CN102154457A - 一种笼养水貂自咬症的分子标记诊断方法 - Google Patents

Abstract

一种笼养水貂自咬症的分子标记诊断方法属动物基因工程及分子标记技术领域，本发明包括：1.提取笼养水貂个体基因组DNA、建立不同基因池和筛选随机引物；2.获得健康水貂和自咬水貂两组基因池中差异标记基因；3.克隆差异标记基因片段和分析SCAR转化。本发明可对水貂群体进行大规模鉴定，既快速简便，又大幅度降低成本，同时本发明可为初步建立笼养水貂自咬症基因诊断平台、快速清除自咬水貂群体、提高水貂的皮张等级数量奠定基础，也为今后水貂的免疫育种、抗病育种和疾病预防提供指导依据。

Description

一种笼养水貂自咬症的分子标记诊断方法

技术领域

本发明属动物基因工程及分子标记技术领域，具体涉及一种利用随机扩增多态性DNA标记技术，快速筛选出自咬水貂群体与健康水貂群体的差异基因，并利用测序扩增区段标记技术对其进行进一步验证的方法。

背景技术

水貂皮已成为国际裘皮贸易的三大支柱产品之一。其具有针毛挺直、灵活华丽、绒毛丰厚、保暖性强、皮板轻薄、柔韧结实等诸多优点，因而成为小毛细毛类毛皮中的当家品。近年来水貂的养殖在北方地区特别是东北三省呈现积极的养殖态势。而对于种貂的个体鉴定，除繁殖方面的指标外，更重要的是要强调毛绒品质。留选毛绒品质较好的水貂，这对改善和提高全群貂皮质量很有好处。正所谓种瓜得瓜，种豆得豆，因此要获得高质量的水貂皮必须选择优良的水貂为基础。

自咬症是危害笼养水貂的一种慢性疾病，由于自咬症的发生，导致了水貂皮张的损坏、等级下降，已成为水貂养殖业中的突出问题之一。我国1967-1970年已有水貂自咬症发病的报道。国内每年水貂自咬症的发病率约为5％～10％。全世界每年仅水貂皮的生产量约为5000万张，由于自咬症导致的等级下降的皮张在200万～300万张，给养貂业带来了严重的经济损失。

目前，人们对自咬症的致病原因还不够清楚，国内外学者众说不一。但有研究发现，发生自咬症的个体其后代自咬症的发病率较高，自咬症的发病率与遗传有显著的相关性。赵元楷等报道水貂自咬症与遗传有直接的关系，纯种繁育的后代有半数发生自咬症现象。有养殖户反映，自咬症具有隔代遗传倾向。然而，目前自咬水貂在未出现临床症状之前是无法诊断的，人们对自咬水貂个体的诊断都是通过临床观察才诊断出来的。这样就耗费了大量的人力、物力和财力，因此急需一种有效、快速的诊断方法来鉴别自咬水貂个体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用随机扩增多态性标记快速诊断出笼养水貂的自咬个体，并利用结合测序扩增区段标记技术进一步验证差异标记基因是否为自咬水貂所特有的基因，为快速剔除笼养水貂自咬症个体提供简便易行的方法。

本发明包括下列步骤：

1.提取笼养水貂个体基因组DNA、建立不同基因池和筛选随机引物，具体包括：

1.1用酚/氯仿法提取健康水貂和自咬水貂基因组DNA，所记录的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.6～1.8之间的DNA质量，可满足实验要求，根据记录的OD₂₆₀数值及稀释倍数，换算出待测DNA的浓度，并作相应的稀释，以50ng/μL分装，作为工作液，并在4℃条件下保存；

1.2将健康个体和自咬个体的基因组工作液分别取出20μL，混合构成一个总基因池DNA，再将上述健康水貂和自咬水貂两组不同的池DNA各取10μL分别混合，制成两组不同的DNA池；

1.3随机选取上海生工生物工程公司合成的D系列和S系列随机引物各100条，用混合成的总基因池做模板，筛选出多态性丰富且条带清晰的引物，再进行同一条件的3-5次重复，进一步筛选主带重复性好的引物。

2.获取健康水貂和自咬水貂两组基因池中差异标记基因，具体包括：

2.1用筛选出来多态性丰富且条带清晰、主带重复性好的引物分别对健康水貂和自咬水貂两组池DNA进行PCR扩增，每个反应至少3次重复，并设立不含模板的阴性对照；

2.2从PCR仪上取出0.2mL的PCR管，每管取5μLPCR产物，加3μL的Loading Buffer混匀后上样，用2％的含有EB的琼脂糖凝胶，在100V的电压下电泳；为使试验误差减到最低程度，操作过程中采用同一批号试剂，一次性混合分装，在同一台PCR仪上运行，并使用相同规格的电泳槽和统一的电压，另外每次PCR反应体系的分装加样在实验室同一位置进行；

2.3对出现明显的差异标记序列，再进行2次重复扩增分析、确认。

3.克隆差异标记基因片段和分析SCAR转化，具体包括：

3.1将最终确定的随机扩增多态性差异标记片断进行回收纯化，将回收片断连接到PMD-18T载体中，然后将连接液转化到大肠杆菌(JM109)中进行克隆，克隆后的菌液或质粒送到生物公司进行测序；

3.2设计测序扩增区段标记特异引物：根据测得的差异标记序列结果，分别在其两端包括原随机引物的10个bp在内，再延长8-12个bp，设计2-4对引物；

3.3利用SCAR标记技术，用设计的特异引物对健康水貂个体和自咬水貂个体分别进行特异性扩增，记录扩增结果，验证其是否为健康水貂和自咬水貂之间的差异标记。

水貂作为一种特种经济动物，其笼养状态下常发生的自咬症目前尚无有效的治疗办法，自咬症的发生导致了水貂皮张的损坏、等级下降，已成为水貂养殖业中的突出问题之一，而养殖水貂的主要目的是获得高质量的水貂皮，因此提高毛皮质量成了水貂饲养过程中最紧迫的因素。

本发明用随机扩增多态性DNA标记结合测序扩增区段标记技术方法筛选笼养水貂自咬群体，可在笼养水貂刚出生时即鉴别出健康与自咬个体，为自咬水貂的早期淘汰提供新方法。

用本发明提供的笼养水貂自咬症的分子标记诊断方法鉴定水貂等毛皮动物是否健康时，可以在PCR产物中直接加入EB，然后在紫外灯下观察有无荧光反应来判断PCR扩增反应结果，同时可随机抽取部分PCR扩增结果呈阳性的产物，进行电泳来检验快速判断的正确性。因此，在实际生产中，可以用此简化方法对水貂群体进行大规模鉴定，既快速简便，又大幅度降低成本，本发明为初步建立笼养水貂自咬症基因诊断平台、为快速清除自咬水貂群体、提高水貂的皮张等级数量奠定基础，也为今后水貂的免疫育种、抗病育种和疾病预防提供指导依据。

具体实施方式

本发明包括下列步骤：

1.提取笼养水貂个体基因组DNA、建立不同基因池和筛选随机引物，具体包括：

1.1用酚/氯仿法提取健康水貂和自咬水貂基因组DNA，所记录的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.6～1.8之间的DNA质量，可满足实验要求，根据记录的OD₂₆₀数值及稀释倍数，换算出待测DNA的浓度，并作相应的稀释，以50ng/μL分装，作为工作液，并在4℃条件下保存；

1.2将健康个体和自咬个体的基因组工作液分别取出20μL，混合构成一个总基因池DNA；再将上述健康水貂和自咬水貂两组不同的池DNA各取10μL分别混合，制成两组不同的DNA池；

1.3随机选取上海生工生物工程公司合成的D系列和S系列随机引物各100条，用混合成的总基因池做模板，筛选出多态性丰富且条带清晰的引物，再进行同一条件的3-5次重复，进一步筛选主带重复性好的引物。

2.获取健康水貂和自咬水貂两组基因池中差异标记基因，具体包括：

2.1用筛选出来多态性丰富且条带清晰、主带重复性好的引物分别对健康水貂和自咬水貂两组池DNA进行PCR扩增，每个反应至少3次重复，并设立不含模板的阴性对照；

2.2从PCR仪上取出0.2mL的PCR管，每管取5μLPCR产物，加3μL的Loading Buffer混匀后上样，用2％的含有EB的琼脂糖凝胶，在100V的电压下电泳；操作过程中采用同一批号试剂，一次性混合分装，在同一台PCR仪上运行，并使用相同规格的电泳槽和统一的电压，另外每次PCR反应体系的分装加样在实验室同一位置进行；

2.3对出现明显的差异标记序列，再进行2次重复扩增分析、确认。

3.克隆差异标记基因片段和分析SCAR转化，具体包括：

3.1将最终确定的随机扩增多态性差异标记片断进行回收纯化，将回收片断连接到PMD-18T载体中，然后将连接液转化到大肠杆菌(JM109)中进行克隆，克隆后的菌液或质粒送到生物公司进行测序；

3.2设计测序扩增区段标记特异引物：根据测得的差异标记序列结果，分别在其两端包括原随机引物的10个bp在内，再延长8-12个bp，设计2-4对引物；

3.3利用SCAR标记技术，用设计的特异引物对健康水貂个体和自咬水貂个体分别进行特异性扩增，记录扩增结果，验证其是否为健康水貂和自咬水貂之间的差异标记。

Claims (4)

1.一种笼养水貂自咬症的分子标记诊断方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)提取笼养水貂个体基因组DNA、建立不同基因池和筛选随机引物；

(2)获取健康水貂和自咬水貂两组基因池中差异标记基因；

(3)克隆差异标记基因片段和分析SCAR转化。

2.按权利要求1所述的笼养水貂自咬症的分子标记诊断方法，其特征在于步骤(1)中所述的提取笼养水貂个体基因组DNA、建立不同基因池和筛选随机引物包括下列步骤：

1.1用酚/氯仿法提取健康水貂和自咬水貂基因组DNA，所记录的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.6～1.8之间的DNA质量，可满足实验要求，根据记录的OD₂₆₀数值及稀释倍数，换算出待测DNA的浓度，并作相应的稀释，以50ng/μL分装，作为工作液，并在4℃条件下保存；

1.2将健康个体和自咬个体的基因组工作液分别取出20μL，混合构成一个总基因池DNA，再将上述健康水貂和自咬水貂两组不同的池DNA各取10μL分别混合，制成两组不同的DNA池；

1.3随机选取上海生工生物工程公司合成的D系列和S系列随机引物各100条，用混合成的总基因池做模板，筛选出多态性丰富且条带清晰的引物，再进行同一条件的3-5次重复，进一步筛选主带重复性好的引物。

3.按权利要求1所述的笼养水貂自咬症的分子标记诊断方法，其特征在于步骤(2)中所述的获取健康水貂和自咬水貂两组基因池中差异标记基因包括下列步骤：

2.1用筛选出来多态性丰富且条带清晰、主带重复性好的引物分别对健康水貂和自咬水貂两组池DNA进行PCR扩增，每个反应至少3次重复，并设立不含模板的阴性对照；

2.2从PCR仪上取出0.2mL的PCR管，每管取5μLPCR产物，加3μL的Loading Buffer混匀后上样，用2％的含有EB的琼脂糖凝胶，在100V的电压下电泳；操作过程中采用同一批号试剂，一次性混合分装，在同一台PCR仪上运行，并使用相同规格的电泳槽和统一的电压，另外每次PCR反应体系的分装加样在实验室同一位置进行；

2.3对出现明显的差异标记序列，再进行2次重复扩增分析、确认。

4.按权利要求1所述的笼养水貂自咬症的分子标记诊断方法，其特征在于步骤(3)中所述的克隆差异标记基因片段和分析SCAR转化包括下列步骤：

3.1将最终确定的随机扩增多态性差异标记片断进行回收纯化，将回收片断连接到PMD-18T载体中，然后将连接液转化到大肠杆菌(JM109)中进行克隆，克隆后的菌液或质粒送到生物公司进行测序；

3.2设计测序扩增区段标记特异引物：根据测得的差异标记序列结果，分别在其两端包括原随机引物的10个bp在内，再延长8-12个bp，设计2-4对引物；

3.3利用SCAR标记技术，用设计的特异引物对健康水貂个体和自咬水貂个体分别进行特异性扩增，记录扩增结果，验证其是否为健康水貂和自咬水貂之间的差异标记。