泳图；1：阴离子色谱复性蛋白峰； 2：加IPTG诱导得到的蛋白抽提液；3：纯化蛋白目标峰；
图12 MMP-13尺寸排阻色谱复性图，1：MMP-13蛋白峰；2：盐峰；
图13尺寸排阻色谱复性蛋白电泳图，1：未加IPTG诱导蛋白；2：加IPTG诱导蛋白3：加IPTG诱导得到的蛋白抽提液；4：纯化蛋白目标峰；5：尺寸排阻色谱复性蛋白峰。
具体实施方式
实施例1：蛋白纯化
首先进行重组菌的发酵与目标蛋白的诱导表达，然后进行破菌，包涵体洗涤，包涵体溶解之后得到目标蛋白的抽提液，再用Ni2+亲和色谱进行蛋白的纯化。
Ni2+亲和色谱对MMP-13纯化条件的优化：首先对平衡缓冲液咪唑浓度、蛋白上样量、洗脱流速这些色谱纯化条件进行优化，结果如图1～3所示。
通过以上实验结果，选择平衡缓冲液为20mM咪唑，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，8M尿素；洗脱液为100mM 咪唑，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，8M尿素，pH均为7.5；先用平衡缓冲液平衡色谱柱至基线平稳后进样，继续用平衡缓冲液以1.0mL/min的速度冲洗至基线平稳，然后换洗脱液以1.0mL/min的速度洗脱结合在柱子上的蛋白，收集各峰用考蓝法和SDS-PAGE电泳分别测其蛋白浓度和纯度，从图4、5可见，纯化蛋白的纯度达到90%以上，质量回收率为75.61%。
实施例2：阴离子色谱复性蛋白
使用DEAE阴子交换色谱对MMP-13进行复性，同样我们也对复性条件进行了优化，包括上样量、流速、洗脱梯度长度、pH，结果如图6～9所示。
根据以上实验结果，选择最优条件结合缓冲液为20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，5M尿素，pH为8.0；洗脱液为20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，1M NaCl，pH为7.0；先用结合缓冲液平衡色谱柱至基线平稳后进样，继续用结合缓冲液以1.0mL/min的速度冲洗至基线平稳，然后换洗脱液以1.0ml/min的速度梯度洗脱，在20min内，使洗脱液由0%上升到100%，收集各峰用考蓝法和SDS-PAGE电泳分别测其蛋白浓度和纯度，从图10、11可见，得到的活性蛋白的回收率为84.90%，蛋白活性为1.168×105mF.U./mn（阳性对照MMP-15活性为1.209×105mF.U./mn），计算其成本约为10元/μg。
实施例3：与实施例2类似，不同的是流速分别为0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、2.0mL/min，蛋白活性分别为1.163、1.142、1.137、0.168、0.197、0.209×105mF.U./mn。
实施例:4：尺寸排阻色谱复性蛋白
使用Desalting尺寸排阻色谱法对MMP-13进行复性，使用的平衡缓冲液为20mM Ttis-HCl，pH为7.5，先用平衡缓冲液平衡色谱柱至基线平稳后进样，继续用平衡缓冲液以1.0mL/min的速度冲洗至基线平稳，收集各峰用考蓝法和SDS-PAGE电泳分别测其蛋白浓度和纯度，从图12、13可见，得到活性蛋白的回收率为30.2%，蛋白活性为0.992×105mF.U./mn（阳性对照MMP-15活性为1.209×105mF.U./mn），成本约为8元/μg。
实施例5：疏水色谱复性蛋白
使用Phenyl疏水色谱复性MMP-13蛋白，不能形成复性峰。

Claims (1)

1.基质金属蛋白酶13的纯化与复性方法，其特征在于：首先进行重组大肠杆菌的发酵与目标蛋白的诱导表达，然后进行破菌，包涵体洗涤、溶解得到含有基质金属蛋白酶13的抽提液，对此抽提液使用Ni2+-亲和色谱进行纯化，具体为先用平衡缓冲液平衡色谱柱至基线平稳后进样，继续用平衡缓冲液以1.0mL/min的速度冲洗至基线平稳，然后换洗脱液以1.0mL/min的速度洗脱结合在柱子上的蛋白，平衡缓冲液为20mM咪唑，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，8M尿素，洗脱液为100mM 咪唑，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，8M尿素，pH均为7.5；然后使用DEAE阴离子交换色谱进行复性，具体为先用结合缓冲液平衡色谱柱至基线平稳后进样，继续用结合缓冲液以1.0mL/min的速度冲洗至基线平稳，然后换洗脱液以1.0ml/min的速度梯度洗脱，在20min内，使洗脱液由0%上升到100%，结合缓冲液为20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，5M尿素，pH为8.0，洗脱液为20mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，1M NaCl，pH为7.0。
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