CN102127147A - 表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用，所述的模拟表位肽能够竞争性地结合抗EGFR的抗体，显示了模拟表位在生物学及结构上同自然表位相近。本发明的模拟表位肽有利于在动物体内大量产生特异性抗体，克服了天然肽表位免疫原性低下、不能产生足够抗体的技术难题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)是一个分子量为170KD的酪氨酸激酶受体，它对于不同细胞的增殖和分化起着相当重要的作用。细胞的恶性转化和EGFR的信号通路的增强有着密切的联系。EGFR的信号通路的激活会促进细胞的增殖、肿瘤的侵袭、肿瘤内部的血管新生和肿瘤的转移。EGFR在许多上皮源性肿瘤中过表达，而且过表达的水平与患者的预后有着密切的联系。EGFR的过表达通常是由基因的扩增，亦或者是由于表皮生长因子突变引起的。最常见的EGFR的突变体是表皮生长因子受体III型变异体(EGFRvIII)，它主要缺失了编码序列第2外显子到第7外显子的801碱基，这直接导致了EGFR胞外区267个氨基酸的缺失，并在外显子连接处形成了一个新的甘氨酸。EGFRvIII在脑胶质瘤，乳腺癌，非小细胞肺癌和前列腺癌中可被检测到，在正常组织中不表达。
由于EGFR在癌症的发生发展过程有着重要的影响，因此针对EGFR的治疗方法也在不断的发展。mAb806单克隆抗体(Luwor RB等，Monoclonalantibody 806 inhibits the growth of tumor xenografts expressing either thede2-7 or amplified epidermal growth factor receptor(EGFR)but notwild-type EGFR.Cancer Res.2001；61(14)：5355-61.)能够较特异地识别过表达的EGFR和EGFRvIII，研究表明mAb806能够抑制过表达EGFR或表达EGFRvIII的细胞生长。临床I期研究表明，mAb806单抗的人鼠嵌合体CH806能够特异地靶向肿瘤组织(Scott AM等，A phase I clinical trialwith monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutantepidermal growth factor receptors.Proc Natl Acad Sci USA. 2007；104(10)：4071-6.)。mAb806单抗识别EGFR上的多肽序列为 287CGAD SYEMEEDGVRKC302(Johns TG等，Identification of the epitopefor the epidermal growth factor receptor-specific monoclonal antibody 806reveal s that it preferentially recognizes an untethered form of the receptor.JBiol Chem.2004 Jul 16；279(29)：30375-84.)。所以这段多肽序列有望作为疫苗。但是因为这段多肽在正常组织中就存在，如果直接用于人体，可能会因为免疫耐受难以产生相应的单抗，因此需要找到这段多肽的模拟表位肽(mimotope)，用于抗肿瘤疫苗的研制。本发明人在前期研究中筛选到了一个单克隆抗体12H23(国际专利申请号：PCT/CN2009/074090)，它能够识别EGFRvIII和过表达的EGFR，并且在体内体外实验中能够有效的抑制HuH7-EGFRvIII人肝癌细胞及SMMC-7721细胞的生长。研究发现该抗体的表位多肽序列也是287CGADSYEMEEDGVRKC302。
单克隆抗体应用于临床仍旧存在着一些限制，比如高昂的治疗费用，仍不够理想的疗效，来自鼠抗或嵌合抗体的副作用以及需要多次免疫才能产生足够的效价。如果用抗体结合位点的结构模拟多肽来免疫人体，使人体自身产生主动免疫，并能够持续产生抗体，就有可能解决单克隆抗体所不能解决的问题。模拟表位肽，在结构上同抗体结合表位类似，但氨基酸序列有可能是不同的，这样有利于在人体内大量产生针对该表位的抗体。因此，本领域迫切需要找到所述表位多肽的模拟表位肽，使其能够诱导产生主动免疫的疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用。
本发明的目的还在于提供一种具有免疫原性的物质及其应用。
本发明的目的还在于提供含有所述受体模拟表位肽或具有免疫原性的物质的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，所述的多肽是选自如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供一种具有免疫原性的物质，所述的物质连接有抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或者，所述的物质能表达出抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2 所示的氨基酸序列。
在一个优选例中，所述的具有免疫原性的物质是连接(偶联)有抗原的蛋白大分子。
在另一优选例中，所述的具有免疫原性的物质所述的具有免疫原性的物质包括：钥孔戚血蓝素；以及
偶联于所述钥孔戚血蓝素的抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗原包括：
如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；以及
与所述的多肽相连的连接肽，所述的连接肽具有1-20个(较佳地4-10个)氨基酸。
在另一优选例中，所述的连接肽位于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的羧基端。
在另一优选例中，所述的连接肽具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的多肽。
在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制备诱导抗体产生的的药物组合物，所述的抗体识别表皮生长因子受体。
在一个优选例中，所述的多肽用于制备预防或治疗肿瘤的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供所述的具有免疫原性的物质的用途，用于制备诱导抗体产生的的药物组合物，所述的抗体识别表皮生长因子受体。
在一个优选例中，所述的具有免疫原性的物质用于制备预防或治疗肿瘤或口腔扁平苔藓及白斑的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有：
有效量的一种或多种(2种)所述的多肽，或一种或多种(2种)所述的具有免疫原性的物质；和药学上可接受的载体。
在一个优选例中，所述的药物组合物是疫苗。
在另一优选例中，所述药物组合物还含有有效量的免疫佐剂。
在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中含有：一种或多种所述的多肽；或一种或多种所述的具有免疫原性的物质；或所述的药物组合物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了单抗12H23对富集后的噬菌体克隆的结合特异性分析。
其中，1、2、3为12H23与展示特定多肽序列的M13噬菌体克隆或野生型M 13噬菌体的结合情况，4为同型对照抗体与所述噬菌体克隆的结合情况，5为BSA与所述噬菌体克隆的结合情况。
图2显示了采用ELISA进行噬菌体竞争结合分析。
1为结合12H23(左)与对照IgG(右)的噬菌体与G-HCL的竞争结合情况；
2为结合12H23(左)与对照IgG(右)的噬菌体与N12-806的竞争结合情况；
3为结合12H23(左)与对照IgG(右)的噬菌体与S1-GFP的竞争结合情况；
4为结合12H23(左)与对照IgG(右)的噬菌体与cc16的竞争结合情况；
5为结合12H23(左)与对照IgG(右)的噬菌体与对照肽的竞争结合情况。
图3显示了ELISA分析合成多肽与12H23的结合效率。
其中，1为12H23抗体结合到合成多肽WHTEILKSYPHE-KLH；2为12H23抗体结合到合成多肽LPAFFVTNQTQD-KLH；3为12H23抗体结合到合成多肽对照肽-KLH；4为12H23抗体结合到KLH。
图4显示了Western blot检测抗多肽血清与EGFRvIII或EGFR过表达的细胞系的反应性。单克隆抗体12H23或模拟表位肽诱导的抗体(鼠血清中)与Huh7-EGFRvIII和A431细胞裂解蛋白的结合情况，EGFRvIII和EGFR分别可在130kDa和170kDa检测到(泳道1，阳性对照)，由WHTEILKSYPHE-KLH偶联物免疫的小鼠血清(泳道2)与细胞裂解蛋白在130kDa和170kDa产生条带，由LPAFFVTNQTQD-KLH偶联物免疫的小鼠血清(泳道3)与细胞裂解蛋白在130kDa和170kDa产生条带，由对照肽-KLH偶联物免疫的小鼠血清(泳道4)或单独由KLH免疫的小鼠血清(泳道5)没有条带。
图5显示了免疫荧光结果，所用血清或抗体分别为：A、用 WHTEILKSYPHE-KLH免疫后的小鼠血清；B、用LPAFFVTNQTQD-KLH免疫后的小鼠血清；C、对照多肽-KLH免疫后的血清；D、KLH免疫后的小鼠血清；E、12H23单抗。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示一种表皮生长因子受体的模拟表位肽。所述的模拟表位肽能够竞争性地结合抗EGFR的抗体(如12H23)，显示了模拟表位在生物学及结构上同自然表位相近。本发明的模拟表位肽有利于在动物体内大量产生特异性抗体，克服了天然肽表位免疫原性低下、不能产生足够抗体的技术难题。
如本文所用，所述的“模拟表位肽”是指具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽(如表1)或其衍生肽，其在生物学及结构上同表皮生长因子受体的自然表位287CGADSYEMEEDGVRKC302相近，具有诱导机体产生抗表皮生长因子受体的抗体的功能。所述的“模拟表位肽”在文中也简称为“本发明的表位肽”或“所述的表位肽”。本发明中，术语“多肽”、“蛋白”可互换使用。
表1
| 序列 | |
| SEQ ID NO：1 | WHTEILKSYPHE |
| SEQ ID NO：2 | LPAFFVTNQTQD |
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸和多肽如果与天然状态一起存在的其他物质分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的疫苗诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。
如本文所用，“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以产生特异性抗表皮生长因子受体的抗体；或防止或抑制由表皮生长因子受体过度表达所导致的疾病。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂或稀释剂。
如本文所用，“有效量”或“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
本发明的模拟表位肽及其编码基因
单克隆抗体12H23已经被证实它的表位同国外的单克隆抗体806是基本相同的，能够识别表皮生长因子受体III型变异体(EGFRvIII)和过表达的表皮生长因子受体(EGFR)，并且在体内体外实验中能够有效地抑制HuH7-EGFRvIII人肝癌细胞和过表达EGFR的A431人肺癌细胞的增殖。然而单克隆抗体治疗在临床上的应用还存在着许多瓶颈，被动抗体免疫需要反复多次的免疫才能得到有效的效价解决这些问题的一个方法就是研发一种新的疫苗，通过用能够被抗体识别的模拟表位免疫小鼠，激发小鼠的主动免疫，使其自身产生生物学性质类似于12H23的抗体，从而起到靶向治疗的作用。本发明人用噬菌体文库对单克隆抗体12H23进行了筛选，通过酶联免疫法验证得到了2个模拟表位(序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示)均能够有效的结合单克隆抗体12H23。然后将这2个模拟多肽偶联大分子蛋白后免疫小鼠，评估免疫后小鼠血清中针对大分子蛋白，模拟表位和EGFRvIII和过表达的EGFR的抗体效价，并且实验结果证明血清中的抗体能够有效地识别上述抗原，以及HuH7-EGFRvIII人肝癌细胞和过表达EGFR的A431人肺癌细胞。实验结果证明本发明人成功从噬菌体文库中筛选到模拟表位。
本发明的模拟表位肽拥有自然表位类似的生物学及化学性质，因此在序列上相近，并且能被抗体识别。同时，这些筛选出来的肽段在空间结构上并不需要同自然表位完全相同，只需要拥有自然表位被抗体识别的功能。所述的模拟表位肽作为一个疫苗可解决被动免疫所带来的问题并且能成为一种治疗性或者预防性的新药。
在得知了本发明的模拟表位肽的氨基酸序列后，本领域技术人员可以方便地制备该表位肽，其可以是合成多肽、重组多肽。本发明的表位肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母和哺乳动物细胞)中产生。
本发明还包括所述模拟表位肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片断”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的模拟表位肽相同的生物学功能、结构或活性的多肽。本发明的模拟表位肽片断、衍生物和类似物可以是：(1)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(2)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(3)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(4)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(融合蛋白)。
所述模拟表位肽本身可作为疫苗免疫动物产生识别表皮生长因子受体的抗体；或者可与其它蛋白相连接形成融合蛋白，免疫动物以产生识别表皮生长因子受体的抗体；或者可与大分子相偶联构成具有免疫原性的物质；或者可被表达或展示在细胞表面或噬菌体外壳蛋白表面上，免疫动物以产生识别表皮生长因子受体的抗体。
本发明的模拟表位肽的一种用途是：作为药物预防或治疗表皮生长因子受体过度表达相关疾病。所述的疾病例如是肿瘤。
编码本发明的表位肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码本发明的表位肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明模拟表位肽有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。
本发明所述的多核苷酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。所述的重组法通常是将所述多核苷酸克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外还可以通过人工合成的方法来合成有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明表位肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含所述模拟表位肽的多核苷酸的载体，以及所述的载体或模拟表位肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术生产所述模拟表位肽的方法。
包含上述的编码所述的模拟表位肽的多核苷酸以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
所述的模拟表位肽可在细胞内表达、或分泌到细胞外。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
免疫原性物质
由于小分子的多肽容易导致机体产生免疫耐受，作为一个较佳的实施方式，将所述的模拟表位肽与大分子相连接。所述的大分子可以是(但不限于)：蛋白，有机物。
作为一种优选方式，本发明提供一种具有免疫原性的物质，该物质包含所述的模拟表位肽和蛋白大分子。较佳地，所述的蛋白大分子是钥孔戚血蓝素(KLH，其序列如SEQ ID NO：3)。作为一种免疫载体，KLH是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给偶联的半抗原的能力。
所述的模拟表位肽与蛋白大分子之间，通过化学键相连或相互偶联；所述的化学键是共价键或非共价键。
作为一种较佳的实施方式，所述的模拟表位肽与蛋白大分子之间相互偶联，一条蛋白大分子可与至少一条模拟表位肽相偶联。
作为一种实施方式，所述的模拟表位肽与蛋白大分子之间通过化学键相连；更佳的，所述的化学键是肽键。
作为本发明的优选方式，所述的具有免疫原性的物质包括：钥孔戚血蓝素 (KLH)和一条或多条模拟表位肽。在空间结构上，所述的钥孔戚血蓝素分子的表面上偶联模拟表位肽。
所述的模拟表位肽和蛋白大分子之间可以直接相连接(或偶联)，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-20个氨基酸；较佳地为4-10个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响所述的具有免疫原性的物质的免疫原性。较佳的，所述的连接肽是GGGGSC(SEQ ID NO：4)，通过末端半胱氨酸形成巯基偶联，将模拟表位肽连接于KLH。
在本发明的实施例中，在模拟表位肽的羧基末端偶联了连接肽，再与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联(一个KLH偶联有多条模拟表位肽)，用该偶联蛋白多次免疫小鼠后，取小鼠血清后ELISA检测效价，结果发现血清中的抗体不仅针对KLH，模拟表位，还针对N1N2-806与EGFRVIII。免疫印迹实验证明了血清中的抗体能够结合表达EGFRVIII的HuH7-EGFRvIII人肝癌细胞和过表达的EGFR的A431人肺癌细胞系。本发明人又做了上述细胞的免疫荧光实验，结果同免疫印迹实验结果一致。虽然在合成多肽结合实验中，合成的多肽LPAFFVTNQTQD同12H23的亲和力较低，但在免疫印迹与免疫荧光实验中，它所诱导产生的抗体的生物学特性与WHTEILKSYPHE并无不同，提示合成多肽与单克隆抗体12H23的亲和力同小鼠血清中的抗体与EGFRvIII和过表达的EGFR的亲和力并无正向关系。
组合物
本发明还提供了包含本发明的模拟表位肽或具有免疫原性的物质的组合物，特别是药物组合物，所述的组合物也包括疫苗。该组合物可用于诱导产生抗表皮生长因子受体的抗体。该组合物可用于预防或治疗表皮生长因子受体过度表达相关疾病，所述疾病包括(但不限于)：肿瘤、口腔扁平苔藓及白斑。
包含本发明的模拟表位肽或具有免疫原性的物质的组合物可以包含按表位肽或具有免疫原性的物质的实际用途所选用的缓冲剂或佐剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择合适的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》，第19版(1995)Mack Publishing Co.)。
可将本发明的组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、胶囊、透皮药物等。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。
当用作疫苗时，所述的疫苗可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体(vehicle)配制本发明的疫苗或药物。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体)。
另外，本发明的疫苗的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)弗氏佐剂；铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChemResearch In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter’s TiterMax佐剂(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(GerbuB iotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。
当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的模拟表位肽或具有免疫原性的物质施用于对象。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。采用疫苗组合物的形式时，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。
给予本发明组合物的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予本发明的模拟表位肽或具有免疫原性的物质，即模拟表位肽或具有免疫原性的物质的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗表皮生长因子受体过度表达导致的并发症。
在各疫苗剂份中所选用的模拟表位肽或具有免疫原性的物质的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，给予约0.01μg-10mg模拟表位肽或具有免疫原性的物质/kg体重，优选0.1μg-1mg模拟表位肽或具有免疫原性的物质/kg体重，更优选1μg-1mg模拟表位肽或具有免疫原性的物质/kg体重。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的模拟表位肽或具有 免疫原性的物质的免疫应答。
药盒
本发明还提供了一种防治表皮生长因子过度表达导致的疾病的药盒，其中含有本发明的模拟表位肽或具有免疫原性的物质、或含有所述模拟表位肽或具有免疫原性的物质的组合物。此外，为了方便给药，所述的药盒中还可含有注射用的针，免疫佐剂，和/或药学上可接受的载体，和/或使用说明书。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明获得了表皮生长因子受体的两个模拟表位肽，以这两个模拟表位肽作为疫苗免疫动物产生的抗体可以识别表皮生长因子受体。所述的模拟表位肽有利于在动物体内大量产生特异性抗体，克服了天然肽表位免疫原性低下、不能产生足够抗体的技术难题。
(2)被动免疫中最主要的问题就是抗体的半衰期短，需要反复免疫，本发明克服了这个难题，同时也解决了单克隆鼠抗免疫原性的问题。在将来的癌症治疗中，针对EGFRVIII和过表达的EGFR抗原特异性的主动免疫将会是一个新的选择。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1、细胞系的培养及蛋白质抽提
过表达EGFR的人肺癌细胞系A431(购自中国科学院)和经转染后表达EGFRvIII的人肝癌细胞系HuH7-EGFRvIII(参见Wang H等，Epidermal growthfactor receptor vIII enhances tumorigenicity and resistance to 5-fluorouracil inhuman hepatocellular carcinoma.Cancer Lett.2009；279(1)：30-8.)均用添加了10％胎牛血清(v/v)和1％青链霉素(v/v)的DMEM培养基(GIBCO，Grand Island，USA)进行培养。抽提细胞蛋白后，蛋白浓度用BCA蛋白检测试剂盒(BCA Protein Assay Kit；Pierce，Rockford，IL)进行测定，抽提后的细胞蛋白分装并保存在-80℃。
实施例2、用单克隆抗体12H23淘选PH.D-12噬菌体文库
PH.D-12噬菌体文库购自NEB生物公司。淘选基本上按照试剂盒所提供的操作手册进行，简要过程如下：用包被缓冲液0.1M NaHCO3(pH 8.6)稀释单克隆抗体12H23，并以终浓度100μg/ml包被96孔板，4℃孵育过夜。第二天，用TBST(50mM Tris，150mM NaCl，pH7.5包含0.1％Tween-20(v/v))洗涤10次后，加入300μl封闭液(0.1M NaHCO3pH 8.6，5mg/ml BSA)37℃孵育1小时。1小时后倾出封闭液，每孔加入10μl噬菌体原液(用TBST稀释至100μl，约1.5×1011个噬菌体)，37℃孵育1小时。1小时后倾出，用TBST洗涤10次，结合上的噬菌体用0.2M Glycine-HCl(G-HCL；pH2.2)，洗脱，并马上用1MTris-HCl(pH9.1)中和，梯度稀释洗脱的噬菌体在含四环素20μg/ml的LB平板上进行滴定，第二天观察克隆数。剩余的噬菌体感染50ml OD约为0.5的ER2738菌株(购自NEB)进行扩增，37℃剧烈震摇过夜。第二天用PEG/NaCl沉淀回收备用。噬菌体拯救效率按以下公式进行计算：拯救效率＝(洗脱噬菌体/投放噬菌体)×100％。
在第二第三轮的淘选过程中，包被的单克隆抗体12H23的浓度分别为10μg/ml和1μg/ml，所用的TBST浓度为0.2％和0.5％，其余步骤同上。
结果：经过3轮的筛选，能够与单克隆抗体12H23结合的噬菌体被成功地富集(表2)。
表2
| 筛选 轮次 | 包被的 12H23抗 体浓度 | Washing TBST(吐温 的浓度) | 加入的噬 菌体量 (pfu) | 淘洗后获得 的噬菌体量 (pfu) | 拯救效率 ％ |
| 1 | 100μg/ml | 0.1％ | 1.5×1011 | 7.9×104 | 5.26×10-7 |
| 2 | 10μg/ml | 0.2％ | 1.5×1011 | 6.0×105 | 4.0×10-6 |
| 3 | 1μg/ml | 0.5％ | 1.5×1011 | 2.1×107 | 1.4×10-4 |
实施例3、DNA测序
从平板上挑取20个噬菌体克隆震摇后，用AxyPrep小量质粒抽提试剂盒 (Axygen，uion city，USA)抽提单链DNA。定量后送至英骏公司(上海，中国)测序。结果，20个克隆中共有7个不同的插入序列，见表3。
表3、富集后的噬菌体克隆的测序结果(噬菌体展示的多肽序列)
| 克隆号 | 编码的多肽序列 | SEQ ID NO： |
| C001、C005、C007、C010、C012、C004 | DHARYPWLRPPA | 5 |
| C006、C008、C018、C013、C015 | WHTEILKSYPHE | 1 |
| C002、C011、C020 | LPAFFVTNQTQD | 2 |
| C009、C017、C019 | SHVDDLGLRPLT | 6 |
| C016 | LLADTTHHRPWT | 7 |
| C014 | N S PRLVHTNTHN | 8 |
| C003 | YWNASPSASGVI | 9 |
实施例4、特异性酶联免疫吸附试验
10μg/mL的单克隆抗体12H23和小鼠IgG 1同型对照(购自科亚，杭州，中国)。用包被缓冲液稀释后包被96孔微板，4℃孵育过夜。第二天用0.5％的TBST洗涤6次后，用含有5％奶粉的TBST进行封闭，37℃孵育1小时。投放扩增后的7个噬菌体克隆，噬菌体浓度梯度稀释，37℃孵育1小时。1∶1000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗(Pharmacia，New Jersey，USA)37℃孵育1小时。然后用ABTS(SIGMA，St.Louise，USA)显色，用酶标仪(BioRad module680，Hercules，USA)读取405nm处的吸收值。本实验重复3次。
结果：序列WHTEILKSYPHE和LPAFFVTNQTQD能成功地结合单克隆抗体12H23，见图1。
实施例5、噬菌体竞争结合实验
10μg/mL的单克隆抗体12H23和小鼠IgG1同型对照用包被缓冲液稀释后包被96孔微板，4℃孵育过夜。第二天用0.5％的TBST洗涤6次后，用含有5％奶粉的TBST进行封闭，37℃孵育1小时。序列(WHTEILKSYPHE，LPAFFVTNQTQD)与对照肽EQKLISEEDL(MYC标签，SEQ ID NO：10)经ELISA鉴定后每孔投放1011个噬菌体，37℃孵育1小时。然后用5种不同的洗脱剂(0.1M Glycine-Hcl pH 2.2，N1N2-806，S1-GFP，CC16或小鼠的免疫球蛋 白IgG1)竞争洗脱。其中N1N2-806为单克隆抗体806的结合表位与噬菌体pIII蛋白的N1N2结构域融合表达的产物(其序列为AETVESCLAKPHTENSFTNVWKDDKTLDRYANYEGCLWNATGVVVCTGDETQCYGTWVPIGLAIPENEGGGSEGGGSEGGGSEGGGTKPPEYGDTPIPGYTYINPLDGTYPPGTEQNPANPNPSLEESQPLNTFMFQNNRFRNRQGALTVYTGTVTQGTDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNGKFRDCAFHSGFNEDPFVCEYQGQSSDLPQPPVNAEFGGGSGGGSKLGVPFYSHSVRACGADSYEMEEDGVRKCKK，SEQ IDNO：11)；S1-GFP为EGFR的S1结构域与GFP蛋白融合表达(序列MGS SHHHHHHSSGLVPRGSHMMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIV，SEQ ID NO：12)；CC16为人工合成的单克隆抗体806的表位(CGADSYEMEEDGVRKC，SEQ ID NO：13)。然后按淘选时的滴定方法观察竞争洗脱的噬菌体数量，见图2。
实施例6、多肽的合成及交联
多肽WHTEILKSYPHE和LPAFFVTNQTQD与对照肽：EQKLISEEDL(MYC标签SEQ ID NO：14)由吉尔生化公司(上海，中国)进行合成。合成后在多肽的C末端通过一个Linker(GGGGSC，SEQ ID NO：4)与钥孔戚血蓝素(KLH，SIGMA，USA；序列DFGHSKKIRKNVHSLTAEEQNSLRRAMDDLQDDKTRGGFQQIAAFHGEPKWCPRPEAEKKFACCVHGMAVFPHWHRLLTVQGENALRKHGFTGGLPYWDWTRPMSALPHFVADPTYDDSVSSLEEDNPYSHGHIDSVGHDTTRAVRDDLYQSPGFGHYTDIAKQVLLALEQDDFCDFEVQFEIAHNSIHALVGGNEPYGMSTLEYFLYDPIFFLHHSNTDRLWAIWQALQKYRGKPYNTANCAIVRHDTYRKPLQPFGLDSVINPDDETREHSVPRDVFNYKDDFNYEYESLNFNGLSIAQLDRELQRIKSHDRVFAGFLLHEIGQSALVKFYVCKHHVSDCDHYAGEFYILGDEAEMPFAYDRVYKYEISQALHDLDLHVGDNFHLKYEAFNL NGGSLGGVDLSQPSVIFEPAAGSHTA，SEQ ID NO：3)相偶联，获得合成多肽WHTEILKSYPHE-KLH，LPAFFVTNQTQD-KLH，对照肽-KLH。
实施例7、合成多肽结合实验
10μg/mL的合成多肽WHTEILKSYPHE-KLH，LPAFFVTNQTQD-KLH和阴性对照(MYC-KLH和KLH)用包被缓冲液稀释后包被96孔微板，4℃孵育过夜。第二天用0.5％的TBST洗涤6次后，用含有5％奶粉的TBST进行封闭，37℃孵育1小时。单克隆抗体12H23以不同的稀释梯度加入到每孔中，37℃孵育1小时。1∶1000稀释HRP标记的羊抗鼠抗体(科亚，杭州，中国)，37℃孵育1小时。然后用ABTS(SIGMA，St.Louise，USA)显色，用酶标仪(BioRadmodule 680，USA)读取405nm处的吸收值。本实验重复3次。
结果，噬菌体竞争实验证明了序列WHTEILKSYPHE和LPAFFVTNQTQD同单克隆抗体12H23的自然表位相似。N1N2-806，S1-GFP，CC16均能与序列WHTEILKSYPHE和LPAFFVTNQTQD竞争结合单克隆抗体12H23，见图3。
实施例8、多肽免疫
将BALB/c小鼠(上海市肿瘤研究所动物实验室，上海，中国)分成4组(WHTEILKSYPHE-KLH，LPAFFVTNQTQD-KLH，对照肽(MYC-KLH)和KLH，每组6只。BALB/c小鼠用腹膜下注射免疫上述各多肽，共免疫3次，三次免疫的剂量均为每只小鼠100μg，所用的佐剂为完全弗氏佐剂(第一次免疫)和不完全弗氏佐剂(第二、三次免疫)。每次免疫后7天取小鼠尾静脉血。三次免疫后将每组所有的血清样品混合，-20℃保存。
实施例9、抗体效价检测和免疫印迹实验
ELISA法检测经三次免疫后BALB/c小鼠的血清效价，血清按1∶500，1∶1500，1∶4500，1∶13500，1∶40500，1∶121500，1∶364500梯度稀释，观察是否产生针对KLH、合成多肽以及N1N2-806和EGFRvIII的效价。
A431和HuH7-EGFRvIII细胞裂解蛋白经10％的SDS-聚丙烯凝胶电泳后转到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜用含5％奶粉的PBS(迪申，上海，中国)37℃封闭1小时后，与单克隆抗体12H23和BALB/c小鼠血清(经WHTEILKSYPHE-KLH，LPAFFVTNQTQD-KLH，对照肽(MYC-KLH和 KLH)免疫后获取)分别37℃孵育2小时，单克隆抗体12H23用含5％奶粉的PBS 1∶100000稀释，小鼠血清用含5％奶粉的PBS 1∶1000稀释。后用1∶1000稀释HRP标记的羊抗鼠抗体(科亚，杭州，中国)37℃孵育1小时。然后用柯达胶片室温暗室曝光。
结果，小鼠经免疫后，血清中产生了针对KLH、合成多肽以及N1N2-806和EGFRVIII的抗体，其效价分别为1∶364500，1∶364500，1∶1500，1∶4500见表4。Western blot实验证明了血清中的抗体能够结合表达EGFRvIII的huh7-EGFRvIII人肝癌细胞，以及过表达EGFR的A431人肺癌细胞，证明本发明人成功找到了2个12H23单克隆抗体的模拟表位，见图4。
表4、多肽免疫后血清的抗体效价
实施例10、免疫荧光实验
将A431和HuH7-EGFRvIII细胞以每孔1×105细胞的密度种植于多孔板上(海蓝，海门，中国)，37℃、5％CO2过夜培养。第二天，用PBS清洗3次后，用4％(v/v)的多聚甲醛室温固定30分钟，用PBS清洗3次后，用10％(v/v)的羊血清37、℃封闭1小时。用单克隆抗体12H23和BALB/c小鼠血清(WHTEILKSYPHE-KLH，LPAFFVTNQTQD-KLH，对照肽(MYC-KLH和KLH)分别室温孵育2小时，单克隆抗体12H23和小鼠血清均用10％的羊血清稀释。后用1∶50稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠抗体(康成，上海，中国)和1∶2000稀释的4，6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)(罗氏，上海，中国)室温孵育45分钟，最后用荧光显微镜(奥林巴斯，上海，中国)观察荧光。
结果：免疫荧光实验证明了血清中的抗体能够结合表达EGFRvIII的Huh7-EGFRvIII人肝癌细胞，以及过表达EGFR的A431人肺癌细胞，证明本 发明人成功找到了2个12H23单克隆抗体的模拟表位，见图5。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海市肿瘤研究所
<120>表皮生长因子受体模拟表位肽及其应用
<130>100226
<160>14
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>多肽
<400>1
Trp His Thr Glu Ile Leu Lys Ser Tyr Pro His Glu
1 5 10
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>多肽
<400>2
Leu Pro Ala Phe Phe Val Thr Ash Gln Thr Gln Asp
1 5 10
<210>3
<211>420
<212>PRT
<213>Megathura crenulata
<400>3
Asp Phe Gly His Ser Lys Lys Ile Arg Lys Asn Val His Ser Leu Thr
1 5 10 15
Ala Glu Glu Gln Asn Ser Leu Arg Arg Ala Met Asp Asp Leu Gln Asp
20 25 30
Asp Lys Thr Arg Gly Gly Phe Gln Gln Ile Ala Ala Phe His Gly Glu
35 40 45
Pro Lys Trp Cys Pro Arg Pro Glu Ala Glu Lys Lys Phe Ala Cys Cys
50 55 60
Val His Gly Met Ala Val Phe Pro His Trp His Arg Leu Leu Thr Val
65 70 75 80
Gln Gly Glu Asn Ala Leu Arg Lys His Gly Phe Thr Gly Gly Leu Pro
85 90 95
Tyr Trp Asp Trp Thr Arg Pro Met Ser Ala Leu Pro His Phe Val Ala
100 105 110
Asp Pro Thr Tyr Asp Asp Ser Val Ser Ser Leu Glu Glu Asp Asn Pro
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Tyr Ser His Gly His Ile Asp Ser Val Gly His Asp Thr Thr Arg Ala
130 135 140
Val Arg Asp Asp Leu Tyr Gln Ser Pro Gly Phe Gly His Tyr Thr Asp
145 150 155 160
Ile Ala Lys Gln Val Leu Leu Ala Leu Glu Gln Asp Asp Phe Cys Asp
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Phe Glu Val Gln Phe Glu Ile Ala His Asn Ser Ile His Ala Leu Val
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Gly Gly Asn Glu Pro Tyr Gly Met Ser Thr Leu Glu Tyr Phe Leu Tyr
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Asp Pro Ile Phe Phe Leu His His Ser Asn Thr Asp Arg Leu Trp Ala
210 215 220
Ile Trp Gln Ala Leu Gln Lys Tyr Arg Gly Lys Pro Tyr Asn Thr Ala
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Asn Cys Ala Ile Val Arg His Asp Thr Tyr Arg Lys Pro Leu Gln Pro
245 250 255
Phe Gly Leu Asp Ser Val Ile Asn Pro Asp Asp Glu Thr Arg Glu His
260 265 270
Ser Val Pro Arg Asp Val Phe Asn Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Tyr Glu
275 280 285
Tyr Glu Ser Leu Asn Phe Asn Gly Leu Ser Ile Ala Gln Leu Asp Arg
290 295 300
Glu Leu Gln Arg Ile Lys Ser His Asp Arg Val Phe Ala Gly Phe Leu
305 310 315 320
Leu His Glu Ile Gly Gln Ser Ala Leu Val Lys Phe Tyr Val Cys Lys
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His His Val Ser Asp Cys Asp His Tyr Ala Gly Glu Phe Tyr Ile Leu
340 345 350
Gly Asp Glu Ala Glu Met Pro Phe Ala Tyr Asp Arg Val Tyr Lys Tyr
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Phe His Leu Lys Tyr Glu Ala Phe Asn Leu Asn Gly Gly Ser Leu Gly
385 390 395 400
Gly Val Asp Leu Ser Gln Pro Ser Val Ile Phe Glu Pro Ala Ala Gly
405 410 415
Ser His Thr Ala
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<223>多肽
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Gly Gly Gly Gly Ser Cys
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<223>多肽
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Ser His Val Asp Asp Leu Gly Leu Arg Pro Leu Thr
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<223>融合多肽
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Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro
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<223>融合多肽
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<223>多肽
<400>14
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
Claims (10)
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述的多肽是选自如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。
2.一种具有免疫原性的物质，其特征在于，所述的物质连接有抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或者，所述的物质能表达出抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的物质，其特征在于，所述的具有免疫原性的物质包括：
钥孔戚血蓝素；以及
偶联于所述钥孔戚血蓝素的抗原，所述的抗原含有SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的物质，其特征在于，所述的抗原包括：
如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；以及
与所述的多肽相连的连接肽，所述的连接肽具有1-20个氨基酸。
5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的多肽。
6.权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制备诱导抗体产生的的药物组合物，所述的抗体识别表皮生长因子受体。
7.权利要求2-4任一所述的具有免疫原性的物质的用途，其特征在于，用于制备诱导抗体产生的的药物组合物，所述的抗体识别表皮生长因子受体。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
有效量的一种或多种权利要求1所述的多肽，或一种或多种权利要求2-4任一所述的具有免疫原性的物质；和
药学上可接受的载体。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有有效量的免疫佐剂。
10.一种药盒，其特征在于，所述的药盒中含有：权利要求1所述的一种或多种多肽；或权利要求2-4任一所述的一种或多种具有免疫原性的物质；或权利要求8或9所述的药物组合物。
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