CN102154416A

CN102154416A - 一种固定化微生物细胞转化神经节苷脂的方法

Info

Publication number: CN102154416A
Application number: CN2010106092691A
Authority: CN
Inventors: 赵志全; 董惠钧
Original assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-01-18
Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2031-01-18
Also published as: CN102154416B

Abstract

本发明公开了一种固定化微生物细胞转化神经节苷脂的方法，能够专一性转化神经节苷脂生成单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)，解决了酸法水解转化率低、容易产生无活性脱唾液酸神经节苷脂的问题，同时解决了非固定化细胞转化法容易掺入培养基成分或微生物代谢物杂质的问题。本发明用丝素凝胶固定化细胞后填充柱型反应床，在一定反应条件下将待转化神经节苷脂反向流过填充柱，将神经节苷脂转化为GM1。

Description

一种固定化微生物细胞转化神经节苷脂的方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种固定化微生物细胞转化神经节苷脂制备单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1）的方法。

背景技术

神经节苷脂（Ganglidosides, GLS）由一类含唾液酸的亲水寡糖通过β-1,1糖苷键与疏水的神经酰胺连接而成的两性大分子。其中含有一个唾液酸的GLS称为单唾液酸四己糖神经节苷脂（Monosialotetrahexosylganglioside, GM1），GM1能够通过血脑屏障，聚集受损脑区嵌入细胞膜，模仿内源性GM1发挥作用，能够促进神经细胞生存、轴突生长和突触生长的神经重构，恢复由于各种原因引起的中枢神经系统损伤的功能，用于治疗颅脑损伤、神经退化、脑水肿、帕金森综合症等脑部疾病。

神经节苷脂结构

GM₁: I, II, III, IV, V, A; GM₂: I, II, III, IV, A; GM₃: I, II, III, A;

GD_1a: I, II, III, IV, V, A, B; GD_1b: I, II, III, IV, V, A, C; GT_1b: I, II, III, IV, V, A, B, C。

GLS在动物脑组织中含量丰富，在脑灰质中含量较高，例如猪脑和牛脑，其中猪脑GLS的总含量为猪全脑湿重的0.0894%，高于牛脑的0.0536%，而且牛脑提取物容易被病毒污染，所以猪脑是理想的GM1来源。猪脑GLS的主要成分有GM1，GM2，GD1a，GD1b和GT1b。GM1的生产工艺大多采用溶剂萃取、酸法水解转化和柱层析等分离提取程序从动物脑组织中制备GM1，其中水解转化是增加GM1含量，提高总收率的关键步骤。目前神经节苷脂的水解方法为酸法、唾液酸水解酶法和微生物法。酶法和微生物法的实质是一样的，区别在于后者不需分离纯化微生物分泌的唾液酸水解酶。专利CN101108868涉及了一种酸水解转化神经节苷脂的方法，所用酸为盐酸，pH3.0~4.0，转化条件为常温常压。该方法在常温下进行转化效率低，而且盐酸为强酸，调节pH时会局部过酸，导致神经节苷脂降解。专利US4868292公开了一种酸水解转化神经节苷脂方法，该方法是在pH4~6.5、80℃~100℃条件下转化神经节苷脂生成GM1，该方法转化率高，转化时间短，但是该方法会产生无生理活性的脱唾液酸GM1，游离唾液酸含量高。专利CN101328196、US5296360和US5275939分别涉及了一种利用酶法水解转化神经节苷脂的方法，这些方法是使用商品化的唾液酸酶在转化缓冲液中，在一定条件下转化神经节苷脂，该方法的缺点主要是唾液酸酶用量大，价格昂贵，转化成本高。专利CN1570080和US5756314分别描述了一种利用微生物进行神经节苷脂转化的方法，转化后GM1含量显著提高，这些方法都是在微生物发酵液中加入神经节苷脂进行转化，转化后需分离纯化去除菌体和代谢物，分离纯化难度大，会掺入过敏源物质，工艺指标难以控制，产品质量不稳定。还有专利CN1814610、CN1379034和CN85102590分别描述了一种制备单唾液酸神经节苷脂的方法，但是这些方法都没有涉及神经节苷脂的水解转化，方法收率低，产品成本高。

综上所述，单唾液酸四己糖神经节苷脂制备中水解转化环节是提高GM1含量、总收率和降低成本的关键步骤。现有水解转化的技术方法都存在着一些不足和缺点，例如酸水解会产生无生理活性副产物脱唾液酸GM1，转化率偏低；商品化唾液酸酶法水解成本高，不适宜大规模生产；相比酸法和酶法转化，微生物转化水解具有成本低，转化率高等优点，但是本身操作过程中不可避免的会引入培养基、微生物及其代谢产物等杂质，给下游的分离纯化带来难度，增加了产品的不稳定性，使产品质量不可控。

采用细胞固定化方法制备单唾液酸四己糖神经节苷脂将克服上述方法的缺陷，但目前的细胞固定化方法存在固定化细胞存活低，生产运行时间短，产品收率不高等问题。

发明内容

本发明通过优化丝素凝胶固定化细胞的条件和参数，实现了神经节苷脂的连续转化，稳定了产品质量，提高了转化效率，提高了产品收率和运行时间。

本发明所采用的技术方案具体步骤为：

a. 用合适培养基在一定条件下培养转化神经节苷脂的菌株，将活化后的斜面菌种接种于种子培养基中培养成熟后再转接于发酵罐中，一定温度条件下搅拌通气培养并离心收集细胞待用；

b. 制备蚕丝素凝胶作为固定化材料，将家蚕蚕丝下脚料粉碎后用纯净水浸泡，高温条件下进行脱胶处理，丝素脱胶温度为110℃~130℃，时间为1~3小时，用纯净水洗净后加热溶解于氯化钙溶液中，过滤后减压浓缩至浓度为80g/L ~120g/L，即获得家蚕丝素水凝胶；

c. 用固定化材料固定化细胞，固定化方法是包埋和交联相结合，在无菌条件下，将丝素水凝胶加热溶解与菌悬液混匀后放置在4℃冷却凝结，然后切成小块，将包埋菌体的凝胶块在含有浓度为1%~1.5%的戊二醛溶液中交联处理1~2小时，用纯净水洗涤干净后再置于KCl溶液中浸泡硬化，用纯净水洗涤干净后放置4℃保存待用；

d. 制备转化反应缓冲液，缓冲液组成为2%磷酸氢二铵，1.5%磷酸二氢钾，0.5%硫酸镁，0.5%醋酸钠，0.05%硫酸钙，pH值为5.0~6.5；

e. 填充床反应装置：将固定化绿色小单胞菌细胞装填带有水循环夹套的玻璃制柱子，形成二级串联模式，用蠕动泵将神经节苷脂总脂溶液自下而上依次泵入反应器中进行转化，整个装置图如附图1所示；

f. 神经节苷脂连续转化：称取神经节苷脂总脂溶于转化缓冲液中，并调节pH，经过滤除去不溶物。开启水循环加热装置，保持温度25℃~30℃恒定，用蠕动泵将需转化的神经节苷脂总脂溶液从一级反应器底部注入，从顶部溢出后进入二级反应器的底部，最后从顶部流出，并控制流速3~6mL/min。用HPLC监测起始阶段和流出段神经节苷脂的转化情况。

其中，步骤a所述菌株可以选择绿色小单胞菌（Micromonospora viridifaciens，ATCC 31146）或乳酪短杆菌（Brevibacterium casei，ATCC 35513）。经测定分泌唾液酸酶活性，绿色小单胞菌分泌的唾液酸酶活性为6~8U/mL，乳酪短杆菌分泌的唾液酸酶活性为3~5U/mL。因此优选绿色小单胞菌作为固定化微生物。培养绿色小单胞菌的培养基为多聚乙酰神经氨酸，30g/L淀粉，15g/L硫酸铵，1g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁，0.3g/L硫酸锌，其中多聚乙酰神经氨酸是生产唾液酸酶的诱导物，在一定范围内其浓度的高低与唾液酸酶活性正相关，添加量为2~8g/L。优选地培养基组成为5g/L多聚乙酰神经氨酸， 30g/L淀粉，15g/L硫酸铵，1g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁，0.3g/L硫酸锌。

培养乳酪短杆菌的培养基与上述培养基基本一致，只是将淀粉替换为葡萄糖。

步骤b在制备丝素凝胶时，脱胶处理条件为温度110℃~130℃，时间为1~3小时，优选温度121℃，时间为2小时。为确保凝胶有一定的抗压强度和合适的孔径，丝素凝胶浓度控制在80~120g/L。

步骤c中固定化细胞的方法有多种，可以是交联法、包埋法或交联/包埋法，经实验确定，优选交联和包埋结合的方法，交联剂选用戊二醛，浓度控制在1%~1.5%，时间为1~2小时。

步骤f利用固定化细胞填充反应柱转化，转化温度和流速是重要参数，转化温度优选为25℃~30℃，进一步优选为30℃，神经节苷脂的转化反应缓冲液流速控制在3~6 mL/min，优选5 mL/min，即可保证转化率又可提高转化效率。

本发明所述技术方案通过筛选固定化材料，优选丝素凝胶作为固定材料；优化固定方法和条件，调整转化反应缓冲液、转化温度、流速等，使神经节苷脂转化实现连续化操作，转化效率达到75~85%。多唾液酸神经节苷脂基本完全转化为GM1，并且未检测到脱唾液酸神经节苷脂（GA）。

附图说明

图1、固定化微生物细胞填充柱转化装置

具体实施方式：

本发明由下述实施例进一步说明，但本发明的技术方案并不限于如下实施例。

实施例1

（1）细胞培养

将斜面培养基上培养成熟的绿色小单胞菌转接入4只装有250ml种子培养基的1L三角瓶中（葡萄糖20 g/L, 蛋白胨 15 g/L，酵母粉10 g/L， pH 7.2），28℃，250rpm培养48小时，然后按10%接种量接入装有10 L发酵培养基（多聚乙酰神经氨酸 2 g/L，淀粉30 g/L，硫酸铵 15 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸锌 0.3 g/L）的发酵罐中，28℃条件下搅拌通气培养72小时（通气比：0.4~1.0 vvm），连续流离心收集细胞，共获得约2000g湿菌体。用生理盐水（0.9%）洗涤两次后悬浮于pH值为6.1的转化反应缓冲液中制备成菌悬液4L。

（2）多孔丝素凝胶制备

称取大约4kg废弃蚕丝下脚料，剪切粉碎后浸泡于90℃碱性水溶液中（pH 8） 30min，过滤并用纯净水洗至中性后，继续在121℃和高压条件下脱胶处理2小时，用纯净水洗净后加热溶解于氯化钙溶液中，过滤除去不溶性杂质后减压浓缩至丝素浓度为80 g/L，获得家蚕丝素水凝胶25L。

（3）制备固定化细胞

在无菌操作间，取15L丝素水凝胶加热至45℃与菌悬液混匀后放置在4℃冷却成块，然后切成1cm×1cm小方块，将包埋菌体的凝胶块在含有1%戊二醛溶液中交联处理1小时，用纯净水洗涤干净戊二醛后再置于3% KCl溶液中浸泡硬化3小时，用纯净水洗涤干净后放置4℃保存待用。

（4）二级串联反应器转化反应

事先将反应缓冲液注入反应器中，然后将固定化细胞缓慢沉入反应器；开启热交换器使循环水温度升至25℃；将溶解有1000g神经节苷脂总脂的10L反应器按照6 mL/min泵入反应器中，经过约30小时反应转化，GM1含量由20%提高至67%，多唾液酸神经节苷脂基本完全转化为GM1，并且未检测到脱唾液酸神经节苷脂（GA）。

实施例2

（1）细胞培养

将斜面培养基上培养成熟的绿色小单孢菌转接入4只装有250ml种子培养基的1L三角瓶中（葡萄糖20 g/L, 蛋白胨 15 g/L，酵母粉10 g/L， pH 7.2），28℃，250rpm培养48小时，然后按10%接种量接入装有10L发酵培养基（多聚乙酰神经氨酸 5 g/L，淀粉30 g/L，硫酸铵 15 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸锌 0.3 g/L）的发酵罐中，28℃条件下搅拌通气培养36小时（通气比：0.4~1.0 vvm），连续流离心收集细胞，共获得约1500g湿菌体。用生理盐水（0.9%）洗涤两次后悬浮于pH值为6.4的转化反应缓冲液中制备成菌悬液3L。

（2）多孔丝素凝胶制备

称取大约4kg废弃蚕丝下脚料，剪切粉碎后浸泡于90℃碱性水溶液中（pH 8） 30min，过滤并用纯净水洗至中性后，继续在121℃和高压条件下脱胶处理2小时，用纯净水洗净后加热溶解于氯化钙溶液中，过滤除去不溶性杂质后减压浓缩至丝素浓度为80 g/L，获得家蚕丝素水凝胶24L。

（3）制备固定化细胞

（4）二级串联反应器转化反应

事先将反应缓冲液注入反应器中，然后将固定化细胞缓慢沉入反应器；开启热交换器使循环水温度升至30℃；将溶解有1000g神经节苷脂总脂的10L反应器按照6 mL/min泵入反应器中，经过约30小时反应转化，GM1含量由21%提高至65%，多唾液酸神经节苷脂基本完全转化为GM1，并且未检测到脱唾液酸神经节苷脂（GA）。

实施例3

（1）细胞培养

将斜面培养基上培养成熟的绿色小单胞菌转接入4只装有250ml种子培养基的1L三角瓶中（葡萄糖20 g/L, 蛋白胨 15 g/L，酵母粉10 g/L， pH 7.2），28℃，250rpm培养48小时，然后按10%接种量接入装有10L发酵培养基（多聚乙酰神经氨酸 8 g/L，淀粉30 g/L，硫酸铵 15 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸锌 0.3 g/L）的发酵罐中，28℃条件下搅拌通气培养72小时（通气比：0.4~1.0 vvm），连续流离心收集细胞，共获得约2300g湿菌体。用生理盐水（0.9%）洗涤两次后悬浮于pH值为6.2的转化反应缓冲液中制备成菌悬液4.6L。

（2）多孔丝素凝胶制备

称取大约4kg废弃蚕丝下脚料，剪切粉碎后浸泡于90℃碱性水溶液中（pH 8） 30min，过滤并用纯净水洗至中性后，继续在121℃和高压条件下脱胶处理2小时，用纯净水洗净后加热溶解于氯化钙溶液中，过滤除去不溶性杂质后减压浓缩至丝素浓度为100 g/L，获得家蚕丝素水凝胶22L。

（3）固定化细胞制备

（4）二级串联反应器转化反应

事先将反应缓冲液注入反应器中，然后将固定化细胞缓慢沉入反应器；开启热交换器使循环水温度升至30℃；将溶解有1000g神经节苷脂总脂的10L反应器按照5 mL/min泵入反应器中，经过约38小时反应转化，GM1含量由20%提高至73%，多唾液酸神经节苷脂基本完全转化为GM1，并且未检测到脱唾液酸神经节苷脂（GA）。

实施例4

（1）细胞培养

将斜面培养基上培养成熟的乳酪短杆菌转接入4只装有250ml种子培养基的1L三角瓶中（葡萄糖20 g/L, 蛋白胨 15 g/L，酵母粉10 g/L， pH 7.2），28℃，250rpm培养48小时，然后按10%接种量接入装有10L发酵培养基（多聚乙酰神经氨酸 6 g/L，葡萄糖30 g/L，硫酸铵 15 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，硫酸锌 0.3 g/L）的发酵罐中，28℃条件下搅拌通气培养72小时（通气比：0.4~1.0 vvm），连续流离心收集细胞，共获得约1700g湿菌体。用生理盐水（0.9%）洗涤两次后悬浮于pH值为5.4的转化反应缓冲液中制备成菌悬液3.4L。

（2）多孔丝素凝胶制备

称取大约4kg废弃蚕丝下脚料，剪切粉碎后浸泡于90℃碱性水溶液中（pH 8） 30min，过滤并用纯净水洗至中性后，继续在121℃和高压条件下脱胶处理2小时，用纯净水洗净后加热溶解于氯化钙溶液中，过滤除去不溶性杂质后减压浓缩至丝素浓度为100 g/L，获得家蚕丝素水凝胶19L。

（3）固定化细胞制备

（4）二级串联反应器转化反应

事先将反应缓冲液注入反应器中，然后将固定化细胞缓慢沉入反应器；开启热交换器使循环水温度升至30℃；将溶解有1000g神经节苷脂总脂的10L反应器按照3 mL/min泵入反应器中，经过约65小时反应转化，GM1含量由16%提高至53%，多唾液酸神经节苷脂基本完全转化为GM1，并且未检测到脱唾液酸神经节苷脂（GA）。

Claims

1.一种固定化微生物细胞转化神经节苷脂的方法，包括以下步骤：

a. 培养转化神经节苷脂的菌株，离心收集细胞；

b. 制备蚕丝素凝胶作为固定化材料：将家蚕蚕丝下脚料粉碎后用纯净水浸泡，高温条件下进行脱胶处理，丝素脱胶温度为110℃~130℃，时间为1~3小时，用纯净水洗净后加热溶解于氯化钙溶液中，过滤后减压浓缩至浓度为80g/L ~120g/L，即获得家蚕丝素水凝胶；

c. 用固定化材料固定化细胞：固定化方法是包埋和交联相结合，在无菌条件下，将丝素水凝胶加热溶解与菌体混匀后放置在4℃冷却凝结，然后切成小块，将包埋菌体的凝胶块在含有浓度为1%~1.5%的戊二醛溶液中交联处理1~2小时，用纯净水洗涤干净后再置于KCl溶液中浸泡硬化，用纯净水洗涤干净后放置4℃保存待用；

d. 制备转化反应缓冲液：缓冲液组成为2%磷酸氢二铵，1.5%磷酸二氢钾，0.5%硫酸镁，0.5%醋酸钠，0.05%硫酸钙，pH值为5.0~6.5；

e. 将固定化微生物细胞悬浮于反应缓冲液中填充反应柱装置；

f. 在3~6mL/min流速、25℃~30℃温度条件下将神经节苷脂逆向流经反应柱，进行生物转化反应，使神经节苷脂转化为单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1）。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a所述转化神经节苷脂的菌株为绿色小单胞菌（Micromonospora viridifaciens，ATCC 31146）或乳酪短杆菌（Brevibacterium casei，ATCC 35513）。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤a所述转化神经节苷脂的菌株为绿色小单胞菌（Micromonospora viridifaciens，ATCC 31146），培养该菌株时所用培养基成分为多聚乙酰神经氨酸2~8g/L，淀粉30g/L，硫酸铵15g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锌0.3g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b所述脱胶温度为121℃，时间为2小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e所述反应填充柱为二级或多级串联模式。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤f所述转化温度为30℃，流速为5 mL/min。