CN102125542A

CN102125542A - 阿魏酸在制备防治骨质疏松的药物的应用

Info

Publication number: CN102125542A
Application number: CN 201010569663
Authority: CN
Inventors: 李青南; 高建林; 陆幸妍; 卢丽; 陈珺; 杨国柱
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2010-12-02
Publication date: 2011-07-20

Abstract

本发明公开了阿魏酸在制备防治骨质疏松的药物的应用。本发明经研究发现，阿魏酸可以促进成骨细胞增殖、分化和矿化的作用，因此可以用于制备防治骨质疏松的药物。由于阿魏酸是当归的主要水溶性单提成分，因此药材来源充足、方便，用于制备防治骨质疏松具有广阔的应用前景。

Description

阿魏酸在制备防治骨质疏松的药物的应用

技术领域

本发明涉及中药提取物领域，具体涉及用于制备防治骨质疏松的药物的中药提取物阿魏酸。

背景技术

骨质疏松是以骨量低下、骨骼微结构破坏为特征，容易导致骨折的全身性疾病，是一种常见病、多发病，严重影响老年人健康和生活质量，是一世界范围的、主要的、不断增长的卫生和健康问题。随着全球人口的老龄化，骨质疏松已上升至常见病、多发病的第7位，目前全球患病人数超过两亿，我国患者约9000万。目前防治 OP 症西药有很多种，根据作用机制可分为两类，一是抑制骨吸收药物，主要有雌激素（estrogen）、降钙素（calcitonin）、二膦酸盐类（bisphosphonates）、异丙氧黄酮（ipriflavone）等；二是促骨形成药物，主要有骨矿化物(钙盐、维生素 D及其衍生物)、雄激素类（androgen）、生长激素（GH）、氟化物（fluoride）、蛋白同化激素（anabolic steroids）等。

雌激素一直作为防止妇女绝经后骨丢失的首选药物,具有降低骨吸收和促进骨形成两方面的作用，主要通过抑制骨吸收，再建骨代谢平衡，对绝经后骨质疏松症（PMO）有良好的治疗效果。尽管长期服用雌激素的绝经后妇女骨折发生率、冠心病发生率及老年性痴呆发生率均降低，对更年期综合征也有良好的预防作用，能防止泌尿生殖器官萎缩，但 HRT 的副作用是一个不容忽视的问题。美国经过3年对16600例妇女的前瞻性研究发现，雌激素替代疗法能使患者患中风和心脏病的概率增加60~85%，使乳腺癌的发病危险增加26%，并有可能导致卵巢癌。因此，2002年7月9 日美国国立卫生研究院（NIH）在美国果断叫停了激素替代疗法。其他类西药，比如钙剂及维生素 D类药物，临床常用的分为普通维生素D和活化骨三醇(罗钙全，rocaltrol)两种，两类制剂均可引起高钙血症和高钙尿症，且发生率较高。西药存在的副作用等局限性，限制了它们临床上的应用。

因此，选用毒副作用小、价格合理、标本兼治并可长期服用的中草药治疗成为国内医学界的研究热点。OP 属中医学“骨痿”、“骨痹” 、“腰背痛”范畴。早在《内经》时代就已经将肾与骨病紧密结合起来。中医理论认为，肾藏精，主生长、发育与生殖，在体为骨，主骨生髓。骨的生长发育，有赖于骨髓的充盈及其所提供的营养。肾中精气充盈，才能充养骨髓，正如《素问·四时刺逆从论》中说：“肾主身之骨髓”。小儿骨软无力，以及老年人的骨质脆弱，易于骨折等，都与肾中精气不足、骨髓空虚、骨失充养有关。现代医学研究表明，肾对钙、磷代谢具有调节作用，其调节机制是通过肾小管加强对钙的重吸收，并从尿内排出大量的磷，以维持血浆内钙、磷的动态平衡。这种排磷保钙的生理调节功能，可适应骨骼的生长发育和骨损伤修复的需要。当这种调节功能发生障碍时，可因体内钙的大量丢失、骨骼钙的不断减少，而导致骨质疏松。故肾对钙、磷代谢的调节功能直接影响着骨代谢，从而体现了与中医“肾主骨”理论的一致性。

中医“肾主骨”理论一直有力地指导着中医的临床实践。当前中医药治疗骨质疏松症多采用补肾填精为主，辅以健脾养血、活血化淤、祛风除湿、强筋壮骨诸法，已取得一定临床疗效，对由肾虚引起的一系列衰老症状也有一定程度的改善作用。当前应用的复方有护骨胶囊、骨愈灵胶囊、仙灵骨葆胶囊等，已经用于治疗的单味药有淫羊藿、黄芪、蛇床子、刺五加等。目前的研究中，骨矿含量(BMC)的微观测定，为研究中医“肾主骨”理论提供了客观指标；对肾虚实质的探讨，又充分说明了肾主骨功能与老年性骨病的关系，随着医学科学的不断发展，对“肾主骨”的认识也在不断地深化：目前研究报导认为骨质疏松症的病机是“多虚多瘀“，这与明代张景岳在《景岳全书》中认为：“元气败伤，则精虚不能灌溉，血虚不能营养者，亦不少矣。痿由内脏不足之所致，但不任用，亦无痛楚，此血气之虚也”的观点一致。考虑到老年病多虚多瘀的特点，肾虚是骨质疏松症的主要病机，脾为后天之本，气血生化之源，肾精依赖脾精的滋养才源源不断得以补充。若脾不运化，脾精不足，肾精乏源或肾精亏虚，骨骼失养，则骨骼脆弱无力，必致骨质疏松症的发生。脾虚是本病的重要病机，同时肾虚与血瘀互相促进，促进骨质疏松的进一步产生。因此在中医中药中寻找有效安全的药物，从健脾益气、活血通络的角度，发挥中药防治骨质疏松的作用，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

当归 Angelica sinensis (Oliv1) Diels是伞形科当归属的一种多年生草本植物。其干燥的贮藏根是我国一味常用的中药材，药用历史悠久，历代本草均有记载，始记于《神农本草经》谓之“当归味温，主呃逆上气”被列为中品，有补血、和血、调经止血、润肠滑肠之功效，为医家常用，素有“十方九归”之称。阿魏酸作为当归等中药所含的一种水溶性单提成分，是其主要活性物质之一，具有镇静，增加冠脉血流量，保护缺血心肌，抗血小板凝集等功能。目前阿魏酸及其钠盐对肌细胞、血细胞、视神经细胞活性影响的研究已有报道，但是尚没有关于阿魏酸作用于成骨细胞的报道。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的阿魏酸用途的局限性，提供一种阿魏酸的新用途。

本发明目的通过以下技术方案予以实现：

当归具有补血、活血、调经、润肠的功能，作为一种常用的补血活血中药，阿魏酸是其水溶性单提成分，具有药材来源充足、方便的优点。

本发明研究不同浓度阿魏酸对体外培养的成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响，以及对成骨细胞成骨相关基因表达的影响，为阿魏酸在防治骨质疏松中的应用提供依据，可得出阿魏酸能用于制备促进成骨细胞增殖、分化或矿化的药物或防治骨质疏松的药物。

当用阿魏酸能用于制备促进成骨细胞增殖、分化或矿化的药物或防治骨质疏松的药物时，所述阿魏酸的用量为7.8~500 mg/L，优选31.2mg/L。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过实验得知，阿魏酸7.8~500 mg/L四个浓度组与对照组比，均具有刺激成骨细胞增殖的作用，组间比较，只有500mg/L浓度组与其他组比较存在显著性增加（p<0.001）；同时在7.8~500 mg/L浓度内，阿魏酸可以提高ALP活性，四个浓度组中，除了31.2与125mg/L浓度之间没有差异外，其他各组间都存在显著性差异（p<0.001），随着浓度的增加，ALP增加；另外，茜素红染色显示，7.8~250 mg/L的阿魏酸可以增加钙化结节的数量（p<0.05），其中7.8组的数量最多；而到500 mg/L 浓度时，阿魏酸则不促进钙化结节的形成。RT-PCR的结果表明，阿魏酸在7.8~500 mg/L内还促进成骨相关指标Collagen-Ⅰ、AKP、Osteocalcin等基因的表达（p<0.05），但未见剂量依赖关系。

附图说明

图1为阿魏酸对成骨细胞增殖的促进作用，其中，与对照组比较，*,P<0.05,**, P<0.001；组间比较，a：P<0.05,A：P<0.001 VS 7.8; b：P<0.05,B：P<0.001 VS 31.2;C：P<0.001 VS 125;D：P<0.001 VS 500；

图2为阿魏酸对成骨细胞分化的促进作用，其中，与对照组比较，*,P<0.05,**, P<0.001；组间比较，A：P<0.001, VS 7.8; B：P<0.001 VS 31.2;C：P<0.001 VS 125; D：P<0.001 VS 500；

图3为阿魏酸对成骨细胞矿化的影响，其中，从左到右阿魏酸浓度依次为：0 mg/L、7.8 mg/L、31.2 mg/L、125 mg/L、500 mg/L；与对照组比较，7.8~250 mg/L的阿魏酸可以增加钙化结节的数量，其中7.8组的数量最多；而到500 mg/L 浓度时，钙化结节数量未见明显增加；

图4为阿魏酸对成骨分化标记的基因表达的影响；从上至下依次为：AKP组、Osteopontin组、CollagenⅠ组和β-actin组；从左至右阿魏酸浓度依次为：0 mg/L、7.8 mg/L、31.2 mg/L、125 mg/L、500 mg/L；与对照组比较，7.8~500 mg/L的阿魏酸可以促进成骨相关基因的表达；

图5为阿魏酸对成骨相关基因AKP表达的作用；

图6为阿魏酸对成骨相关基因Osteopontin表达的作用；

图7为阿魏酸对成骨相关基因CollagenⅠ表达的作用；

图8为阿魏酸对成骨细胞周期分布的影响，其中，与对照组比较，7.8~500 mg/L的阿魏酸可以增加成骨细胞G₂/M期百分含量。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

以新生SD乳鼠头盖骨原代培养的成骨细胞为研究对象，取第三代细胞进行药物实验，96孔板每孔加细胞100 μl，细胞密度为1×10⁴/mL，条件培养基（含地塞米松10^- 8mmol /L、维生素C 0.05 g/L、β-甘油磷酸钠 10 mmol /L）中含阿魏酸的终浓度分别为500、125、31.2、7.8 mg/L，各浓度组设三复孔，应用CCK-8法、碱性磷酸酶(AKP）法、茜素红染色方法观察阿魏酸对体外培养的成骨细胞的增殖、ALP表达及矿化结节形成的影响，同时应用RT-PCR检测成骨相关指标Collagen-Ⅰ、AKP、Osteopontin等的表达情况，流式细胞术检测阿魏酸对成骨细胞细胞周期分布的影响（图1~8）。

实验结果表明：（一）CCK-8试剂盒方法被广泛用于生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等，具有灵敏度高、检测快速、使用方便、对细胞毒性小等优点。试验结果表明在检测成骨细胞增殖作用中，阿魏酸7.8、31.2、125、500 mg/L四个浓度组与对照组比较，差异均具有统计学意义（P﹤0.05），组间比较，500mg/L组与其他浓度组存在显著性差异（p<0.01）。说明阿魏酸在7.8~500 mg/L浓度范围内具有促进成骨细胞增殖的功能。

（二）碱性磷酸酶（AKP）是成骨细胞分化的早期特异性标志之一，AKP活性的高低可以直接反应成骨细胞分化的程度。通过检测成骨细胞AKP的活性，我们发现阿魏酸7.8、31.2、125、500 mg/L四个浓度组与对照组比较，差异均具有统计学意义（P﹤0.05），表明阿魏酸在7.8~500 mg/L浓度范围内具有促进成骨细胞增殖的功能。

（三）钙化结节是成骨细胞分泌的胶原亲合钙盐而成，是成骨细胞分化成熟的重要标志。本研究中，我们通过茜素红染色法检测阿魏酸对成骨细胞矿化功能的影响，通过比较钙化结节形成的数量（如图3），可以发现在7.8~250 mg/L浓度范围内，阿魏酸可以促进成骨细胞矿化结节的形成，而到500 mg/L 浓度时，钙化结节数量未见明显增加，表明在7.8~250 mg/L浓度范围内阿魏酸可以促进成骨细胞的矿化。

（四）成骨细胞功能的改变伴随有相关基因表达状态的变化。CollagenⅠ、Osteopontin、AKP等基因与成骨细胞增殖、分化等的功能息息相关。本实验中，我们的研究表明阿魏酸在7.8~500 mg/L浓度范围内可以促进成骨细胞基因的表达。（五）细胞周期检测可以反映细胞的增殖状态，G2M期的百分比一定程度上可以定量反映细胞增殖状态。本实验中，流式细胞术检测细胞周期的结果表明，7.8~500 mg/L的阿魏酸具有促进成骨细胞增殖的功能。

Claims

1.阿魏酸在制备促进成骨细胞增殖、分化或矿化的药物中的应用。

2.阿魏酸在制备防治骨质疏松的药物的应用。

3.根据权利要求1或2所述的阿魏酸的应用，其特征在于所述阿魏酸的用量为7.8~500 mg/L。

4.根据权利要求3所述的阿魏酸的应用，其特征在于所述阿魏酸的用量为31.2mg/L。