CN102146380A - 一个水稻条纹叶枯病抗性新基因（qStv10tq）的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个水稻条纹叶枯病抗性新基因qStv10^tq的分子标记，属于水稻抗病育种和分子遗传学领域。本发明实质是根据连锁分离规律，利用抗病亲本特青和感病亲本Lemont的双向导入系，通过连锁分析和关联分析等方法，定位第10染色体上的条纹叶枯病抗性新基因(qStv10^tq)，获得与之紧密连锁的基于PCR的实用经济型标记RGB10-1。将本发明应用于水稻条纹叶枯病抗性的辅助聚合育种和抗性基因轮替，能够获得新的抗性资源，防止过度使用Stvbⁱ可能出现的抗性过早丧失问题；获得抗性更好的qStv10^tq与Stvbⁱ的聚合育种材料；通过基因型选择可以省去抗病性鉴定的步骤，提高育种效率，加快育种进程。

Description

一个水稻条纹叶枯病抗性新基因(qStv10^tq)的分子标记

技术领域

本发明涉及一个水稻条纹叶枯病抗性新基因qStv10^tq的分子标记，属于水稻抗病育种和分子遗传学领域，适用于在水稻抗病育种中引入新的抗性基因qStv10^tq，并利用分子标记对该基因进行条纹叶枯病的辅助选择育种和聚合育种。

背景技术

水稻条纹叶枯病是由水稻条纹病毒(Rice Stripe Virus，RSV)所引起的病毒病，以灰飞虱(Laodelplax striatellus)为主要的传播介体。此病害的主要症状是植株心叶沿叶脉出现褪绿短条斑，以后逐渐扩大并连片，危害严重时会出现假枯心和假白穗，从而导致作物减产(Toriyama，1986)。随着免耕、稻套麦、麦套稻等轻简型栽培技术以及感病高产品种的推广应用，加速了水稻条纹叶枯病的媒介灰飞虱带毒群体的扩大和为害。灰飞虱刺吸时间短、传毒持久，使治虫防病十分困难，利用分子标记进行培育抗病品种无疑是行之有效的手段。

随着抗源品种在育种计划中的运用，在部分病区开始有了缓解的势头。扬州大学的潘学彪课题组在精细定位的基础上，对前人报道的条纹叶枯病抗性基因位点进行比较发现，目前生产上所用抗源品种(如镇稻88)的抗性均来自位于第11染色体上的Stvbⁱ等位基因。根据我们对专利数据库的搜索，目前申请的条纹叶枯病抗病基因的标记专利均是围绕这个位点进行的。这个从一个侧面说明，目前抗条纹叶枯病育种存在抗病基因单一的隐患。我们知道，病毒有着基因组小且变异快的特点，单靠一个基因想要获得持久抗性是十分困难的，因此我们在抗病育种中需要有足够的预见性和前瞻性。只有挖掘新的抗性基因并引入育种实践，通过不同抗性基因的聚合或者轮换使用，才能实现对该病毒病害长期有效的防治。

对于控制复杂性状的基因定位效果受到所用研究群体的极大影响。前人研究所用的初级定位群体大多为F₂及其衍生的重组自交家系，虽然能够最大程度的保留遗传变异，但是由于遗传背景复杂，因此使得一些重要的位点往往表现成为数量性状位点，而且获得的连锁标记距离较远。在条纹叶枯病的研究中同样存在这样的现象，例如对位于第11染色体长臂上的Stvbⁱ，在不同研究者的结果中表现为大小差异较大的染色体区间。这样的结果只有通过利用片段导入系这样的群体才能进一步的明确。中国农科院作物科学研究所的黎志康课题组培育了来自抗病亲本特青和感病亲本Lemont的双向导入系，遗传背景分别接近特青和Lemont，携带有较少的导入片段，可以用于对复杂性状进行较为精确的遗传分析。本发明将其用于条纹叶枯病的鉴定，结果发现了一个位于第10染色体上的抗性新基因位点(qStv10^tq)，其解释的遗传变异与Stvbⁱ接近，而且获得的遗传标记与该位点的距离仅有0.7cM，有望用于新基因的标记辅助选择育种。已知的Stvbⁱ也在同一群体中被定位在RM209-RM229的较小区间内，而且与RM229的遗传距离仅为0.8cM，应证了前人的结果。

发明内容

(一)技术问题

本发明针对上述研究背景，利用抗病亲本特青和感病亲本Lemont的双向导入系，通过连锁分析，定位第10染色体上的条纹叶枯病抗性新基因(qStv10^tq)，获得与之紧密连锁的基于PCR的实用经济型标记RGB10-1，该标记可以有效的进行抗性基因型的辅助选择，主要应用于条纹叶枯病的聚合育种和抗性基因轮替。

(二)技术方案

条纹叶枯病抗性新基因的分子标记方法，其特征在于：

用一对特异扩增水稻位于第10染色体上抗条纹叶枯病新基因(qStv10^tq)标记的引物RGB10-1，其中正向引物序列为：CTGGCCATTAGTCCTTGG；反向引物序列为：GCTTGCGGCTCTGCTTAC，共同扩增育种材料的基因组DNA，如果RGB10-1的引物能够扩增出与特青大小类似(150bp左右)的片段，那么推测该品种很可能含有qStv10^tq抗性等位基因。

(三)有益效果

通过本发明鉴定到第10染色体上的条纹叶枯病抗性新基因(qStv10^tq)以及可对其进行基因型鉴别的共显性分子标记。

本发明与现有技术相比具有以下优点及效果：

1.由于qStv10^tq是与Stvbⁱ不同的基因位点，因此能够有效的防止过度使用单一抗性基因(Stvbⁱ)而可能出现的对病毒选择压力过大而导致抗性的过早丧失。

2.通过新基因标记的筛选，能够获得以往单一通过Stvbⁱ标记筛选而遗漏的有利抗性资源。

3.另一方面，qStv10^tq与Stvbⁱ之间存在显著的累加效应，因此还能够进行两个基因的聚合育种，获得抗性更好的育种材料。

4.本发明的分子标记可用于条纹叶枯病抗性新基因的分子标记聚合育种和抗性基因轮替，由于可以进行基因型选择，可以省去抗病性鉴定的过程，提高育种效率。

附图说明

图124份地方品种的SSR标记RGB10-1的PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳的带型图谱及其对应的条纹叶枯病抗感表型(1-24为地方品种；M为DNA Ladder；Lemont为感病亲本；特青为抗病亲本；a为200bp，b为100bp)。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。其中所用方法如无特别说明均为常规方法。

(一)条纹叶枯病抗性新基因的完备复合区间定位

1.供试材料

利用源自美国的长粒粳稻Lemont与来自中国广东的短粒籼稻特青构建杂交组合，将Lemont/Teqing的F1杂交后代分别与Lemont和特青连续回交3-4代，产生一系列的随机导入系。最终共获得遗传稳定的Lemont背景导入系201份，特青背景导入系252份。

2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳

参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各株系的代表单株分别混合提取基因组DNA。根据参考图谱，选取均匀分布于全基因组的142个SSR标记，合成引物。以各个株系的基因组DNA为模板进行，聚合酶链式(PCR)反应。PCR反应的产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，溴化乙啶染色后，在凝胶成像系统下成像。参考双亲的扩增条带，对后代株系的带型进行判别记录。

3.完备区间作图分析

根据后代株系的扩增条带所表示的基因型，将其对应的条纹叶枯病调查的结果作为表型值，输入由中国农业科学院作物科学研究所王建康课题组所发展的完备区间作图软件(ICIMapping V3.0，免费软件)，进行数据分析，获得与条纹叶枯病抗性相关的候选区间及相关标记。

筛选效应较大的主效基因位点。我们共获得了三个效应较大的主效基因，分别位于第9、10和11染色体。同时考虑到分子辅助选择所用标记的实用性，我们淘汰了与标记连锁距离较远的第9染色体位点(距离最近的标记尚有9.8cM)；保留下来的两个位点中，位于第11染色体的位点与RM229的距离仅为0.8cM，比较前人的研究结果，发现是已知的Stvbⁱ基因，而RM229正是目前用于该基因辅助育种选择的分子标记之一；另外一个位于第10染色体上的位点与RGB10-1的距离仅为0.7cM，该染色体上目前尚未有任何已知的条纹叶枯病抗性基因位点或者QTL被报道。

(二)单标记验证和极端亚群体分析

根据初步定位到的两个主效区间侧翼标记，进行单标记回归分析，验证上述标记位点的效应。结果如表1所示。

表1在Lemont/特青双向回交导入系群体中定位到的两个主效位点的紧密连锁标记效应。

在Lemont背景株系中，根据鉴定到的两个标记RGB10-1和RM229的基因型，对Lemont背景的株系进行分类。通过比较不同类群间的条纹叶枯病表型差异，验证上述紧密连锁标记的功效。结果发现特青的基因型在RGB10-1与RM229上分别单独存在时(AB或BA)，株系的抗性表现相近，但都比不携带的(AA)要显著抗病；而二者共同存在的株系(BB)抗性更强，说明两个基因有累加效应(表2)。

表2Lemont背景导入系根据RGB10-1与RM229基因型划分后的条纹叶枯病表型。带不同的上标的病穴率均值间有显著差异。

(三)对水稻品种资源的标记基因型分析

1.供试材料

120份来自全国各个主要稻作区的地方品种。另加入特青和Lemont作为抗感对照。

2.DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳

参照上述株系基因组DNA的提取方法和PCR扩增方法，提取120份地方品种的基因组DNA并利用新主效基因(qStv10^tq)的紧密连锁标记RGB10-1以及Stvbⁱ紧密连锁标记RM229分别进行PCR扩增。考虑到上述标记扩增产物的多态性较好，因此对地方品种的PCR产物我们采用更为经济实用的琼脂糖凝胶电泳进行分离(附图1)。

3.基于等位基因频率的关联分析

利用关联分析的常用免费软件Tassel V3.0，对120份地方品种以条纹叶枯病病穴率为表型值与RGB10-1与RM229的基因型进行通用线性模型(GLM)进行关联分析。结果发现RGB10-1和RM229均显著与条纹叶枯病的表型关联，分别解释120地方品种变异的26.6％和32.1％(表3)，可以用于从地方品种中挖掘新的条纹叶枯病抗性资源，并进行抗性新基因(qStv10^tq)的标记辅助育种。

表3RGB10-1(qStv10^tq)与RM229(Stvbⁱ)在120份地方品种中的关联分析结果

上述实施不以任何形式限定本发明。

Claims (2)

1.条纹叶枯病抗性新基因(qStv10^tq)分子标记方法，其特征在于：以Lemont/特青双向回交导入系为作图群体，通过抗病性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，在第10染色体上获得与抗条纹叶枯病新基因(qStv10^tq)紧密连锁的SSR标记RGB10-1。

2.按照权利1所获得一种与Lemont/特青双向回交导入系中第10染色体上抗条纹叶枯病新基因(qStv10^tq)连锁分子标记的应用，其特征在于以感病品种(Lemont)为背景的抗病品种(特青)导入系以及地方品种为对象，通过RGB10-1标记的带型数据，预测其由qStv10^tq抗性等位基因所控制的条纹叶枯病抗性。

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