CN102144992B

CN102144992B - 苯基甘氨酸衍生物制备对金黄色葡萄球菌有抑菌和杀菌活性的抗菌剂的用途

Info

Publication number: CN102144992B
Application number: CN 201110056801
Authority: CN
Inventors: 徐伟亮; 吴坚
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-03-10
Filing date: 2011-03-10
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2031-03-10
Also published as: CN102144992A

Abstract

本发明发现苯基甘氨酸衍生物对金黄色葡萄球菌的抑菌和杀菌活性。本发明涉及的苯基甘氨酸衍生物为：对-二甲基氨基苯基甘氨酸、间甲基苯基甘氨酸、间溴苯基甘氨酸、对氯苯基甘氨酸、邻溴苯基甘氨酸。苯基甘氨酸衍生物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为62.5~125mg/L；最小杀菌浓度（MBC）为125~250mg/L。

Description

苯基甘氨酸衍生物制备对金黄色葡萄球菌有抑菌和杀菌活性的抗菌剂的用途

技术领域

本发明通过合成化学药物，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系，更具体的说，是合成苯基甘氨酸衍生物，探索苯基甘氨酸衍生物对金黄色葡萄球菌的抑菌和杀菌活性。

背景技术

氨基酸类化合物因其对人类和环境安全，大量的研究表明氨基酸衍生物具有明显的抑菌药理作用，因此，近几十年来研究和发现有药理作用的氨基酸衍生物引起了许多研究者和开发者的兴趣。例如，2，3-二羟基喹喔啉-6-磺酰氨基酸的衍生物对一些病原微生物，如蜡状芽孢杆菌(B．cereus)和产朊假丝酵母(Candidautilis)都有抑菌活性[El-Naggar，J．Serb. Chem.Soc.，1986,51(9-10)：441-447]。例如，1992年Ibrahim等合成的3-氯苯并噻吩-2-羰基氨基酸及其甲酯和酰肼衍生物对各种病原微生物都有杀灭活性[lbrahim，Asian J．Chem.，1992，4(4)：909-16]。1993年Ibrahim等合成的4-硝基噻吩-2-磺酰基氨基酸及其甲酯和酰肼衍生物中，脯氨酸甲酯和甲硫氨酸甲酯的衍生物具有较高的抑菌活性[Ibrahim，Bol. Soc. Quim. Peru，1993，59(3)：135]。又例如不少研究中发现氨基酸的Sehif碱具有杀菌、抑菌活性[1.Lumme P，Elo H. Inorganica Chimca Acta,1984,92:241。2. Aminabhavi T M, Biradar N S，Patil S B，et al.Inorg.Chim.Acta.,1995,107：231]。席晓岚试验发现N-（4-硝基苄基）甘氨酸亚胺（一种席夫碱）对红色毛癣菌和孢子丝菌有较强的抑菌作用，对白色念珠菌在较高浓度时才有抑菌活性．溶剂二甲亚砜无抑菌作用[席晓岚等，西南师范大学学报(自然科学版)，1999，24(1),46]。祝振富合成了胡椒醛甘氨酸钾（一种席夫碱盐），抑菌试验结果表明，该席夫碱盐具有抑制铜绿假单胞菌、大肠埃希氏杆菌和金黄色葡萄球菌生长的活性[祝振富, 西南师范大学学报(自然科学版) 1997年,22(1),50]。刘芳报道了参照GB15979-2002(-次性使用卫生标准)中的溶出性抑菌产品抑菌性能实验方法，发现N-邻羟苄基氨基酸类化合物质量分数为0.05％时，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为100％，对白色念珠菌有较强的抑菌活性，对大肠杆菌有一定的抑菌活性。但苯环上引入溴原子对目标化合物的抑菌活性影响不明显[刘芳, 应用化学,，2010, 27（1）,12]。

羟甲基甘氨酸钠对常见细菌、霉菌、酵母菌的抑制作用较强, 研究结果表明, 羟甲基甘氨酸钠对大肠杆菌最低抑菌浓度为1.90g/L, 对枯草杆菌的最低抑菌浓度为2.00g/L, 对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为1.90g/L,（陈红梅, 食品科技,2008,1,117）。凌关庭报道甘氨酸有抑菌能力，能防止微生物在鱼糜制品的表面产生粘液，对枯草杆菌和大肠杆菌均有较强的抑菌能力。聚赖氨酸（一种白色链霉菌培养而得的天然食品添加剂）对革兰氏阳性和阴性菌均有效。如对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及酵母、乳酸菌等的繁殖均有抑制作用(凌关庭, 粮食与油脂，2000，5，44)。

从上可见，氨基酸的衍生物具有明显的药理作用，氨基酸作为有抑菌活性的化合物是值得进一步研究的，特别是化合物结构比较简单的甘氨酸衍生物引起了我们很大的研究兴趣。

发明内容

本发明选用苯基甘氨酸衍生物为对象，采用体外抗菌试验，研究这些化合物对革兰氏阳性菌的代表--金黄色葡萄球菌（ATCC25925）的生物活性。

本发明的具体技术方案如下：

本发明的创新点是苯基甘氨酸衍生物对金黄色葡萄球菌有抑菌和杀菌活性。

苯基甘氨酸衍生物可用作抗菌剂，所述的苯基甘氨酸衍生物为：对-二甲基氨基苯基甘氨酸、间甲基苯基甘氨酸、间溴苯基甘氨酸、对氯苯基甘氨酸、邻溴苯基甘氨酸，苯基甘氨酸衍生物的结构特征如下图所示：

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本发明所述的苯基甘氨酸衍生物：对-二甲基氨基苯基甘氨酸、间甲基苯基甘氨酸、间溴苯基甘氨酸、对氯苯基甘氨酸、邻溴苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为62.5~125 mg/L；最小杀菌浓度（MBC）为125~250 mg/L，所述的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的范围内，其抗菌活性特征体现所用的溶剂是蒸馏水、低浓度的HCl水溶液、低浓度的乙醇水溶液、低浓度的甲醇水溶液中的任一种。

在本发明的技术方案中，测定苯基甘氨酸衍生物杀菌活性的杀菌试验中，定义只能抑制金黄色葡萄球菌生长，不能杀死金黄色葡萄球菌，抑菌药物被除去，金黄色葡萄球菌又可以恢复继续生长的苯基甘氨酸衍生物的最小物质量为最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration简称MIC）；定义能杀死金黄色葡萄球菌，杀菌药物除去后，金黄色葡萄球菌仍然不能生长的苯基甘氨酸衍生物的最小物质量为最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration简称MBC）。

本发明采用苯基甘氨酸衍生物有苯基甘氨酸、间甲基苯基甘氨酸、对-二甲基氨基苯基甘氨酸、邻溴苯基甘氨酸、间溴苯基甘氨酸、对溴苯基甘氨酸、间氯苯基甘氨酸、对氯苯基甘氨酸、间硝基苯基甘氨酸、对硝基苯基甘氨酸。

本发明采用金黄色葡萄球菌（ATCC25925）菌种购自于杭州市卫生防疫站；菌种培养基：水解酪蛋白琼脂，MH肉汤培养基购自浙江省军区后勤部卫生防疫站检验所。

本发明试验抗菌化合物溶解度的方法：因需样品在溶剂中完全溶解才能进行抑菌或杀菌实验，故准确称取各样品2mg，用体积为4mL的相应溶剂溶解，配成药物浓度为500ppm(500mg/L)，确定样品的溶解情况。此实验所用的溶剂根据样品的性质，溶解性不同而有所不同：先试验用蒸馏水作溶剂，若不溶，则依次试验用低浓度的HCl水溶液、乙醇水溶液溶解，最后试验用低浓度的甲醇水溶液。经试验来确定样品在进行抑菌或杀菌实验时的所用的溶解溶剂。

本发明革兰氏阳性球菌--金黄色葡萄球菌菌液的接种培养方法如下：取10mL肉汤培养液两管，高压蒸汽灭菌消毒10～15min，冷却，在无菌条件下，即在酒精灯火焰附近，用接种环对金黄色葡萄球菌进行接种操作，35～37℃温箱培养13小时，即可得本实验所需的菌液。

本发明体外抗菌活性的测定：用试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）。每管加被检细菌液体培养物稀释液[菌液浓度约105cfu/mL（每毫升样品中含有的细菌群落总数）]1滴，于35～37℃培养24小时，判读结果，含药物量最少而无细菌生长的浓度即为最小抑菌浓度（MIC）。即从试管中药物浓度1000mg/L开始，经试管二倍稀释法，最后稀释至62.5mg/L（见表1）。用试管二倍稀释法测定时，测试药物溶剂的选择见表1。由于所测药物需统一比较，因此选用0.1MHC水溶液作溶剂。个别化合物在0.1MHCl或0.5MHCl中仍无最佳溶解度, 则改用15%或20%乙醇水溶液溶解。同时选该溶剂做空白试验。

最小杀菌浓度（MBC）的测定：测出MIC后在无菌条件下，从无细菌生长的各管吸取0.1mL液传种于MH琼脂培养基表面皿，35～37℃培养18小时，培养皿上细菌生长数小于5的最小稀释度的药物浓度即为最小杀菌浓度（MBC）。

表1：试管二倍稀释法各管药物浓度所对应的溶剂浓度

HCl水溶液本身对大肠杆菌有一定抗菌活性，因此本发明需HCl水溶液作为对照，实验发现HCl水溶液的最小抑菌浓度（MIC）为0.05mol/L（以下实施例中，采用HCl水溶液作为溶剂时活性相同），即溶解药物的溶剂浓度在0.05mol/L以下，若有抑菌作用，则应为药物的抑菌作用。最小杀菌浓度（MBC）为0.1 mol/L（以下实施例中，采用HCl水溶液作为溶剂时活性相同），即溶解药物的溶剂浓度在0.1mol/L以下，若有杀菌作用，则应为药物的杀菌作用。

乙醇水溶液本身对大肠杆菌有一定抗菌活性，因此需乙醇水溶液作为对照，实验发现乙醇水溶液（v/v）的最小抑菌浓度（MIC）为3.75%（以下实施例中，采用乙醇水溶液作为溶剂时活性相同），即溶解药物的溶剂浓度在3.75%以下，若有抑菌作用，则应为药物的抑菌作用。最小杀菌浓度（MBC）为15%（以下实施例中，采用乙醇水溶液作为溶剂时活性相同），即溶解药物的溶剂浓度在15%以下，若有杀菌作用，则应为药物的杀菌作用。

本发明筛选实验发现部分苯基甘氨酸衍生物对金黄色葡萄球菌有抑菌和杀菌活性。对二甲基氨基苯基甘氨酸、间甲基苯基甘氨酸、间溴苯基甘氨酸、对金黄色葡萄球菌有抗菌活性。在乙醇水溶液中，试验结果类似。对氯苯基甘氨酸和邻溴苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌均有抗菌活性。

本发明发现抑菌活性间甲基苯基甘氨酸、对氯苯基甘氨酸、邻溴苯基甘氨酸比对-二甲基氨基苯基甘氨酸、间溴苯基甘氨酸大；杀菌活性间溴苯基甘氨酸最大；苯基甘氨酸、对溴苯基甘氨酸、间氯苯基甘氨酸、间硝基苯基甘氨酸、对硝基苯基甘氨酸基本上无抗金黄色葡萄球菌活性。

具体实施方式

实施例1

按发明内容中所述的抗菌化合物溶解方法、体外抗菌活性的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的方法，测定对-二甲基氨基苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

实验发现对-二甲基氨基苯基甘氨酸最小抑菌浓度（MIC）为250 mg/L（作为溶剂的HCl水溶液浓度此时为0.025 mol/L），最小杀菌浓度（MBC）为500 mg/L（作为溶剂的HCl水溶液浓度此时为0.05 mol/L），因此，对-二甲基氨基苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌有抗菌活性。

实施例2

按发明内容中所述的抗菌化合物溶解方法、体外抗菌活性的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的方法，测定间甲基苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

实验发现间甲基苯基甘氨酸最小抑菌浓度（MIC）为125 mg/L（作为溶剂的HCl水溶液浓度此时为0.025 mol/L），最小杀菌浓度（MBC）为500 mg/L（作为溶剂的HCl水溶液浓度此时为0.05 mol/L），因此，间甲基苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌有抗菌活性。

实施例3

按发明内容中所述的抗菌化合物溶解方法、体外抗菌活性的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的方法，测定间溴苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

实验发现间溴苯基甘氨酸最小抑菌浓度（MIC）为250 mg/L（作为溶剂的HCl水溶液浓度此时为0.025 mol/L），最小杀菌浓度（MBC）为250 mg/L（作为溶剂的HCl水溶液浓度此时为0.05 mol/L），因此，间溴苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌有抗菌活性。

实施例4

按发明内容中所述的抗菌化合物溶解方法、体外抗菌活性的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的方法，测定对氯苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

实验发现对氯苯基甘氨酸最小抑菌浓度（MIC）为125 mg/L（作为溶剂的乙醇水溶液（v/v）此时为1.875%），最小杀菌浓度（MBC）为500 mg/L（作为溶剂的乙醇水溶液（v/v）此时为7.5%），因此，对氯苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌有抗菌活性。

实施例5

按发明内容中所述的抗菌化合物溶解方法、体外抗菌活性的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的方法，测定邻溴苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。

实验发现邻溴苯基甘氨酸最小抑菌浓度（MIC）为125 mg/L（作为溶剂的乙醇水溶液（v/v）此时为2.5%），最小杀菌浓度（MBC）为500 mg/L（作为溶剂的乙醇水溶液（v/v）此时为10%），因此，邻溴苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌有抗菌活性。

Claims

1.苯基甘氨酸衍生物在制备对金黄色葡萄球菌有抑菌和杀菌活性的抗菌剂的用途，其特征在于，苯基甘氨酸衍生物可用作抗菌剂，所述的苯基甘氨酸衍生物为：对-二甲基氨基苯基甘氨酸、间甲基苯基甘氨酸、间溴苯基甘氨酸、对氯苯基甘氨酸、邻溴苯基甘氨酸，苯基甘氨酸衍生物的结构特征如下图所示：

2.根据权利要求1所述的苯基甘氨酸衍生物在制备对金黄色葡萄球菌有抑菌和杀菌活性的抗菌剂的用途，其特征在于，苯基甘氨酸衍生物：对-二甲基氨基苯基甘氨酸、间甲基苯基甘氨酸、间溴苯基甘氨酸、对氯苯基甘氨酸、邻溴苯基甘氨酸对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为62.5~125mg/L；最小杀菌浓度(MBC)为125~250mg/L。

3.根据权利要求2所述的苯基甘氨酸衍生物在制备对金黄色葡萄球菌有抑菌和杀菌活性的抗菌剂的用途，其特征在于，所述的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的范围内，其抗菌活性特征体现所用的溶剂是蒸馏水。