CN102127564A - Ngal质粒构建及其融合蛋白的表达 - Google Patents
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Abstract
一种NGAL质粒构建及其融合蛋白的表达，其特征是(1)PCR扩增NGAL的cDNA；(2)PCR产物与载体pET28a连接，构建重组质粒pET28a-NGAL；(3)重组质粒pET28a-NGAL转化大肠杆菌Rosetta DE3，IPTG诱导蛋白表达，得到NGAL融合蛋白。本发明通过PCR扩增、连接、转化与筛选，证实未加IPTG诱导前，没有融合蛋白的表达，IPTG诱导后3小时可获得高效表达NGAL融合蛋白，该蛋白质可用于筛选或抗NGAL蛋白质的抗体。表达的重组NGAL蛋白还可用于寻找有治疗价值的能抑制或激活NGAL功能的蛋白质分子。
Description
技术领域
本发明涉及NGAL蛋白，特别是涉及质粒构建及其融合蛋白的表达方法。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)是Kjeldsen等人于1993年在中性粒细胞的特殊颗粒中首先发现的，正常表达于中性粒细胞、肝实质细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等。进一步研究表明NGAL不仅在乳腺癌、食管癌、结直肠癌、胃癌、慢性粒细胞性白血病等细胞系中过表达，并在癌细胞的浸润与不良分化中发挥重要的作用。研究证实NGAL可通过捕获细菌分泌结合了铁的小分子铁螯合物，部分阻断细菌的铁摄取、抑制细菌生长、参与抗微生物的固有免疫应答。在一些炎症性疾病中，NGAL表达上调，是一种急性期反应蛋白。尤其是NGAL与肾脏的一些炎症性疾病相关，是诊断急性肾损伤的重要生物学指标，对判断与监测病情变化有显著的意义。越来越多的证据也表明血液和尿液中NGAL的测定可成为判断急性肾损伤的预测性生物学标志物。因此，制备NGAL融合蛋白对深入研究NGAL的功能及其临床诊断的应用具有重要的意义。
NGAL基因全长5369bp，其中包括1695bp的5端非转录区，178bp的3′端非转录区，定位于染色体9q34，由7个外显子和六个内含构成，属单拷贝，蛋白编码总长度591bp，为197个氨基酸残基编码，包括成熟肽段178年氨基酸残基和前导序列19个氨基酸残基。成熟NGAL蛋白能够以单体、同源二聚体或MMP-9(matrix metalloproteinase 9)以二硫键形成异源二聚体等多种形式存在。目前，重组蛋白主要是通过大肠杆菌融合表达并进行亲和层析纯化而获得，但是在本申请之前，没有人公开或发表过本发明的人型NGAL蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的与人疾病相关的中性粒细胞明胶酶脂质运载蛋白及其制备和应用。
1、重组质粒的构建与高效转化菌株的筛选
根据基因结构及载体的克隆位点，利用引物设计软件设计引物，扩增NGAL cDNA片段。然后，将扩增片段与pET28a空载体连接，构建表达载体pET28a-NGAL，转化大肠杆菌Rosetta DE3后提取质粒进行双酶切鉴定及载体测序引物进行测序。将测序结果和pET28a载体多克隆位点及NGAL基因的ORF序列进行同源比较，验证重组质粒pET28a-NGAL克隆正确。
挑选阳性菌落在LB液体培养基中培养，IPTG诱导表达，将未诱导的原核NGAL蛋白为参照物，通过对诱导前、后的表达产物进行SDS-PAGE电泳及western blot筛选出高效表达NGAL蛋白。
2、融合蛋白的诱导表达与纯化
(1)将高效NGAL重组菌株在LB培养基中扩大培养，IPTG诱导蛋白表达，离心收集菌液。
(2)细菌沉淀用BindingBuffer(无尿素，20mM咪唑)悬浮，反复冻融破碎细胞，加Lysozyme至1mg/ml，冰上孵育1h，4℃、10000rpm、20min，取上清，将沉淀用变性的BindingBuffer(8M尿素)悬浮，然后室温摇动30min，再对上清和尿素悬浮的沉淀进行SDS-PAGE，分析目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中。沉淀经50g/L积层胶，150g/L分离胶进行SDS-PAGE，倒积层胶时不插梳子，让积层胶的顶端和玻璃板的顶端之间有1cm的距离(便于大量上样)，电泳完毕后，用预冷的0.25mol/L的KCL溶液染色5-10min，参照同样条件下用考马斯亮蓝R250染色的凝胶，仔细辨认融合蛋白条带后，用洁净的手术刀片切下目的蛋白所在的凝胶块，用PBS洗3次后，将凝胶块切成0.1-0.3mm左右的小颗粒，加入适量PBS反复冻融3-4次，再4℃浸泡过夜，使目的蛋白释放到溶液中，10000r/min离心5min收集上清液，用120g/L的SDS-PAGE对纯化效果进行鉴定见图6，bardford测蛋白浓度，置-20℃保存。
本发明通过PCR扩增、连接、转化与筛选，证实未加IPTG诱导前，没有融合蛋白的表达，IPTG诱导后3小时可获得高效表达NGAL融合蛋白。该蛋白质可用于筛选或抗NGAL蛋白质的抗体。表达的重组NGAL蛋白还可用于寻找有治疗价值的能抑制或激活NGAL功能的蛋白质分子。
附图说明
图1为pET28a载体结构图；
图2为琼脂糖凝胶电泳鉴定NGAL基因PCR产物电泳图；
图3为琼脂糖凝胶电泳鉴定重组表达载体pET28a-NGAL及双酶切电泳图：
图4为SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况；
图5为western blot评估不同时间段NGAL融合蛋白表达产量的电泳图；
图6为蛋白纯化图。
其中图2(1)为DNA标准DL2000；图2(2)为NGAL的PCR产物。图3(1)为DNA标准DL2000；图3(2)为pET28a-NGAL重组质粒；图3(3)为HindIII和BamH I双酶切重组质粒。图4(1)为蛋白相对分子质量标准；图4(2)未诱导的pET28a-NGAL；图4(3)为IPTG诱导表达的pET28a-NGAL的总蛋白；图4(4)为IPTG诱导表达的pET28a-NGAL上清；图4(5)为IPTG诱导表达的pET28a-NGAL沉淀。图5(1)为IPTG诱导1h的融合蛋白；图5(2)为IPTG诱导2h的融合蛋白；图5(3)为IPTG诱导3h的融合蛋白；图5(4)为未加IPTG诱导。图6(1)为蛋白相对分子质量标准；图6(2)为IPTG诱导3h pET28a-NGAL的总蛋白；图6(3)为纯化的NGAL融合蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1。重组质粒的构建
1、扩增NGAL cDNA片段
以人白血病细胞K562cDNA为模板，用下列引物扩增：
P1：5′-TAGAAAGCTTCACTCAGCCGTCGATACAC-3′，
P2：5′-ATAGGGATCCGAAATCATGCCCCTAGGTC-3′；
PCR引物两端分别引入HindIII和BamH I酶切位点(下划线标记)，斜体部分为酶切位点前加的保护碱基，25ul的PCR反应体系成分为2×PCR mix12.5ul，pET28a-NGAL 1ul，P1 1ul，P2 1ul，PCRwater9.5ul。PCR反应条件为：94℃5min预变性；94℃变性50s，59℃退火45s，72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸7min。反应结束后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，见图2
2、构建重组pET28a-NGAL表达载体
将纯化的PCR产物和载体pET28a-vector用Hind III、BamH I双酶切后，分别回收酶切产物。在T4 DNA连接酶作用下定向将NGAL基因片段与pET28a-vector连接。连接反应：PCR产物3ul，pET28a空载体1ul，2×ligation buffer 5ul，T4ligase 1ul.混匀后16℃连接过夜，转化大肠杆菌Rosetta DE3感受态细胞和铺LB(kna)板，挑选单克隆接种5ml含有30ug/ml的卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养(220rpm/min)15h，碱裂解法提取质粒并进Hind III和BamH I双酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳鉴定重组表达载体pET28a-NGAL见图3.所获得的pET28a-NGAL重组子进行测序，并进行BLAST分析，确认序列的正确性。
3、筛选高效表达的融合蛋白
将测序正确的NGAL重组质粒转化大肠杆菌Rosetta DE3中，挑选含有表达质粒Rosetta DE3单个菌落接至5ml含有30ug/mL卡那霉素的LB培养基中摇菌过夜，37℃、220r/min，以1∶100转接到新鲜的含30ug/mL卡那霉素的LB培养基。于37℃培养至A600＝0.4-0.6时，取出1mL菌液做对照，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达。共诱导24h，分别于诱导2h、3h、4h、6h、10h、24h离心收集菌体。SDS-PAGE分析蛋白表达情况，western blot证实不同时间段表达量的不同见图5。离心前取2ml以备总蛋白电泳分析。
实施例2。pET28a-NGAL融合蛋白的诱导表达及纯化
从上述LB平板挑取经western blot鉴定为高表达的重组克隆接种于5ml含有30ug/mL卡那霉素的LB培养基中摇菌过夜，37℃、220r/min，以1∶100转接到新鲜的含30ug/mL卡那霉素的LB培养基。于37℃培养至A600＝0.4-0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达3h，4℃、10000r/min、20min，彻底去上清，细菌沉淀用BindingBuffer(无尿素，20mM咪唑)悬浮反复冻融破碎细胞，加Lysozyme至1mg/ml，冰上孵育1h，4℃、10000rpm、20min，取上清，将沉淀用变性的BindingBuffer(8M尿素)悬浮，然后室温摇动30min，对上清和尿素悬浮的沉淀行SDS-PAGE，分析目的蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中，沉淀经50g/L积层胶，150g/L分离胶进行SDS-PAGE，倒积层胶时不插梳子，让积层胶的顶端和玻璃板的顶端之间有1cm的距离(便于大量上样)，电泳完毕后，用预冷的0.25mol/L的KCL溶液染色5-10min，参照同样条件下用考马斯亮蓝R250染色的凝胶，仔细辨认融合蛋白条带后，用洁净的手术刀片切下目的蛋白所在的凝胶块，用PBS洗3次后，将凝胶块切成0.1-0.3mm左右的小颗粒，加入适量PBS反复冻融3-4次，再4℃浸泡过夜，使目的蛋白释放到溶液中，10000r/min离心5min收集上清液，用120g/L的SDS-PAGE对纯化效果进行鉴定见图，bardford测蛋白浓度，置-20℃保存。
Claims (5)
1.一种NGAL原核表达质粒的构建，其特征：
(1)PCR扩增NGAL的cDNA；
(2)PCR产物与载体pET28a连接，构建重组质粒pET28a-NGAL；
(3)重组质粒pET28a-NGAL转化大肠杆菌Rosetta DE3，IPTG诱导蛋白表达，得到NGAL融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的NGAL为人源NGAL。
3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述PCR扩增的引物为：
P1：5′-TAGAAAGCTTCACTCAGCCGTCGATACAC-3′，
P2：5′-ATAGGGATCCGAAATCATGCCCCTAGGTC-3′。
4.一种利用权利要求1所述的重组表达生产NGAL融合蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)筛选高效表达的NGAL蛋白的菌落；
(2)将高效表达的重组菌落用LB培养基培养，IPTG诱导培养获得含有NGAL融合蛋白的菌液；
(3)离心，往沉淀中加入尿素去除包涵体、室温摇动、收集融合蛋白；
(4)SDS-PACE鉴定融合蛋白；
(5)切胶纯化融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于使用KCL对凝胶进行短暂染色，并参照同样条件下用考马斯亮蓝R250染色的凝胶，直接从聚丙烯酰胺凝胶上切割下含有NGAL的凝胶条带。
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