CN102154280B

CN102154280B - 猪微卫星标记的复合扩增的方法及其专用引物

Info

Publication number: CN102154280B
Application number: CN2011100558349A
Authority: CN
Inventors: 张颖; 崔文涛; 程文科; 黄宏刚; 裴黎; 凃政; 徐小玉
Original assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2031-03-08
Also published as: CN102154280A

Abstract

本发明公开了一种猪微卫星标记的复合扩增的方法及其专用引物。本发明提供的引物组合物由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成。实验证明：用选取的特定比例的特定引物对进行复合扩增)与单重PCR扩增得到的数据完全一致，从而证实了本发明提供的十重PCR的准确性与可行性。本发明提供的复合扩增方法在猪亲子鉴定、育种及生产有重大的意义。

Description

猪微卫星标记的复合扩增的方法及其专用引物

技术领域

本发明涉及猪微卫星标记的复合扩增的方法及其专用引物。

背景技术

微卫星(microsatellite)，一般指基因组中由短的重复单元(一般为1～6个碱基)组成的DNA串联重复序列。微卫星标记(microsatellite)，又称为短串联重复序列(simple tandem repeats，STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。

微卫星标记在目前应用极为广泛，具有以下显著特点：1)在高等动物的基因组内存在广泛的分布，据文献报道大约每间隔10-50kb就存在着一个微卫星标记；2)遗传稳定，符合孟德尔遗传定律，多态性高，信息含量丰富，许多微卫星位点都具有5个以上的等位基因；3)呈共显性遗传，易于区分纯合型和杂合型；4)通过PCR扩增和电泳分型，可以直接获得个体基因型，检测所需检材量少，灵敏度成功率高；5)大部分微卫星标记是位于基因组非编码区内的，不受自然和人工选择的影响，是一种中性标记。因此，在人类法医学鉴定、动物系谱分析和个体及亲缘关系鉴定、分析群体的遗传结构及群体间的遗传距离、监测育种和遗传操作效应、构建基因图谱、寻找与动物各个性状位点连锁的分组遗传标记等方面，微卫星标记具有重要的作用。

微卫星标记的检测包括DNA的提取、PCR扩增和基因型分型三个步骤。针对亲子鉴定、个体鉴定、遗传变异分析、系谱鉴定及育种选择等情况，通常需要对多个微卫星位点进行扩增和检测以达到所要求的精确度，这样实验成本高昂、费时长、工作量大。借助复合扩增技术(mutiplex PCR)能显著提高检测效率并极大的降低实验成本。其原理是，在同一个反应试管或者反应体系中加入多对引物，同时扩增检测多个目标序列，从而大大的减少了多次单独PCR扩增和检测的费用，缩短了实验时间、成本，提高了检测效率。然而，为了保证多个目的片段同时在一个PCR反应体系中特异性扩增，引物组合的选择以及反应条件的优化就格外重要了。这就需要多次反复的实验来摸索了。

微卫星的不同等位基因往往只是相差2到5个碱基，因此就需要高分辨率的电泳来区分。分型方法最早是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合放射自显影或者硝酸银染色来进行的，这种方法操作复杂且分型的条带不易读取，准确率差；自上世纪末以来，荧光标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光标记毛细管电泳逐渐兴起并替代传统方法，其操作方便、准确率也大大提高。针对多个位点，采用不同颜色的荧光标记引物，利用基于荧光扫描技术的遗传分析仪，结合分子量标准自动计算等位基因大小，能够实现高通量和半自动化的微卫星分型。

目前，微卫星标记检测试剂盒在一些物种上已经商业化了，如人亲子鉴定的检测试剂盒、牛的微卫星标记检测试剂盒等等；但在猪上面并没有出现。我国是世界上养猪生产和猪肉消费第一大国，近年来，随着人们对亲子鉴定技术的了解越来越多，许多民事和刑事案件中与猪相关的亲权鉴定和个体识别检验要求也越来越多，另外养猪业也是我国畜牧业和农村支柱产业的重要组成部分，在猪遗传育种方面，国内还相对薄弱；利用微卫星标记检测对猪的亲子鉴定、育种及生产有重大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于猪微卫星标记的复合扩增的引物组合物。

本发明提供的引物组合物由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成；其中，

引物对1由序列表中序列1所示的DNA和序列表中序列2所示的DNA组成；引物对2由序列表中序列3所示的DNA和序列表中序列4所示的DNA组成；引物对3由序列表中序列5所示的DNA和序列表中序列6所示的DNA组成；引物对4由序列表中序列7所示的DNA和序列表中序列8所示的DNA组成；引物对5由序列表中序列9所示的DNA和序列表中序列10所示的DNA组成；引物对6由序列表中序列11所示的DNA和序列表中序列12所示的DNA组成；引物对7由序列表中序列13所示的DNA和序列表中序列14所示的DNA组成；引物对8由序列表中序列15所示的DNA和序列表中序列16所示的DNA组成；引物对9由序列表中序列17所示的DNA和序列表中序列18所示的DNA组成；引物对10由序列表中序列19所示的DNA和序列表中序列20所示的DNA组成。

上述引物组合物中，每对引物对中的两条引物之间的摩尔比为1∶1。

进一步，上述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10的摩尔比是：5∶1∶4∶3∶7∶4∶3∶4∶5∶4。

上述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10均单独包装或整体包装。

含有上述引物组合物的试剂盒也属于本发明的保护范围之内。

本发明的另一目的在于提供一种猪微卫星标记的复合扩增方法。

本发明提供的猪微卫星标记的复合扩增方法，包括如下步骤：用上述引物组合物进行PCR扩增。

上述PCR扩增条件是：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。

上述猪微卫星标记选自下述10个微卫星位点中的至少一个位点：SW240、SW951、SW857、S0155、S0386、SW902、S0101、S0225、S0227和S0355。

上述的复合扩增方法在动物个体识别和/或亲子鉴定中的应用也属于本发明的保护范围之内。

上述动物可以为猪。

实验证明：实施例3步骤一中用选取的特定比例的特定引物对进行复合扩增(图1-图4)与实施例2单重PCR扩增得到的数据(表2、3和4)完全一致，从而证实了本发明提供的十重PCR的准确性与可行性。

附图说明

图1：是10个微卫星位点SW240、SW951、SW857、S0155、S0386、SW902、S0101、S0225、S0227、S0355的复合扩增在ABI3700测序仪的测序峰图。

图2：是10个微卫星位点复合扩增的测序峰图的分荧光颜色显示，图中所示为蓝色荧光标记的SW240、S0155、S0225和S0227位点峰图。

图3：是10个微卫星位点复合扩增的测序峰图的分荧光颜色显示，图中所示为绿色荧光标记的SW951、S0386和S0101位点峰图。

图4：是10个微卫星位点复合扩增的测序峰图的分荧光颜色显示，图中所示为黑色荧光标记的SW857、SW902和S0355位点峰图。

图5：是对照组10个微卫星位点在各引物浓度一致的条件下复合扩增的测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：微卫星标记的选择

标记选择原则

通用性：美国猪基因组协作计划推荐用于全球猪遗传多样性研究的微卫星标记；

分布广：挑选的10个座位分布于10条染色体上；

多态性：在普通猪群中的等位基因数为5-22个。

所选择的微卫星标记及荧光标记如下表1：

表1：猪微卫星检测位点信息

实施例2：微卫星标记位点的单重PCR扩增和基因分型

1、DNA的提取和检测

参考分子克隆实验指南，采用常规的酚抽提法，对采自山东青岛的具有系谱记录的长白猪耳朵组织样品进行DNA提取。将提取到的DNA溶于TE中，-20℃保存。用琼脂糖凝胶电泳和核酸仪双重检测DNA的纯度和浓度，然后稀释到50ng/ul备用。

2、PCR扩增

PCR反应总体积为20μL，其中模板DNA为100ng，含10×buffer(含Mg2+，Takara)，dNTP终浓度为75μmol/L，引物终浓度为0.3μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Takara)，不足部分以双蒸水补足。

进行每对引物的梯度PCR扩增，摸索出合适的退火温度。最适退火温度见表1最后一列。

3、基因分型

(1)PCR产物的变性

若2％的琼脂糖检测的条带亮度基本相同，即PCR的扩增效率基本相同，则FAM、HEX、TAMRA三种标记的三个位点的PCR产物分别取1ul，加到每孔含8.5ul的甲酰胺和内标的96孔板上(860ul甲酰胺加10ulGeneScanTM-500LIZTM，混匀，分装到96孔板上)，95℃变性5分钟，迅速放在冰上。待96孔板冷了后，用铝箔纸包好，4℃保存，备用。

(2)ABI3700测序仪检测

含变性后的PCR产物的96孔板，放入ABI3700 Genetic Analyzer内进行分析，原始峰图用GeneMarkerV1.5进行分析，确定特定位点各个体的峰形和大小，判定个体的基因型。

(3)原始数据的校对

将ABI3700 Genetic Analyzer自动输出的数据与原始峰图逐一校对，判定微卫星座位的峰形，确定每一个个体的基因型，确保原始数据的准确无误。具体数据结果见表2、表3和表4。

表2：S0155、S0386、SW902三个微卫星位点的部分分型结果

其中L72278为父本，L62001为母本，L62001-1和L62001-2为父本与母本的后代。

表3：SW240、SW951、SW857三个微卫星位点的部分分型结果

表4：S0225、S0101、S0227和S0355四个微卫星位点的部分分型结果

实施例3：微卫星标记位点的复合扩增和基因分型

一、实验组

1、微卫星标记位点组合的选择

本发明所涉及的10重微卫星位点复合扩增组合是申请人经过创造性劳动挑选的，其挑选依据有以下几点：

多态性高

各个位点之间不连锁

各位点引物退火温度相近

片段大小间隔合适，易于检测

片段相近的位点荧光标记的颜色不同，荧光颜色相同的位点片段相差较大。

2、复合扩增

根据实施例1中各微卫星位点的扩增情况，并结合上述复合扩增引物挑选依据进行不同位点的组合，2对引物组合、3对引物组合、4对引物组合依次递增至10对引物组合；在随着组合数目增加的情况下，下述PCR反应体系中各个组分同时进行微调，以求得出最适的反应体系。在保证扩增质量的同时摸索出扩增的最适退火温度和体系等。10对引物复合扩增具体条件如下：

PCR反应总体积为20μL，其中模板DNA(L62001-2提取的DNA)为100ng，10×buffer(含Mg2+，ABI)为2ul，dNTP终浓度为75μmol/L，各对引物终浓度见表5所示，2U金牌酶(ABI)，不足部分以双蒸水补足。

表5：复合扩增中各对引物的终浓度

PCR扩增程序是：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。在可分辨的情况下，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测；不允许的情况下，使用ABI3700测序仪进行检测。

3、基因分型

(1)PCR产物的变性

取各个样本复合扩增的PCR产物1ul，加到每孔含8.5ul的甲酰胺和内标的96孔板上(860ul甲酰胺加10ulGeneScanTM-500LIZTM，混匀，分装到96孔板上)，95℃变性5分钟，迅速放在冰上。待96孔板冷了后，用铝箔纸包好，4℃保存，备用。

(2)ABI3700测序仪检测

含变性后的PCR产物的96孔板，放入ABI3700 Genetic Analyzer内进行分析，原始峰图用GeneMarkerV1.5进行分析，确定特定位点各个体的峰形和大小，判定个体的基因型。图1是十个微卫星位点的复合扩增产物峰图，图2到图4分别为十个位点的蓝、绿、黑分颜色峰图。

(3)原始数据的校对

将ABI3700 Genetic Analyzer自动输出的数据与原始峰图逐一校对，判定微卫星座位的峰形，确定每一个个体的基因型，确保原始数据的准确无误。

(4)微卫星数据的分析

将十个位点经复合扩增得出的数据与实施例2的单重PCR扩增得到的数据比较，其结果完全一致。从而，证实了十重PCR的准确性与可行性。

二、对照组

将上述10个位点的引物对在PCR体系中的终浓度调整为等摩尔，其余条件不变。十个微卫星位点的复合扩增产物峰图如图5所示，绿色荧光引物位点(S0386、S0101)和黑色荧光引物位点(SW857、SW902、S0355)都扩增的较弱或者没有扩增出来。

Claims

1.一种用于猪微卫星标记的复合扩增的引物组合物，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成；其中，

引物对1由序列表中序列1所示的DNA和序列表中序列2所示的DNA组成；引物对2由序列表中序列3所示的DNA和序列表中序列4所示的DNA组成；引物对3由序列表中序列5所示的DNA和序列表中序列6所示的DNA组成；引物对4由序列表中序列7所示的DNA和序列表中序列8所示的DNA组成；引物对5由序列表中序列9所示的DNA和序列表中序列10所示的DNA组成；引物对6由序列表中序列11所示的DNA和序列表中序列12所示的DNA组成；引物对7由序列表中序列13所示的DNA和序列表中序列14所示的DNA组成；引物对8由序列表中序列15所示的DNA和序列表中序列16所示的DNA组成；引物对9由序列表中序列17所示的DNA和序列表中序列18所示的DNA组成；引物对10由序列表中序列19所示的DNA和序列表中序列20所示的DNA组成；

所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10的摩尔比是：5：1：4：3：7：4：3：4：5：4。

2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物中，每对引物对中的两条引物之间的摩尔比为1：1。

3.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于：所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10均单独包装或整体包装。

4.含有权利要求1-3中任一所述引物组合物的试剂盒。

5.一种猪微卫星标记的复合扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：用权利要求1-3中任一所述引物组合物进行PCR扩增。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增条件是：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述猪微卫星标记选自下述10个微卫星位点中的至少一个位点：SW240、SW951、SW857、S0155、S0386、SW902、S0101、S0225、S0227和S0355。

8.权利要求5-7中任一所述的方法在动物个体识别和/或亲子鉴定中的应用,所述动物为猪。