CN102160895A - Pitpnm3基因在制备抑制乳腺癌浸润和转移的药物中的应用 - Google Patents
Pitpnm3基因在制备抑制乳腺癌浸润和转移的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了PITPNM3基因在制备抑制乳腺癌浸润和转移药物中的应用。CCL18促进乳腺癌的浸润迁移，PITPNM3被鉴定为CCL18受体，是一种新的抑制乳腺癌浸润和转移的靶点。所述抑制乳腺癌浸润和转移的药物以靶向抑制PITPNM3基因的药物为有效成分。所述靶向抑制PITPNM3基因的药物以沉默PITPNM3表达的siRNA或/和G蛋白偶联受体抑制剂百日咳毒素为有效成分，抑制CCL18与PITPNM3结合所引起的生物学效应。本发明首次提出CCL18通过PITPNM3促进乳腺癌浸润和迁移，PITPNM3是CCL18的受体，可以通过靶向抑制PITPNM3受体而抑制乳腺癌转移和侵润。
Description
技术领域
本发明涉及PITPNM3基因在制备抑制乳腺癌浸润和转移的药物中的应用。
背景技术
乳腺癌转移是患者治疗失败的根本原因，但肿瘤转移的确切机制还没有系统阐明，还没有抑制乳腺癌转移的有效方法，研亢促进乳腺癌转移的机制，确立抑制乳腺癌转移的分子靶点，是改善乳腺癌预后的有效途径。在肿瘤微环境中存在多种与转移相关的基质细胞，大量临床研亢证明肿瘤相关巨噬细胞(TAM)具有促进包括乳腺癌在内的多种肿瘤浸润迁移的作用。大量的研亢证明TAM通过分泌趋化因子、炎症因子、生长因子促进乳腺癌浸润和转移。但目前研亢的促进肿瘤进展的细胞因子，如EGF、VEGF、MMP7/9，不但来源于TAM，而且来源于肿瘤细胞或其他的基质细胞，还没有研亢报道只来源于TAM促进肿瘤转移的细胞因子。
趋化因子是一类具有细胞趋化作用的细胞因子，在乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、宫颈癌、前列腺癌等一系列肿瘤的进展中起关键的作用(chemokin receptors 912)。在肿瘤的微环境中，来源于基质细胞的趋化因子募集不同类型的免疫细胞，如：TAMs，TANs，淋巴细胞，CAFs，MSCs和内皮细胞，调节局部的免疫反应。这些浸润到肿瘤微环境中的细胞是趋化因子的来源，可以影响肿瘤的生长、细胞生存、血管生成和转移。许多研亢证明多种实体瘤细胞高表达趋化因子的受体(chemokin receptors 1113)，表达趋化因子受体的肿瘤细胞很容易转移到表达相应趋化因子的器官。比如CXCR4的配体CXCL12在肺、肝和淋巴结高表达，这些部位出现表达CXCR4的转移瘤几率增高。肿瘤转移是一个复杂的过程，单纯用趋化因子的趋化作用去解释肿瘤细胞远距离的迁移是不够的。
CCL18是一种由选择性激活的巨噬细胞(M2)特异性分泌的CC型趋化因子，在Goucher病、类风湿性关节炎等慢性炎症性疾病中M2巨噬细胞高表达CCL18。CCL18在组织纤维化、促进淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞趋化过程中发挥重要的作用。近期研亢观察到卵巢癌、胃癌和胶质瘤中巨噬细胞表达CCL18，但CCL18与肿瘤预后的关系还存在争议。CCL18是否与乳腺癌的预后相关，还没有研亢报道。我们已证明在乳腺癌组织中TAM表达CCL18；对病人的预后进行随访，生存分析证明，乳腺癌组织中表达CCL18的TAM数量越多，病人的预后越差，是乳腺癌预后的独立预测因子。在体外实验中证实随CCL18剂量增大，CCL18促进乳腺癌细胞浸润迁移的功能增强。在动物实验中证实CCL18促进鼠乳腺癌的转移。但由于CCL18的靶向受体还没有得到鉴定，阻碍了靶向CCL18及其下游的信号通路抑制乳腺癌迁移方法的进一步发展。
PITPNM3又名Nir1，属于Nir蛋白家族，这个家族包括3个Nir蛋白(Nir13)，是果蝇视网膜退化蛋白B(rdgB)的人同型体。Nirs可以结合钙，具有磷脂酰肌醇转运活性，可以被激活的Pyk2进行酪氨酸磷酸化。前期研亢最多的是Nir2，已经明确证明Nir2位于细胞的内质网和高尔基体，执行磷脂酰肌醇转运功能，Nir2的突变与视椎视杆细胞功能障碍引起家族性视网膜褪变有关。以前的研亢证明PITPNM3在脑、视网膜、脾表达，不具有磷脂酰肌醇转运结构域，不表达在细胞的内质网和高尔基体。由此可以推测PITPNM3执行与Nir2不同的生物学功能。我们用CCL18对与其结合的蛋白进行免疫共沉淀，然后用质谱分析免疫共沉淀获得的与CCL18结合的蛋白，发现这种蛋白就是PITPNM3，所以我们要继续研亢PITPNM3是不是CCL18的受体，CCL18是不是通过PITPNM3实现促进乳腺癌浸润迁移功能的。
发明内容
本发明提供了PITPNM3基因在制备抑制乳腺癌浸润和转移的药物中的应用。所述PITPNM3被鉴定为CCL18受体，是一种新的抑制乳腺癌浸润和转移的靶点。
所述抑制乳腺癌浸润和转移的药物以靶向抑制PITPNM3基因的药物为有效成分。
所述靶向抑制PITPNM3基因的药物以沉默PITPNM3表达的siRNA或/和G蛋白偶联受体抑制剂百日咳毒素为有效成分，以抑制CCL18与PITPNM3结合所引起的生物学效应。
所述沉默PITPNM3表达的siRNA的序列为：
本发明首次提出PITPNM3在肿瘤细胞表达，证明CCL18通过PITPNM3促进乳腺癌浸润和迁移，PITPNM3是CCL18的受体。可以通过靶向抑制PITPNM3受体而抑制CCL18促进乳腺癌浸润转移的功能。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是选择性激活的巨噬细胞促进乳腺癌细胞迁移的实验结果图；
图1A是用划痕实验结果图；
图1B是上述实验结果的统计图；
图2是CCL18通过剂量依赖的方式促进乳腺癌迁移的实验结果图；
图2A是在培养体系中加入不同浓度的CCL18后的划痕实验结果图；
图2B是上述实验结果的统计图；
图3是CCL18可以与乳腺癌细胞表面蛋白结合的实验结果图；
图3A是用CCL18蛋白孵育乳腺癌细胞，然后用CCL18的荧光抗体定位CCL18的实验结果图；
图3B是在上述实验体系中加入CCL18的中和性抗体，可以抑制CCL18与乳腺癌细胞膜上的蛋白结合的实验结果图；
图4是证明CCL18能够与乳腺癌细胞膜上的蛋白PITPNM3结合的实验结果图；其中，
图4A首先用CCL18蛋白处理乳腺癌细胞，使CCL18在生理状态下与膜表面蛋白结合，然后用没有中和作用的CCL18克隆抗体对与CCL18及其结合蛋白进行免疫共沉淀，最后把共沉淀获得的蛋白进行变性胶电泳后的结果图；其中泳道1是CCL18处理的MDA-MB-231细胞的膜蛋白；泳道2是没有与蛋白A/G琼脂糖珠相结合的膜蛋白；泳道3是蛋白A/G琼脂糖珠；泳道4是蛋白A/G琼脂糖珠加CCL18蛋白；泳道5是蛋白A/G琼脂糖珠加CCL18的单克隆抗体；泳道6是在蛋白A/G琼脂糖珠与CCL18、CCL18抗体和细胞膜蛋白均存在的情况下加入变性剂SDS；泳道7是在蛋白A/G琼脂糖珠与CCL18、CCL18抗体和细胞膜蛋白均存在的情况下做免疫共沉淀；
图4B是对上述实验中获得的与CCL18特异性结合蛋白进行质谱分析的实验结果图；
图4C是把上述免疫共沉淀获得的7组蛋白利用PITPNM3的抗体进行western blot分析的实验结果图；
图5用免疫荧光共定位的方法证明CCL18可以与乳腺癌细胞膜上的蛋白PITPNM3结合的实验结果图；
图5A用CCL18孵育乳腺癌细胞，用CCL18和PITPNM3的荧光抗体进行免疫荧光染色的实验结果图；
图5B用siRNA沉默乳腺癌细胞PITPNM3的表达，用western blot证实这种沉默效果的实验结果图；
图6用携带PITPNM3基因的质粒pcDNA3.1转染HEK-293细胞，构建稳定表达PITPNM3的细胞系的实验结果图；
图6A是用western blot证明稳转株表达PITPNM3，而转染空载体或没有转染的HEK-293细胞不表达PITPNM3的实验结果图；
图6B是用流式细胞仪检测的方法证明稳转株表达PITPNM3，而转染空载体或没有转染的HEK 293细胞不表达PITPNM3的实验结果图；
图6C是用免疫荧光染色PITPNM3稳转株和MDA-MB-231细胞的内质网(ER)、高尔基体(Golgi)，证明PITPNM3位于上述细胞的细胞膜，而不位于ER或Golgi的实验结果图；
图6D是用超高速离心的方法，从PITPNM3-HEK-293细胞稳转株中分离获得ER、Golgi、膜蛋白，用Western blot检测膜蛋白的标记整合素β1、Goigi标志GM130和ER的标志Calnexin作为阳性对照，证明PITPNM3位于稳转株的细胞膜上的实验结果图；
图7是CCL18能够作用于转染PITPNM3质粒表达PITPNM3的HEK-293细胞，诱导功能性反映的实验结果图；
图7A是对稳转pcDNA3PITPNM3(PITPNM3)质粒的HEK-293细胞，CCL18能够促进钙内流，而HBSS和CCL20不能促进钙内流；对单纯转染pcDNA3空载体和没有转染的293细胞CCL18、HBSS、CCL20均不能促进钙内流的实验结果图；
图7B是用图7A中的方法处理HEK 293细胞，用Western blot的方法检测PLCγ1，PKCζ和IP3KB的磷酸化蛋白和总蛋白的实验结果图；
图7C是用125I-CCL18处理转染PITPNM3质粒的HEK-293，然后在体系中加入浓度逐渐升高的未标记的rCCL3，rCCL4，rCCL5，rCCL18或rCCL20的实验结果图；
图7D是用Alexa488标记的CCL18抗体和Cy3标记的PITPNM3抗体对HEK-293细胞作免疫荧光染色，用Confocal方法检测的实验结果图；
图7E F是把浓度逐渐提高的rCCL18或rCCL20加入Boyden chamber的下层，稳转PITPNM3的HEK-293细胞植入Boyden chamber的上层，迁移实验的结果图；
图8是用PBS或CCL18(20ng/ml)处理MDA-MB-231细胞，不转染或转染GFP-siRNA或PITPNM3-siRNA，沉默PITPNM3的表达，在Boyden chamber中做浸润迁移实验的结果图；
图9是在乳腺癌荷瘤鼠体内CCL18通过PITPNM3促进乳腺癌浸润和转移的实验结果图；
图9A是CCL18而不是PBS或rCCL20促进BT-474乳腺癌细胞血管浸润并浸润到邻近组织的实验结果图；
图9B是检测荷瘤鼠的肺湿重的实验结果图；
图9C是检测负荷乳腺癌MDA-MB-231(上)或BT-474(下)的小鼠，肝转移性结节的个数的实验结果图；
图9D是用小动物成像系统(IVIS Lumina Imaging System)检测肿瘤在荷瘤鼠肺和肝的转移的实验结果图；
图9E和G是对负荷BT-474(上)和MDA-MB-231(下)移植瘤的小鼠肺、肝组织进行H&E染色的实验结果图；
图9F和H是对荷瘤鼠肺、肝组织进行实时定量PCR检测人HPRT mRNA的表达与鼠18SrRNA的比值的实验结果图；
图9I是负荷BT-474(左)和MDA-MB-231(右)移植瘤的小鼠Kaplan-Meier生存曲线；
图9J是CCL18作用于荷瘤鼠，通过PITPNM3降低荷瘤鼠的体重的统计图；
图10是把rCCL18注射入BT-474和MDA-MB-231细胞的移植瘤内不会明显改变肿瘤的大小的实验结果图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：CCL18促进乳腺癌浸润迁移的实验
为了研亢CCL18的功能，我们设计了划痕实验来评估分泌表达CCL18的巨噬细胞对乳腺癌浸润迁移的作用。具体是实验方法是：培养乳腺癌细胞密度达到90％，用枪头在细胞单层上划直线痕，把培养有分泌CCL18的选择性激活巨噬细胞的嵌套放入培养体系，在DMEMF12加0.4％BSA、B2720ul/ml、EGF胰岛素存在的培养条件下，共培养12hrs。在相差显微镜下拍摄0h和12h的图片，用Carnoy software(Biovolution)软件分析图片上0h和12h划痕两侧的距离，计算细胞迁移距离与未迁移距离的百分率。证明乳腺癌细胞在分泌CCL18的巨噬细胞作用下比未激活的巨噬细胞或无巨噬细胞作用组比较，迁移快。在培养体系中加入针对CCL18的中和性抗体，可以剂量依赖的方式抑制分泌CCL18的巨噬细胞促进乳腺癌浸润迁移的作用(图1A和B)。另外，用不同剂量的CCL18(0-20ng/ml)处理乳腺癌细胞可以剂量依赖的方式促进乳腺癌细胞的浸润和迁移(图2A和B)。说明CCL18在TAMs促进乳腺癌细胞浸润迁移中起关键的作用。
实施例2：证明PITPNM3是CCL18所激活的跨膜受体的实验
为了鉴定乳腺癌细胞膜上是否存在CCL18的受体，MDA-MB-231细胞与CCL18在4℃条件下孵育3h，固定，用Alexa488标记的CCL18抗体染色。免疫荧光染色证明CCL18存在于乳腺癌细胞的膜上(图3A)，提示乳腺癌细胞表面存在特殊的蛋白分子可以与CCL18结合并介导CCL18的生物学作用。另外在CCL18与细胞孵育过程中加入CCL18的中和性抗体，可以阻止CCL18与乳腺癌细胞表面蛋白结合(图3B)。
为了鉴定未知的CCL18功能性受体，我们首先用CCL18蛋白处理乳腺癌MDA-MB-231细胞，然后提取细胞膜蛋白，用没有中和功能的CCL18单克隆抗体对膜蛋白进行免疫共沉淀，把免疫共沉淀获得的蛋白进行变性蛋白电泳、用考马斯亮蓝染色胶，在胶上发现了一条特殊的蛋白条带(Lane 7，图4A)，进一步用液相质谱分析获得的蛋白条带。证明这种的蛋白是膜相关的磷脂酰肌醇转移蛋白3(图4B)，PITPNM3(又叫做PYK2N端结构域相互作用受体1，Nir1)，是果蝇视网膜退化蛋白B在人体内的同形体(rdgB)。我们把免疫沉淀获得的蛋白用PITPNM3抗体进行免疫印记分析，进一步证明与CCL18在乳腺癌细胞表面结合的蛋白是PITPNM3(图4C)。
为了更进一步证明CCL18与PITPNM3在细胞表面结合，我们把MDA-MB-231细胞与CCL18在4℃孵育3hrs，用荧光标记的CCL18和PITPNM3抗体进行染色，在共聚焦显微镜下拍摄图片，证明CCL18与PITPNM3在乳腺癌细胞表面结合(图5A)。如果用小分子RNA沉默乳腺癌细胞PITPNM3的表达，可以阻断CCL18定位于乳腺癌细胞膜(图5B)，提示CCL18在乳腺癌细胞膜上与PITPNM3相互作用。
CCL18能够与乳腺癌细胞表面的PITPNM3结合并不能完全说明PITPNM3就是CCL18的受体，因为受体与其相应的配体结合要介导一定的生物学效应，为了鉴定PITPNM3是CCL18的功能性受体，我们用化学合成的方法获得PITPNM3的mRNA序列，把PITPNM3的基因序列克隆进入PCDNA3.1质粒，把表达PITPNM3的质粒转染进入HEK-293，用6418进行筛选，获得稳定表达PITPNM3的细胞系(图6A)，用PITPNM3抗体、用流式的方法证明在HEK-293和MDA-MB-231细胞上稳定表达PITPNM3(图6B)。
以前的研亢证明Nir2-3位于细胞内质网膜和高尔基体膜，但关于Nir1细胞内的表达位置没有明确的研亢报道，我们首次研亢了PITPNM3的细胞定位，用免疫荧光染色的方法定位PITPNM3质粒转染的HEK-293细胞和MDA-MB-231细胞并对细胞的亚细胞结构进行共定位，发现PITPNM3表达于细胞膜，而不位于内质网膜(ER)或高尔基体(图6C)。我们提取细胞内质网、高尔基体、细胞膜不同组分的蛋白，用PITPNM3的抗体对这些组分蛋白进行免疫共沉淀，用western blot的方法分析PITPNM3的免疫沉淀蛋白，同样证明PITPNM3位于细胞膜(图6D)。我们检测了在CCL18作用下细胞内钙内流的变化，这个方法被常规用于检测趋化因子受体的激活。我们得到的结果是转染PITPNM3质粒的HEK-293细胞对CCL18的作用产生反应，出现细胞内钙的水平明显升高，但稳转株对rCCL20没有反应，而且转染空质粒的HEK-293细胞和没有转染的细胞对CCL18没有反应(图7A)。CCL18可以通过PITPNM3激活细胞内的钙内流信号传导通路(图7B)。为了进一步证明CCL18与PITPNM3结合，我们进行了放射性配基结合实验。结果证明转染PITPNM3的293细胞高水平结合125I-CCL18，而且完全可以被非标记的CCL18竞争性抑制(Kd＝5.17nM，3.299-7.042nM，95％confidenceinterval)，而CCL3、CCL4、CCL5、CCL20不能竞争性抑制125I-CCL18，说明CCL18可以特异性与PITPNM3结合。(图7C)。CCL18与PITPNM3在转染PITPNM3质粒的细胞表面结合，进一步可以免疫荧光共染色，用共聚焦显微镜观察到(图7D)。我们下一步检测了CCL18对转染PITPNM3质粒的HEK-293细胞迁移功能的影响(图7E)，rCCL18而不是rCCL20在体外可以剂量依赖的方式促进PITPNM3-HEK-293细胞的迁移，然而未转染的和转染空质粒的293细胞的迁移功能不受CCL18的影响。相反，如果把CCL18加入transwell培养板的上层小室内，可以剂量依赖的方式抑制下层小室内CCL18促进PITPNM3-HEK-293细胞迁移的作用。(图7F)。上述实验充分说明CCL18与PITPNM3特异性结合，刺激钙内流，诱导表达PITPNM3的HEK-293细胞定向迁移，说明PITPNM3是趋化因子CCL18的功能性受体。
实施例3PITPNM3介导CCL18促进乳腺癌浸润和迁移
为了进一步探讨在乳腺癌细胞中CCL18-PITPNM3相互作用，我们研亢证明用siRNA沉默PITPNM3的表达，会影响CCL18对乳腺癌细胞的作用。siRNA序列为：PITPNM3siRNA-1：正义链5′-GGGAGAAGUGGCUUCGUAATT-3′反义链：5′-UUACGAAGCCACUUCUCCCGG-3′；PITPNM3 siRNA-2：正义链5′-CGCGCAUGAUCCUGCGCAATT-3′反义链：5′-UUGCGCAGGAUCAUGCGCGAG-3′。沉默乳腺癌细胞PITPNM3的表达可以明显把CCL18促进乳腺癌细胞迁移的作用抑制到无CCL18作用的乳腺癌细胞迁移的水平(P＜0.001，图8)。用PITPNM3-siRNA转染无rCCL18作用的乳腺癌细胞不会影响细胞的浸润迁移功能(P＞0.05，图8)。这些结果说明CCL18促进乳腺癌细胞浸润迁移生物学功能是通过PITPNM3实现的。
实施例4CCL18通过PITPNM3促进乳腺癌浸润迁移的体内实验
为了在体内实验中证明CCL18-PITPNM3相互作用促进乳腺癌浸润迁移，我们把BT-474细胞(低转移细胞系)和MDA-MB-231细胞(高转移细胞系)种植到NOD/SCID鼠的乳腺脂肪垫下，当移植瘤直径达到1.5cm时评估肿瘤肺、肝转移的情况。rCCL18的瘤内注射剂量为0.1g/kg每周两次，连续四周，以同样的剂量注射P(图9A)。尽管把rCCL18注射入BT-474和MDA-MB-231细胞的移植瘤内不会明显改变肿瘤的大小(图10)，但CCL18可以明显提高肺和肝转移瘤的数量，提高了肺的重量(图9B)和肝转移结节的数量(图9C)。H&E染色组织切片证明CCL18注射入BT-474或MDA-MB-231移植瘤，与注射PBS或rCCL20相比，明显促进肿瘤肺和肝转移(图9E和G)。总之，这些实验证明CCL18促进乳腺癌移植瘤的肝、肺转移。
如果用病毒载体携带PITPNM3-shRNA或GFP-shRNA转染乳腺癌BT-474细胞可以逆转CCL18促进乳腺癌血管和肿瘤周围组织浸润的作用(图9A)。在BT-474和MDA-MB-231移植瘤中，沉默PITPNM3，也会抑制CCL18促进乳腺癌肝、肺转移(图9B-H)可以逆转CCL18注射所导致的鼠的生存率降低和体重减低(图9I和J)。这些结果说明CCL18以PITPNM3依赖的方式促进乳腺癌浸润和迁移。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<120>PITPNM3基因在制备抑制乳腺癌浸润和转移的药物中的应用
<160>4
<210>1
<211>21
<212>PITPNM3 siRNA-1(正意)
<400>1
gggagaagug gcuucguaat t
<210>1
<211>21
<212>PITPNM3 siRNA-1(反意)
<400>2
uuacgaagcc acuucucccg g
<210>1
<211>21
<212>PITPNM3 siRNA-2(正意)
<400>3
cgcgcaugau ccugcgcaat t
<210>1
<211>21
<212>PITPNM3 siRNA-2(反意)
<400>4
uugcgcagga ucaugcgcga g
Claims (4)
1.PITPNM3基因在制备抑制乳腺癌浸润和转移的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制乳腺癌浸润和转移的药物以靶向抑制PITPNM3基因的药物为有效成分。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述靶向抑制PITPNM3基因的药物以沉默PITPNM3表达的siRNA或/和G蛋白偶联受体抑制剂百日咳毒素为有效成分。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述沉默PITPNM3表达的siRNA的序列为：
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Application publication date: 20110824 |