CN109771440B - 一种沉默IV型胶原表达的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了能沉默IV型胶原表达的siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明利用RNA干扰的策略沉默肝癌细胞自身IV型胶原的表达，可以抑制肿瘤相关巨噬细胞来源的CCL18促进肝癌浸润迁移的作用，进而实现抗肿瘤的目的。

Description

一种沉默IV型胶原表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及RNA沉默技术领域，尤其是一种沉默IV型胶原表达的siRNA 及其应用。

背景技术

肿瘤的远处转移是通过血循环或淋巴循环实现的，以前的研究认为肿瘤细胞 是以单个细胞的形式通过血循环或淋巴循环迁移，近期研究认为肿瘤细胞是以一 个细胞团的形式迁移，迁移的细胞团包含肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞和细 胞外基质(ECM)，实质上就是肿瘤细胞是带着其赖以生存的“土壤“迁移，可以 最大限度避免失巢性凋亡。在迁移的细胞团中，肿瘤细胞自身分泌的细胞外基质 起关键的作用。

肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)来源的CCL18(是一种趋化因 子)与肝癌细胞上的功能性受体PITPNM3结合，促进肝癌细胞表达分泌细胞外 基质第IV型胶原，IV型胶原分泌到肿瘤微环境中，即与肝癌细胞表面的整合素 受体结合，促进肝癌细胞粘附、浸润、迁移，抵抗失巢性凋亡。与细胞外基质(ECM) 密切相关的肿瘤浸润迁移严重影响患者预后，肿瘤细胞浸润迁移包含局部浸润和 远处转移两个环节。

肿瘤局部浸润实质上是肿瘤细胞在重塑的细胞外基质上以阿米巴运动的方 式爬行，在此过程中细胞外基质重塑起关键的作用，因为重塑ECM的支撑是肿 瘤细胞脱离原发灶、抵抗失巢性凋亡、迁移到原发灶外的必要条件。多个研究认 为，肿瘤微环境中存在多种基质细胞，其中肿瘤相关成纤维细胞大量分泌细胞外 基质蛋白(ECM)，发挥细胞外基质重塑的作用，促进肿瘤的浸润迁移。近期研 究认为肿瘤细胞也会表达分泌ECM，发挥ECM重塑的作用。

关于肿瘤微环境中ECM对肿瘤浸润迁移作用的研究，大多集中在对成纤维 细胞产生ECM的研究，近年关注到肿瘤自身分泌的ECM对肿瘤转移的作用， 但没有关于微环境对肿瘤自身分泌的ECM调控作用的报导，没有肿瘤自身分泌 ECM对肿瘤浸润迁移作用的系统研究，更没有针对肿瘤微环境或肿瘤细胞本身 抑制肿瘤自身ECM表达从而抑制肿瘤浸润迁移的策略；肿瘤微环境与肿瘤自身 分泌ECM的关系、调控肿瘤细胞分泌ECM的机制、肿瘤细胞自身分泌ECM在 肿瘤迁移中发挥的具体作用没有研究报导；如何调控肿瘤微环境，抑制细胞外基 质重塑，达到抑制肿瘤迁移的作用，还没有研究报导。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种 能沉默IV型胶原表达的siRNA，其能抑制IV型胶原的表达、抑制癌细胞粘附于 细胞外基质、抑制癌细胞的浸润和迁移。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括如下两个方面：

在第一个方面，本发明提供了能沉默IV型胶原表达的siRNA在制备抗肿瘤 药物中的应用。

优选地，所述siRNA为靶向CCL18的受体PITPNM3的siRNA、靶向信号 分子Snail的siRNA和靶向CoL4α1基因的siRNA中的至少一种。

优选地，所述靶向CoL4α1基因的siRNA的碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；或者，所述靶向CoL4α1基因的siRNA的碱基序列如SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6所示。应当说明的是，靶向CoL4α1基因的siRNA的碱基序列包 括但不限于SEQ ID NO.3～6所示的碱基序列，还包括与SEQ ID NO.3～6所示的 碱基序列1个多个碱基不同的siRNA，只要siRNA能靶向结合CoL4α1基因进而 使得CoL4α1基因的表达水平降低，抑制CCL18对癌细胞的浸润和迁移促进作用 即可，这样的siRNA均落在本发明的保护范围内。

优选地，所述肿瘤为肝癌。

优选地，所述肿瘤为乳腺癌。

在第二个方面，本发明提供了一种抗肿瘤的药物，所述药物中含有能沉默IV 型胶原表达的siRNA。

优选地，所述siRNA为靶向CCL18的受体PITPNM3的siRNA、靶向信号 分子Snail的siRNA和靶向CoL4α1基因的siRNA中的至少一种。

优选地，所述靶向CoL4α1基因的siRNA的碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，或者如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

优选地，所述靶向CCL18的受体PITPNM3的siRNA的碱基序列如SEQ ID NO.7和SEQID NO.8所示，或者如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

优选地，所述靶向信号分子Snail的siRNA的碱基序列如SEQ ID NO.11和 SEQ IDNO.12所示，或者如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

优选地，所述肿瘤为肝癌或乳腺癌。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明利用RNA干扰的策略沉默肝癌细胞自身IV型胶原的表达，可以抑制 肿瘤相关巨噬细胞来源的CCL18促进肝癌浸润迁移的作用，进而实现抗肿瘤的 目的。

附图说明

图1为肝癌细胞IV型胶原表达量检测结果图；其中，

图1A为不同浓度CCL18刺激下肝癌细胞IV型胶原表达量对比结果图；

图1B为靶向PITPNM3基因的siRNA对相同浓度CCL18刺激下肝癌细胞 PITPNM3下游信号分子Snail表达的影响效果图；

图1C为靶向PITPNM3基因的siRNA对相同浓度CCL18刺激下肝癌细胞IV 型胶原表达的影响效果图；

图1D为靶向Snail基因的siRNA对相同浓度CCL18刺激下肝癌细胞IV型 胶原表达的影响效果图，其中mock表示只加转染试剂组，Un表示空白对照组， si-GFP、si-PI-1、si-PI-2、si-Sn1、si-Sn2分别为对应siRNA处理组；

图2为CCL18浓度相同时，靶向CoL4α1基因的siRNA对肝癌细胞的粘附、 浸润和迁移影响的结果图；其中，adherence表示粘附，invasion表示浸润，migration 表示迁移，mock表示只加转染试剂组，Un表示CCL18处理组；

图3为不同浓度的CCL18对肝癌细胞的粘附、浸润和迁移的影响的结果图； 其中，adherence表示粘附，invasion表示浸润，migration表示迁移；

图4为CCL18浓度相同时，靶向PITPNM3的siRNA对肝癌细胞的粘附、 浸润和迁移的影响的结果图；其中，adherence表示粘附，invasion表示浸润， migration表示迁移，mock表示只加转染试剂组，Un表示CCL18处理组；

图5为CCL18浓度相同时，靶向Snail的siRNA对肝癌细胞的粘附、浸润和 迁移影响的结果图。其中，adherence表示粘附，invasion表示浸润，migration表 示迁移，mock表示只加转染试剂组，Un表示CCL18处理组。

具体实施方式

现有技术方案主要靶向肿瘤细胞自身的特性进行治疗，而没有关注肿瘤微环 境对肿瘤的作用。本发明关注肿瘤微环境对肝癌细胞产生的作用，通过调控肿瘤 微环境中CCL18所引发的肝癌细胞对IV型胶原的表达，起到抑制肝癌浸润迁移 的作用。

本申请发明人的研究结果提示：肝癌细胞自身分泌的IV型胶原，以可溶的 状态，迅速与自身的粘附分子整合素结合，引起整合素聚集、细胞的粘附功能增 强，迅速给予自身支撑、防止失巢凋亡、实现浸润迁移，是肿瘤细胞适应迁移过 程中的周围环境调节自身功能的一部分。肿瘤细胞分泌的胶原是细胞在迁移过程 中自身提供的、即刻可以抓住的防止凋亡的“救命稻草”，只有通过肿瘤微环 境中的CCL18对肿瘤细胞胶原的表达进行调控，才能实现肿瘤细胞自身的“托 举”、实现肿瘤细胞与自身分泌的胶原相结合。此后，与肝癌细胞整合素结合的 IV型胶原可以与细胞外ECM的网络相连接、可以与肿瘤细胞周围的基质细胞连 接，成为肿瘤微环境的一部分。正是通过与自身整合素相联系的ECM网络和基 质细胞，肝癌细胞实现自身局部浸润和远处迁移。

该研究结果系统阐述了肿瘤微环境中TAM来源的CCL18对肝癌细胞表达自 身胶原起关键的调控作用，证明了CCL18促进肝癌细胞自身胶原表达的分子机 制，证明肿瘤自身胶原的表达在肝癌细胞浸润迁移过程中的关键作用；发明人在 研究证明TAM来源的CCL18通过其功能性受体PITPNM3促进乳腺癌迁移的基 础上(专利号：ZL 200910214492.3)，系统研究了CCL18作用于肝癌细胞表面受 体PITPNM3，通过细胞内激活的下位信号通路，促进肝癌细胞表达IV型胶原， 从而抵抗失巢性凋亡，促进肝癌浸润迁移。

本发明涉及肿瘤治疗领域，重点关注的是在肿瘤微环境因素TAM来源的 CCL18作用下，肝癌细胞自身表达的IV型胶原对肿瘤的浸润迁移起关键作用。 本发明用RNA干扰的策略沉默肝癌细胞自身IV型胶原的表达，可以抑制TAM 来源的CCL18促进肝癌浸润迁移。为此，本申请的发明人设计siRNA以沉默IV 型胶原的表达，从而抑制肝癌浸润迁移。

在一些实施例中，用siRNA沉默肝癌中CCL18的受体PITPNM3(Gene ID: 83394)的表达，可以抑制CCL18促进肝癌表达IV型胶原；

在一些实施例中，沉默CCL18所激活信号通路的关键信号分子Snail(Gene ID:6615)，可以抑制CCL18促进肝癌表达IV型胶原，从而抑制肝癌迁移；

由于在CCL18(C-C型趋化因子18)作用下，肝癌细胞表达的IV型胶原被 肝癌细胞分泌到细胞外，与肝癌细胞表面的整合素受体结合，促进整合素聚集， 从而促进肿瘤细胞粘附、浸润和迁移，在一些实施例中，发明人用靶向CoL4α1 基因(Gene ID:1282)的siRNA沉默肝癌中IV型胶原的表达，可以抑制CCL18 促进肝癌浸润迁移的作用。此种小分子RNA可以作为小分子药物，发挥抑制肿 瘤微环境促进肿瘤浸润迁移的功能。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施 例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本申请中的试剂浓度均为质量浓度。

实施例1细胞培养和处理

实验目的：为后续实验准备细胞样品。

实验材料：肝癌细胞系SMMC-7721购买于赛百慷生物技术股份有限公司(上 海，中国)，肝癌细胞系HepG2和乳腺癌细胞系MDA-MB-231均从美国种质保 藏中心(ATCC，VA，美国)获得。所有的细胞都是用Dulbecco改良的Eagle培养 基培养(DMEM，Gibco，NY，美国)，其中含有10％胎牛血清(FBS，Gibco， NY，美国)。

实验步骤：所有的细胞都是用DMEM培养基，其中含有10％胎牛血清，在 37℃，含有5％的二氧化碳浓度，潮湿的条件下培养。

实施例2肝癌细胞的siRNA制备及转染

实验目的：为后续实验准备CoL4α1、PITPNM3、Snail基因敲降的肝癌细胞。

实验材料：脂质体介导肝癌细胞转染的HepG2，SMMC-7721，无血清培养 基Opti-mem I(Invitrogen，CA，美国)，Lipofectamine2000试剂(Invitrogen，CA， 美国)，siRNA由锐博生物科技(广州，中国)合成，碱基序列如下表1所示。

表1 siRNAs的寡核苷酸序列

实验步骤：

1)转染前一天接种细胞至6孔板中，使细胞密度在转染日约为60％，细胞培 养与不含抗生素的10％FBS DMEM培养基中培养。加入siRNA前先去掉培养基， 每孔内加400ul不含血清的DMEM，去除血清对siRNA的影响。

2)siRNA与转染试剂混合：根据Lipofectamine2000试剂制造商的说明书进行。

3)转染：把混合液500ul/孔加入培养板中，培养5h。

4)转染后细胞培养：按实施例1进行，培养48h后备用。

实施例3CCL18促进肿瘤细胞IV型胶原的表达

实验目的：检测实施例1和实施例2所得细胞在CCL18作用下IV型胶原的 表达能力，验证siRNA对CCL18介导的肝癌细胞IV型胶原表达的抑制作用。

实验材料：重组人CCL18细胞因子(PeproTech，NJ，美国)、DMEM培养基 (DMEM，Gibco，NY，美国)、胎牛血清(FBS，Gibco，NY，美国)、兔抗人 Collagen IV多克隆抗体(CellSignaling technology，MA，美国)、兔抗人GAPDH 多克隆抗体(Cell Signalingtechnology，MA，美国)、PVDF膜(Millipore，MA， 美国)、蛋白marker(Thermo，MA，美国)、脱脂奶粉(伊利，中国)、苯甲基磺 酰氟(PMSF，博彩，上海，中国)、磷酸酶抑制剂混合物(博彩，上海，中国)、 RIPA细胞裂解液(博彩，上海，中国)、ECL发光液(Thermo，MA，美国)、BCA 蛋白定量分析试剂盒(Thermo，MA，美国)、Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)、 SDS-PAGE上样缓冲液(碧云天，上海，中国)。

试剂配方：

1)TBST：1L 1xTBS加入1ml 20％Tween-20，混匀。

2)Western Blot封闭液(20ml)：脱脂奶粉1g溶于20ml 1xTBST中，现配现 用。

3)10x电泳缓冲液：144g甘氨酸、Tris-Base 30.2g、SDS 10g，加去离子水定 容至1L，搅拌混匀。4℃保存。

4)10x电转缓冲液：144g甘氨酸、Tris-Base 30.38g，加去离子水定容至1L， 搅拌混匀。

5)蛋白裂解液：1ml RIPA细胞裂解液加入10ul PMSF、10ul磷酸酶抑制剂混 合物混匀，现配现用。

实验步骤：

1)样品的准备：

①细胞培养：参照实施例1。

②siRNA制备及转染：参照实施例2。

③CCL18刺激：处理组培养基中加入对应终浓度的CCL18蛋白(参考图1)， 对照组加入等量的PBS，处理24h后提取蛋白质。

④蛋白的提取：吸去贴壁培养细胞的培养基，用已预冷的PBS洗三遍，彻底 洗去培养基。每孔(6孔板)加入60ul配好的蛋白质裂解液，摇匀置于冰上裂解 15min。用刮棒将粘稠的细胞裂解物刮至一侧，用枪混匀并移至1.5ml EP管中，4℃ 离心12000rpm，30min。

⑤BCA法检测蛋白质浓度：按试剂盒说明书测定蛋白样品浓度。

2)Western bolt检测：

①配胶：根据上样量选择1.5mm的玻璃板和孔梳，安装好玻璃板，浓度为8％ 的分离胶灌进玻璃模具，用无水乙醇液封分离胶，静置30min。待分离胶凝固后 去除无水乙醇，在分离胶上层加入浓缩胶，插入梳子。待浓缩胶凝固后，均匀平 衡缓缓拔出梳子，用去离子水缓慢冲洗浓缩胶。将凝胶板安装在电泳槽中，加入 电泳液。

②蛋白样品前处理及上样：蛋白样品中加入20x SDS-PAGE的上样缓冲液， 98℃水浴加热5min使蛋白变性。根据蛋白浓度配置，上样量为40ug每孔。另取3ul marker与上样缓冲液配平至与蛋白样品同体积，空白孔中加入等体积的1x上样缓 冲液。

③电泳：正确连接电泳仪与电泳槽正负极电源，先用80V恒压电泳，待样品 点涌入分离胶后，电压调至120V恒压继续电泳，根据蛋白条带大小，电泳至蛋白 目的条带分离清楚后停止，关闭电源。注意不能让蓝色的溴酚蓝条带跑出胶外。

④转膜：小心取下凝胶板，取出凝胶，切除浓缩胶部分。把凝胶紧贴在电泳 液湿润的滤纸上，在胶上覆盖PVDF膜(预先甲醇浸泡激活)，其上再覆盖一张滤 纸，顺序为：海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵。尽可能清除层间气泡 后用转膜夹夹好装到转膜槽中。转膜槽中加入预冷的转膜液。将转膜槽放于4℃ 冰箱内，正确连接好电极，从阴极到阳极依次顺序为海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵。250mA恒流下转膜2.5h。

⑤非特异性结合位点封闭：取出转膜后的PVDF膜，将其放在配置好的5％脱 脂牛奶封闭液中，置于水平摇床室温封闭1h。室温TBST洗三次，每次5min。

⑥一抗孵育：根据抗体说明书推荐浓度，用5％BSA稀释一抗抗体原液。将封 闭后的PVDF膜浸泡在一抗稀释液中，4℃孵育过夜后，室温TBST洗三遍，每次 5min。

⑦二抗孵育：根据抗体说明书推荐浓度，用5％BSA稀释二抗抗体原液。将一 抗孵育后的PVDF膜浸泡在二抗稀释液中，常温孵育1h，室温TBST洗三遍，每次 5min。

⑧显色拍照：避光操作，ECL发光液按说明书配制，用吸水纸吸干PVDF膜水 分后，将发光液滴在PVDF膜上，在成像仪中拍照。

实施例4肿瘤细胞粘附实验

实验目的：检测实施例2所得细胞的粘附能力

实验材料：96孔板，1ml、100ul枪头，单细胞悬液，10％BSA(天骏生物 有限公司，广州，中国)，10％胎牛血清培养基(FBS，Gibco，NY，美国)，0.25％ 胰酶(Gibco，NY，美国)，PBS，多聚甲醛(大茂化学试剂厂，天津，中国)， 结晶紫染色液(碧云天，上海，中国)，纤粘连蛋白(FN，sigma，MO，美国): 将1mg FN溶于2ml灭菌超纯水中，配成浓度为0.5mg/ml原液，每支200μl分装 至0.5ml EP管，-20℃保存。

实验步骤：

1)基质包被培养板：将FN稀释液(40ug/ml)50μl/孔加至96孔培养板，置 4℃冰箱过夜备用，BSA为对照基底。

2)用前PBS洗两次重新水化，10％BSA 50μl/孔以封闭原液非特异结合位点， 孵育60min，PBS漂洗5min×三次备用。

3)取生长良好的细胞制备成单细胞悬液浓度为8×10⁴个/ml，按200μl/孔加入 包被FN的96孔板。37℃，5％CO₂条件下孵育60min。

4)弃去培养基，加入PBS轻柔洗去未粘附细胞，共3次。4％多聚甲醛固定 15min后，PBS洗3次。

5)用结晶紫染色粘附细胞30min，在光镜下在10个随机视野计数粘附的细 胞数。

实施例5肿瘤细胞浸润实验

实验目的：检测实施例2所得细胞的浸润能力。

实验材料：24孔孔径为8μm的Transwell培养板(Corning，NY，美国)、 FN(sigma，MO，美国)、Metrigel基底胶(BD，NY，美国)、DMEM/F12培养 基(Gibco，NY，美国)、胎牛血清培养基(FBS，Gibco，NY，美国)、DMEM 培养基(Gibco，NY，美国)、0.25％胰酶(Gibco，NY，美国)、PBS缓冲液、 BSA(天骏生物有限公司，广州，中国)、结晶紫染液(碧云天，上海，中国)。

实验步骤：

1)有基质胶的孔径为8μm的Transwell制备

①FN包被Transwell上室底膜下表面：

在Transwell上室底部膜的下表面铺FN：吸取FN 10ul(40ng/ml)均匀涂抹 在小室膜的下表面。于4℃冰箱静置48h。若存放时间超过48h，在Transwell下 室添加1ml PBS于4℃浸泡1h后方可使用。

②Transwell上室铺基底胶：

-20℃保存的Matrigel基底胶原液置于4℃过夜融解后，与预冷的DMEM/F12 按比例(DMEM/F12:Matrigel＝8:1)在冰上混匀。在Transwell上室加入50ul稀 释的Matrigel基底胶，置于37℃培养箱中静置30min使Matrigel基底胶聚合成 凝胶。

2)制备细胞悬液：(实施例2所得细胞)

①制备细胞悬液前可先让细胞去血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1～2遍用含BSA

(4ug/ml)的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1～5×10⁵/100μl。

3)接种细胞

①取细胞悬液100μl加入Transwell上室。

②24孔板下室加入500μlDMEM/F12，处理组培养基中加入对应终浓度的 CCL18蛋白(参考图1-3)，对照组加入等量的PBS。一旦出现气泡，要将上室 提起，去除气泡，再将上室放进培养板。

③培养细胞：常规培养12～48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。

4)直接计数法：“贴壁”细胞计数

这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以粘附在Transwell上室膜的下表 面而不会掉到下室里面去。通过细胞染色，可在镜下计数细胞：①用棉签擦去基 质胶和上室内的细胞。②固定：常用4％多聚甲醛固定15min。③染色：常用的 染色方法有结晶紫染色30min。在光镜下在10个随机视野计数“贴壁”的细胞数。

实施例6肿瘤细胞迁移实验

实验目的：检测实施例2所得细胞的迁移能力。

实验材料：参考实施例5。

实验步骤：常用孔径为8.0μm的Transwell培养板，按照实施例5的浸润实验的 方法在上室底膜的下表面包被FN，在上室内不加Matrigel，上室植入肿瘤细胞， 下室加入DMEM/F12，处理组培养基中加入对应终浓度的CCL18蛋白(参考图1-5)， 对照组加入等量的PBS。肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁移，计数进入下室的 细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。原理及方法同实施例4的浸润实验。

统计分析

所有统计分析均用Windows 19.0版SPSS进行(SPSS，IL，美国)。结果以 平均数±标准差((X±SD))表示。多组间两两比较采用t检验或单向方差分析 (ANOVA)。所有实验独立进行，独立实验至少重复三次，每次每个处理至少三 个复孔。所有数据比较p值小于0.05被认为具有统计学意义。

以上实施例3～6中转染siRNA对IV型胶原表达/肝癌细胞浸润迁移效果影 响的实验结果如图1～5所示，从图1可知，CCL18以剂量依赖性的方式促进肝 癌SMMC-7721细胞和HepG2细胞IV型胶原的表达(图1A)；用小分子干扰RNA (siRNA)沉默肝癌SMMC-7721细胞和HepG2细胞中CCL18的受体PITPNM3， 可以抑制CCL18促进肝癌细胞IV型胶原的表达、抑制CCL18促进PITPNM3下 游分子Snail的表达(图1B-C)。用小分子干扰RNA(siRNA)沉默肝癌SMMC-7721细胞和HepG2细胞中Snail的表达，可以抑制CCL18促进肝癌细胞 表达IV型胶原(图1D)。

从图2可知，用小分子干扰RNA(siRNA)沉默肝癌SMMC-7721细胞和 HepG2细胞IV型胶原的表达，可以抑制CCL18促进肝癌粘附(图2A-B)、浸润 (图2C-D)、迁移(图2E-F)的作用。

从图3可知，CCL18以剂量依赖性的方式促进肝癌SMMC-7721细胞和 HepG2细胞粘附(图3A)、浸润(图3B)、迁移(图3C)。

从图4可知，用小分子干扰RNA(siRNA)沉默肝癌SMMC-7721细胞和 HepG2细胞中CCL18的受体PITPNM3的表达，可以抑制CCL18促进肝癌细胞 粘附(图4A-B)、浸润(图4C-D)、迁移(图4E-F)的作用。

从图5可知，用小分子干扰RNA(siRNA)沉默肝癌SMMC-7721细胞和 HepG2细胞中CCL18所激活的信号分子Snail的表达，可以抑制CCL18促进肝 癌细胞粘附(图5A-B)、浸润(图5C-D)、迁移(图5E-F)的作用。

综合上述实验结果与分析内容，可以得出如下结论：

(1)肿瘤相关巨噬细胞来源的CCL18促进肝癌细胞表达IV型胶原，用靶 向CCL18受体PITPNM3和PITPNM3下游分子Snail的siRNA可以抑制CCL18 促进IV型胶原的表达。

(2)肿瘤相关巨噬细胞来源的CCL18促进肝癌细胞粘附于细胞外基质，用 靶向COL4α1基因的siRNA可以抑制CCL18促进肝癌细胞粘附于细胞外基质。

(3)肿瘤相关巨噬细胞来源的CCL18促进肝癌细胞浸润，用靶向COL4α1 基因的siRNA可以抑制CCL18促进肝癌细胞浸润的作用。

(4)肿瘤相关巨噬细胞来源的CCL18促进肝癌细胞迁移，用靶向COL4α1 基因的siRNA可以抑制CCL18促进肝癌细胞迁移的作用。

同样地，上述(2)～(4)的结论也适用于靶向PITPNM3和Snail的siRNA。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明 保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技 术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本 发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州医科大学附属第二医院

<120> 一种沉默IV型胶原表达的siRNA及其应用

<130> 2018

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

uagcgacuaa acacaucaat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

uugauguguu uagucgcuat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccaccugga auuguuauat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

uauaacaauu ccaggugggt t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagcgagau guucaagaat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

uucuugaaca ucucgcucct t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggagaagug gcuucguaat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

uuacgaagcc acuucucccg g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcgcaugau ccugcgcaat t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

uugcgcagga ucaugcgcga g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcgagcugca ggacucuaat t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

uuagaguccu gcagcucgct t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aggacucuaa uccagaguut t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aacucuggau uagaguccut t 21

Claims (1)

1.能沉默IV型胶原表达的siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用；其特征在于，所述siRNA为靶向信号分子Snail的siRNA，其中所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～SEQ IDNO.14所示，所述肿瘤为肝癌。

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