CN102114415B - 一种蛋白质分子印迹整体柱的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白质分子印迹整体聚合物的制备方法。将适当配比的功能单体、交联剂和蛋白质模板分子配制成溶液,随后依次加入一定量的引发剂和增速剂。将上述混合物迅速注入液相色谱柱管后,放置于25℃左右环境中在24小时内完成聚合反应。用重量浓度为10%的十二烷基磺酸钠与体积浓度为10%的乙酸溶液洗脱模板蛋白质分子,即可制备大孔蛋白质分子印迹整体柱。本发明的优点为制备方法简单、可靠,制备的蛋白质分子印迹整体柱具有通透性好,流速快,机械强度好和较强的模扳分子识别特性,适合快速分离方面的应用。该技术为发展蛋白质分子印迹整体柱提供了一种新型制备方法。

Description

一种蛋白质分子印迹整体柱的制备方法
技术领域
本发明涉及液相色谱柱的制备,具体地说是一种新型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法。
背景技术
分子印迹(molecular imprinting)是近年来基于分子识别机理发展起来的一种对特定分子(模板分子或印迹分子)具有选择性的聚合物合成技术。通常被描述为制造识别“分子钥匙”的人工“锁”的技术。例如在非共价型分子印迹中通常以目标分子为模板,通过氢键、静电作用、疏水作用等作用,将该分子与可聚合的功能单体进行组装,并于交联剂发生聚合反应。反应结束后除去印迹分子,即可在聚合物中形成功能基团精确排布的孔穴。该孔穴与印迹分子的形状、大小、电荷分布具有互补性。因此,制备的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer,MIP)对印迹分子具有良好的选择性。目前,以小分子为印迹分子制备的MIP已广泛应用于色谱填料、人工受体、模拟酶、催化剂以及传感器等领域。
分子印迹整体柱目前主要以小分子为主,而大分子分子印迹整体柱的制备很少见主要是因为为了保证较好的识别效果,一般采用凝胶材料,交联度都比较低,机械强度和耐用性较差(Liao,J.L.,Wang,Y.,Hjertén,S.,Chromatographia 1996,42,259-262;Hjertén,S.,Liao,J.L.,Nakazato,K.,Wang,Y.et al.,Chromatographia 1997,44,227-234;Bereli,N.,Andac,M.,Baydemir,G.,Say,R.,Galaev,I.Y.,Denizli,A.,Journal of Chromatography A,2008,1190,18-26.)。一般只用作层析柱,很难应用于高压液相色谱系统,而且存在流速低,处理过程耗时的缺点,局限了使用范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高交联度蛋白质印迹整体柱的制备方法,保持较好识别特性的同时,以期解决在制备蛋白质印迹整体柱时,机械强度不高的关键问题。该发明以常温缓冲溶液为溶剂,溶解模板蛋白质、功能单体、交联剂以及引发剂;致孔剂为硫酸铵,来保证蛋白质印迹材料的的通透性。当聚合反应完成后,用水冲洗,硫酸铵融化,聚合物内部即可形成多孔网状结构。这些孔道不仅具有很高的比表面,而且内表面上印迹的蛋白质非常易于从孔道中洗脱。通过该方法即可获得具有较大吸附容量的蛋白质印迹聚合物,从而实现蛋白质在色谱固定相上的识别分离。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种蛋白质分子印迹整体柱的制备方法,
1).磷酸盐缓冲液中所添加的各组分的最终重量浓度为:模板蛋白0.8~1.6%,功能单体9.0~11.0%,交联剂10.0~15.0%,硫酸铵7.0~8.0%;
2).通入氮气除氧后加入模板分子,然后加入引发剂过硫酸铵和增速剂N,N,N`,N`-四甲基乙二胺,缓冲溶液中引发剂的重量浓度为0.04~0.08%,增速剂的重量浓度为0.03~0.05%;混合均匀后迅速注入液相色谱柱管中,放入20-30℃环境中聚合12小时以上;
3).聚合反应结束后,用含有重量浓度9-11%十二烷基磺酸钠的体积浓度为9-11%乙酸混合液洗脱聚合物上的模板蛋白,获得大孔蛋白质分子印迹整体柱。
得到的蛋白质分子印迹整体柱再用蒸馏水反复冲洗,至流出液pH值为7;最后,用pH=4.5~7.5磷酸盐缓冲液冲洗柱子至色谱基线平衡即可使用。
所述模板分子为细胞色素C。硫酸铵为致孔剂来保证蛋白质印迹材料的的通透性。
所述功能单体为甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸,磷酸盐缓冲液中还含有重量浓度为0.1~0.4%的甲基丙烯酸;交联剂为哌嗪二丙烯酰胺;反应体系为水相,引发方式为自由基引发;所述磷酸盐缓冲液pH=4.5~7.5。
所述制备的蛋白质分子印迹整体柱交联度高(制备的蛋白质印迹材料交联度在70%以上),机械强度高,具有良好的通透性和选择性,可用于蛋白质的分离;
本发明的优点为:
(1)采用硫酸铵为聚合反应的致孔剂,不需要加入其它致孔剂;(2)制备的蛋白质印迹聚合物具有大孔结构;(3)蛋白质印迹整体柱交联度高,机械强度较好,可用于高效液相色谱系统;(4)制备的蛋白质印迹整体聚合物具有较快的传质速率和较强的分子识别特性;(5)制备过程简单,合成成本低。
附图说明
图1.细胞色素C蛋白印迹整体柱的扫描电镜图,(×5000)。
图2.空白印迹整体柱对细胞色素C和溶菌酶混合溶液的分离效果;图中CYC指细胞色素C;LYZ指溶菌酶;
图3.细胞色素C蛋白印迹整体柱对细胞色素C和溶菌酶混合溶液的分离效果;图中从左到右分别是溶菌酶和细胞色素C。
具体实施方式
实施例1
选用重量浓度为10.0%的甲基丙烯酰胺与0.4%的甲基丙烯酸为功能单体,以及硫酸铵8.0%,与重量浓度为15.0%的交联剂哌嗪二丙烯酰胺共同溶于10mM的磷酸盐缓冲溶液(pH7.5)中。通入氮气除去其中溶解的氧气后加入重量浓度为0.16%的模板蛋白质分子细胞色素C。加入重量浓度为0.08%的引发剂过硫酸铵和重量浓度0.05%的增速剂N,N,N`,N`-四甲基乙二胺。混合均匀后迅速注入液相色谱柱中,并放置在25℃下反应24小时。
以上各物质的重量浓度均为它们在缓冲溶液中的终浓度。
空白对照物,非分子印迹聚合物(NIP)的制备,除不加模板蛋白质分子外,其他步骤同上,得空白印迹整体柱。
按照以上所述的用量制备整体柱后,用重量浓度10%十二烷基磺酸钠和体积浓度10%乙酸混合溶液洗脱聚合物上的模板蛋白,可得大孔的整体印迹柱;接着用水、pH4.5~7.5磷酸盐缓冲液冲洗柱子至基线平衡即可使用(如图1所示)。
得到的蛋白质分子印迹整体柱对模板蛋白有特异性结合的能力,可以做为色谱柱在高效液相色谱系统中使用。在高效液相色谱系统中使用时流速不高于0.3mL/min,压力不超过4Mpa。
图2.空白印迹整体柱对细胞色素C和溶菌酶混合溶液的分离效果;图中CYC指细胞色素C;LYZ指溶菌酶;
图3.细胞色素C蛋白印迹整体柱对细胞色素C和溶菌酶混合溶液的分离效果;图中从左到右分别是溶菌酶和细胞色素C;
可以看到空白印迹整体柱上细胞色素C和溶菌酶混合溶液不能得到很好的分离。而在蛋白印迹整体柱上,细胞色素C和溶菌酶混合溶液能得到很好的分离。这表明蛋白质分子印迹整体柱对模板分子具有较好的选择性识别能力。
实施例2
选用重量浓度为9.0%的甲基丙烯酰胺与0.3%的甲基丙烯酸为功能单体,以及硫酸铵8.0%,与重量浓度为15.0%的交联剂哌嗪二丙烯酰胺共同溶于10mM的磷酸盐缓冲溶液(pH7.3)中。通入氮气除去其中溶解的氧气后加入重量浓度为0.8%的模板蛋白质分子细胞色素C。加入重量浓度为0.04%的引发剂过硫酸铵和重量浓度0.03%的增速剂N,N,N`,N`-四甲基乙二胺。混合均匀后迅速注入液相色谱柱中,并放置在26℃下反应24小时。
以上各物质的重量浓度均为它们在缓冲溶液中的终浓度。
空白对照物,非分子印迹聚合物(NIP)的制备,除不加模板蛋白质分子外,其他步骤同上,得空白印迹整体柱。
按照以上所述的用量制备整体柱后,用重量浓度11%十二烷基磺酸钠和体积浓度11%乙酸混合溶液洗脱聚合物上的模板蛋白,可得大孔的整体印迹柱;接着用水、pH4.5~7.5磷酸盐缓冲液冲洗柱子至基线平衡即可使用。
本发明的优点为制备方法简单、可靠,制备的蛋白质分子印迹整体柱具有通透性好,流速快,机械强度好和较强的模扳分子识别特性,适合快速分离方面的应用。该技术为发展蛋白质分子印迹整体柱提供了一种新型制备方法。

Claims (7)

1.一种蛋白质分子印迹整体柱的制备方法,其特征在于:
1).磷酸盐缓冲液中所添加的各组分的最终重量浓度为:模板蛋白0.8~1.6%,功能单体9.0~11.0%,交联剂10.0~15.0%,硫酸铵7.0~8.0%;
2).通入氮气除氧后加入模板分子,然后加入引发剂过硫酸铵和增速剂N,N,N`,N`-四甲基乙二胺,缓冲溶液中引发剂的重量浓度为0.04~0.08%,增速剂的重量浓度为0.03~0.05%;混合均匀后迅速注入液相色谱柱管中,放入20-30℃环境中聚合12小时以上;
3).聚合反应结束后,用含有重量浓度9-11%十二烷基磺酸钠的体积浓度为9-11%乙酸混合液洗脱聚合物上的模板蛋白,获得大孔蛋白质分子印迹整体柱。
2.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述模板蛋白为细胞色素C。
3.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述功能单体为甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸,磷酸盐缓冲液中还含有重量浓度为0.1~0.4%的甲基丙烯酸。
4.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述交联剂为哌嗪二丙烯酰胺;反应体系为水相,引发方式为自由基引发。
5.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述磷酸盐缓冲液pH=4.5~7.5。
6.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:制备得到的蛋白质分子印迹整体柱用十二烷基磺酸钠和乙酸混合溶液冲洗后、再用蒸馏水反复冲洗,至流出液pH值为7。
7.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述获得大孔蛋白质分子印迹整体柱用pH=4.5~7.5磷酸盐缓冲液冲洗柱子至色谱基线平衡即可使用。
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