CN102161697B - 菊花抗逆转录因子CmMYB2及其植物表达载体和构建方法及应用 - Google Patents
菊花抗逆转录因子CmMYB2及其植物表达载体和构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
菊花抗逆转录因子CmMYB2及其植物表达载体和构建方法及应用,属于分子生物学领域。本发明所构建的表达载体pCAMBIA1301-CmMYB2是由CmMYB2基因插入到克隆载体pMD19-Tsimplevector(Takara)，经BamH
(Takara)和Sac 
(Takara)双酶切后连接到表达载体pCAMBIA1301的BamH和Sac 
位点得到的。将该植物表达载体用于植物遗传转化，CmMYB2基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成MYB2蛋白，调控下游目的基因的表达，提高植物抗逆性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及菊花抗逆转录因子CmMYB2及其植物表达载体和构建方法及应用。
背景技术
植物转录调控过程中转录因子的研究是当前分子生物学的研究热点。MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族，该家族成员在调控植物一系列重要的生理过程中发挥重要作用，例如，调节植物第二新陈代谢、细胞的形态发生、控制发育、决定细胞的命运和特性以及植物对激素和外界环境因子的反应[1~8] .
菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一，是我国园林应用于出口创汇的主要花卉种类，观赏与经济价值极高。高温、低温、盐、干旱等非生物胁迫是导致菊花产量与品质下降、生产成本激增和限制其园林应用的主要因子。目前，菊花抗逆育种多依赖于常规的传统育种，其进程缓慢且具有不定向性。菊花抗逆转录因子的研究仅限于DREB转录因子的克隆与表达特性研究[9,10]，即菊花关键抗逆转录因子的挖掘严重滞后，这在很大程度上制约了菊花抗逆育种进程。鉴于MYB转录因子在植物抗逆胁迫中重要的调控特性，对该关键转录因子的研究对于菊花抗逆分子机理的深入及其抗逆分子育种均具有十分重要的意义。
在作物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将抗逆转录因子基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，使该转录因子在CaMV35S启动子的启动下超量表达，并调控下游目的基因的表达，提高植物抗逆性，对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。
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发明内容
解决的技术问题：针对背景技术提出的解决提高菊花抗逆性的问题，本发明的目的在于提供一个新的菊花抗逆转录因子CmMYB2，该基因的序列为SEQ
ID NO. 1。
本发明的另一目的在于该转录因子CmMYB2的植物表达载体。
本发明的又一目的在于提供该转录因子CmMYB2的植物表达载体的构建方法。
本发明所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，创制耐盐新种质，可用于植物品种改良。
技术方案：
菊花抗逆转录因子CmMYB2，该基因的序列为SEQ ID NO. 1。
菊花抗逆转录因子CmMYB2的植物表达载体，由本发明所述的菊花抗逆转录因子CmMYB2（序列为SEQ ID NO. 1）与中间植物表达载体pCAMBIA1301构成。
上述的菊花抗逆转录因子CmMYB2基因的植物表达载体，是由BamH
和Sac 
双酶切CmMYB2后插入到pCAMBIA1301表达载体质粒进行连接反应得到。
菊花抗逆转录因子CmMYB2植物表达载体，其构建方法如下：
1）菊花抗逆转录因子CmMYB2
基因的克隆
以提取的地被菊‘钟山紫桂’幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增CmMYB2基因，
上游引物CmMYB2-F:
5′-ATGGCTACTGTTTCGAAA-3′
下游引物CmMYB2-R:
5′-CTAGTCTATTTTACTAATCCC-3′
以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T
Simple载体，转化TOP10感受态细胞，测定的序列为SEQ ID NO. 1；
2）植物表达载体pCAMBIA1301- CmMYB2的构建
设计引物以菊花‘钟山紫桂’ cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在CmMYB2基因的上游和下游分别引入BamH 
和Sac 
酶切位点，
上游引物CmMYB2-1301-F: 5′- GGATCCATGGCTACTGTTTCGAAA -3′
下游引物CmMYB2-1301-R: 5′- CGAGCTCCTAGTCTATTTTACTAATCCC -3′
PCR产物连接到pMD19-T
Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，BamH 
和Sac 
双酶切的CmMYB2片段与BamH 
和Sac 
双酶切的pCAMBIA1301载体质粒进行连接，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID NO. 1，植物表达载体pCAMBIA1301-CmMYB2构建成功。
3）CmMYB2的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高植物耐盐性，方法如下：
农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化；
拟南芥花序浸染及种子筛选；
PCR鉴定及耐盐评价。
菊花抗逆转录因子CmMYB2在提高植物耐盐特性的应用。
有益效果：
1．本发明提供的菊花CmMYB2是一个新的抗逆转录因子，该基因可提高植物抗逆性。
2．本发明构建的菊花CmMYB2基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制抗逆新种质，提高拟南芥的耐盐性，可进行植物品种改良。
附图说明
图1为CmMYB2琼脂糖凝胶电泳分析，其中：
M：DNA Marker
1：CmMYB2；2：pMD19-T
Simple-CmMYB2质粒BamH 
和Sac 
双酶切；
3：pCAMBIA1301-CmMYB2表达载体BamH 
和Sac 
双酶切检测图；
图2为植物表达载体pCAMBIA1301-CmMYB2图谱；
图3 野生型与转基因拟南芥RT-PCR鉴定；
图4 野生型与转基因拟南芥耐盐性评价。
具体实施方式
植物表达载体pCAMBIA1301- CmMYB2的构建
1. CmMYB2的克隆：
选用菊花 ‘钟山紫桂’（Chrysanthemum grandiflorum）作为材料，取0.05g幼嫩叶片，参照Trizol RNA提取试剂盒（TaKaRa）说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒（TaKaRa）取1 μg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照拟南芥MYB序列信息，经Oligo6.0软件分析设计引物扩增CmMYB2；
上游引物CmMYB2-F: 5′-ATGGCTACTGTTTCGAAA-3′
下游引物CmMYB2-R: 5′-CTAGTCTATTTTACTAATCCC-3′
以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应，
50 μL反应体系：10×RCR Buffer 5.0 μL，CmMYB2-F、CmMYB2-R引物各1.0 μL（20 μmol·L-1），dNTP mix 4.0 μL(2.5
mmol·L-1)，Taq DNA
Polymerase 0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O
37.8 μL；反应程序：95 ℃预变性4 min，然后94 ℃解链30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min 30
sec，反应33个循环，72 ℃延伸10 min；PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收纯化，用T4 DNA连接酶（TaKaRa）连接到pMD19-T Simple载体（TaKaRa），转化TOP10感受态细胞，序列测定为SEQ ID
NO.1；
2. 植物表达载体pCAMBIA1301- CmMYB2的构建
设计引物进行PCR反应，在目的基因CmMYB2的上游和下游分别引入酶切位点BamH 
和Sac 
，PCR产物连接到pMD19-T
Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，BamH 和Sac 
双酶切的CmMYB2片段与BamH 
和Sac 
双酶切的pCAMBIA1301载体质粒片段进行连接，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID
NO.1。
上游引物CmMYB2-1301-F:
5′- GGATCCATGGCTACTGTTTCGAAA -3′
下游引物CmMYB2-1301-R:
5′- CGAGCTCCTAGTCTATTTTACTAATCCC -3′
① 以菊花 ‘钟山紫桂’叶片cDNA作为模板，用高保真酶（PrimeSTARTM HS DNA
Polymerase，TaKaRa）进行PCR反应，50 μL反应体系：10×HS RCR Buffer 5.0
μL，CmMYB2-1301-F、CmMYB2-1301-R引物各1.0 μL (20 μmol·L-1)，dNTP mix 4.0 μL (2.5
mmol·L-1)，PrimeSTARTM HS DNA
Polymerase 0.4 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O
37.6 μL；反应程序：95 ℃预变性4 min，然后94 ℃解链30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min 30
sec，反应30个循环，72 ℃延伸10 min；PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN,
USA）回收，连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T
Simple-CmMYB2；
② 取pCAMBIA1301载体和pMD19-T
Simple- CmMYB2质粒用BamH 
和Sac 双酶切，双酶切体系（50 µL）：10×K
Buffer 2.5 µL，pCAMBIA1301或pMD19-T Simple- CmMYB2 10
µL，BamH 
2 µL，Sac 2 µL，ddH2O
33.5 µL； 37 ℃反应3 h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒（AXYGEN）回收质粒pCAMBIA1301大片段和pMD19-T
Simple-CmMYB2小片段。用T4DNA连接酶（TaKaRa）连接两个回收的产物，连接反应体系（10 µL）：10×T4
ligase Buffer 1 µL，pCAMBIA1301大片段2 µL，pMD19-T
Simple- CmMYB2小片段6 µL，T4
DNA连接酶 1 µL；16 ℃过夜连接反应，取5 µL连接产物转化TOP10感受态细胞。37 ℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA1301-CmMYB2, 电泳和测序验证为SEQ ID
NO.1。植物表达载体pCAMBIA1301- CmMYB2的构建成功。
3. 植物表达载体pCAMBIA1301- CmMYB2遗传转化拟南芥及其耐盐性鉴定
① 农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化
从YEB（50 ug/mL利福平）平板上挑取EHA105单菌落，接种于50 mL 含50 ug/mL 利福平的YEB液体培养基中，200 rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30 min，离心收集菌体，悬浮于2 mL预冷的的100mM CaCl2（20 %甘油）溶液中，200 uL/管分装，待用。
取10 uL pCAMBIA1301-
CmMYB2载体质粒，加入200 uL 感受态细胞，冰浴30 min，液氮冷冻5 min，37℃ 5 min，加入800 uL YEB 液体培养基，28℃ 200 rpm预培养4 h，菌液涂板于YEB（50 ug/mL 利福平 + 50 ug/mL卡那霉素）固体培养基上，28℃ 暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。
② 拟南芥花序浸染及种子筛选
将阳性单克隆接到50 mL 的YEB（50 ug/mL 利福平 + 50 ug/mL卡那霉素）液体培养基中，培养24小时，5000 rpm离心20分钟，然后用转化液（1/2MS，添加50克/升的蔗糖，调pH为5.8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合）剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中1分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时采收。
种子消毒与播种：将种子放入1.5mL的离心管中，加入1mL 75%酒精，添加0.1%的Triton
X-100摇晃15分钟，然后在超净台中用95% 的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子（放置30分钟），轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基上（1/2MS +
25mg/L氨苄青霉素）筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗1周以保湿。
③ PCR鉴定及抗寒评价
待抗性苗7～8片叶，提取拟南芥叶片总RNA，反转录为cDNA，进行RT-PCR（引物CmMYB2-F和CmMYB2-R）鉴定（图3）。经PCR鉴定的T1代转基因苗继续生长，采收T2代种子。对野生型和T2代抗性转基因拟南芥进行盐胁迫（300 mM NaCl）处理，12天后比较耐盐性，发现转基因拟南芥 (35S::CmMYB2-1，35S::CmMYB2-2) 成活率高于野生型拟南芥（图4）。
综上所述，本发明构建了含有抗逆转录因子CmMYB2的植物表达载体pCAMBIA1301-CmMYB2，其中CmMYB2首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高植物的耐盐特性。
序 列 表
<110> 南京农业大学
<120> 菊花抗逆转录因子CmMYB2及其植物表达载体和构建方法及应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn
version 3.3
<210> 1
<211> 948
<212> DNA
<213> 菊花 '钟山紫桂'（Chrysanthemum
grandiflorum）
<400> 1
atggctactg tttcgaaaaa agatatggac cggatcaagg gtccatggag tccagacgag 60
gacgaaatgt tgacaaacct tgtcgaaaaa cacggcccga gaaactggtc
tttgataagt 120
aaatcgatac cgggtagatc gggtaaatcg tgcaggttgc gttggtgtaa
ccagctgtca 180
ccagaagtgg agcatagggc ttttacacca gaagaagatg agacgatctt
acgtgcacat 240
gctaggtttg gtaataaatg ggctactatt gctaggcttt tatcaggaag
gactgataat 300
gctattaaga accattggaa ttctactttg aaaagaaaat gctcctctat
gactaacgag 360
gagtttaatg agctgcaggt tcaacagccc atgttgaaaa gatctgttag
cgcgggttca 420
ggcgtaccca tttcttctcc cggttacttt caccagttca ataatactcc
aaacagtcca 480
accggttccg aaattagtga ttccaatatc caagggctga cgtcatcaac
acatcttttc 540
accgtcgttc ctcctccgcc accggtggtc aatgatcctc cgacgagctt
aagcctatca 600
ttaccaggag ttgattctga tatgaaagaa aactctccac cgccgccggt
gacggttgcg 660
gcgaatgtga tgccgataag acaagtaccg gcggagatga tgacggcgat
accggcggcg 720
atatcgacgg cgatgcagga gttgagggtg tcgaagccgc cggcgccgga
gaagccgttt 780
gtgccgttta gtaatgagtt tatgagtgtg atgcaggaga tgataaggaa
ggaggtcagg 840
aaatatatga tggagcaacg gggtggtggt ggtggtaacg gaatgtgtaa
cggttttaac 900
ggtggtggtc cggtggttaa taggactggg attagtaaaa tagactag 948
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggctactg tttcgaaa
18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctagtctatt ttactaatcc c
21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggatccatgg ctactgtttc gaaa 24
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgagctccta gtctatttta ctaatccc 28
Claims (5)
1.菊花抗逆转录因子CmMYB2基因，其特征在于该基因的序列为SEQ ID NO. 1。
2.菊花抗逆转录因子CmMYB2 基因的植物表达载体，其特征在于由权利要求1所述的菊花抗逆转录因子CmMYB2基因与植物表达载体构成。
3.根据权利要求2所述的菊花抗逆转录因子CmMYB2基因的植物表达载体，其特征在于所述的植物表达载体为首先在CmMYB2基因的上下游引物的外侧引入BamH I和Sac I酶切位点，而后经BamH I和Sac I双酶切CmMYB2后插入到pCAMBIA1301表达载体质粒进行连接反应得到。
4.权利要求2或3所述的菊花逆转录因子CmMYB2植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1）菊花抗逆转录因子CmMYB2的克隆
以菊花‘钟山紫桂’幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增CmMYB2基因，
上游引物CmMYB2-F: 5′-ATGGCTACTGTTTCGAAA-3′
下游引物CmMYB2-R: 5′-CTAGTCTATTTTACTAATCCC-3′
以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，测定的序列为SEQ ID NO.1；
2）植物表达载体pCAMBIA1301- CmMYB2的构建
设计引物以菊花‘钟山紫桂’ cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在CmMYB2基因的上游和下游分别引入BamH I和Sac I酶切位点，
上游引物CmMYB2-1301-F: 5′- GGATCCATGGCTACTGTTTCGAAA
-3′
下游引物CmMYB2-1301-R: 5′-
CGAGCTCCTAGTCTATTTTACTAATCCC-3′
PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，BamH I和Sac I双酶切的CmMYB2片段与BamH I和Sac I双酶切的pCAMBIA1301载体片段连接，转化，提取阳性质粒，电泳检测并测序验证为SEQ ID NO. 1，植物表达载体pCAMBIA1301- CmMYB2构建成功。
5.权利要求1所述的菊花抗逆转录因子CmMYB2基因在提高拟南芥耐盐特性的应用。
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